首页 > 文献资料
-
重组结核分枝杆菌PPE17蛋白原核可溶性表达纯化和血清学诊断研究
目的 利用原核系统可溶性表达结核分枝杆菌PPE17蛋白并进行纯化,研究其免疫学特性,并评价该重组蛋白在结核病血清学诊断方面的价值.方法 从结核分枝杆菌H37Rv基因组中利用PCR扩增PPE17核酸序列然后克隆至融合表达载体pET-DsbC中,转入大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,用Western Blot和EL ISA方法进行抗原性初步评价.结果 融合蛋白Ds-bC-PPE17在原核系统内经IPTG诱导表达后,主要以可溶性形式表达存在,经镍柱层析获得了纯的重组蛋白,纯度达95％以上.Western Blot和EL ISA方法结果证明重组DsbC-PPE17蛋白具有较强的抗原活性.用纯化的PPE17蛋白做抗原,临床诊断结核病人血清,阳性率达60％.结论 融合蛋白DsbC-PPE17在大肠埃希菌中以可溶性表达形式存在,高纯度的重组融合蛋白有可能成为结核病的血清学诊断抗原.
-
入源中和性抗甲型肝炎病毒抗体Fab段基因的序列分析及可溶性表达
在用噬菌体表面呈现系统获得人源抗甲型肝炎(甲肝)病毒中和性基因工程Fab抗体的基础上,对所获得的4株中和性Fab抗体轻重链可变区基因进行了序列分析、可溶性表达及生物学特性鉴定.4株Fab抗体重链可变区拥有99%同源的核苷酸序列和相同的CDR区氨基酸序列,属于VHⅢ基因家族.而轻链可变区核苷酸序列同源性为95%和相似的CDR区氨基酸序列,属于VL5基因家族.这些重组抗体都能与人甲肝恢复期血清及具有中和活性的鼠抗甲肝单克隆抗体产生竞争抑制反应,表明其针对甲肝病毒结构蛋白上的主要抗原决定簇.
-
流行性感冒病毒M2蛋白可溶性表达及其免疫原性的研究
流行性感冒(流感)病毒的M2蛋白是其保护性抗原之一,在几乎所有甲型流感病毒中高度保守,因此可以用来研究具有交叉保护能力的流感疫苗.然而M2分子在病毒颗粒中含量非常少,用从病毒中纯化的方法很难获得足够的免疫原.在原核表达时发现,M2蛋白对宿主菌具有很强的毒性作用,导致其死亡,因此很难获得高表达.在本研究中,采用RT-PCR方法从病毒感染的MDCK细胞中克隆了A1/PR/8/34毒株的M2基因,然后通过基因工程手段缺失了M2蛋白的跨膜区26～55位氨基酸的编码序列,将其克隆到pET-32a中,与硫氧还蛋白融合,在大肠杆菌中获得了高效表达,并且表达产物以可溶形式存在,不形成包涵体.利用硫酸铵盐析结合金属离子鏊和柱亲和层析的方法纯化了表达的融合蛋白.免疫荧光实验表明,融合蛋白免疫小鼠后产生的抗血清能够与流感病毒感染的细胞发生特异性的结合,证明表达产物具有流感病毒M2蛋白的抗原性.
-
抗微小隐孢子虫TSP6蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
目的 在大肠埃希菌中可溶性表达微小隐孢子虫TSP6抗原分子,并以其纯化产物为抗原,利用杂交瘤技术生产抗TSP6单克隆抗体(McAb). 方法 将pGEX-4T-1-TSP6重组质粒转化大肠埃希菌BL21 (DE3),经0.1 mmol/LIPTG诱导表达后超声破菌,获得可溶性表达产物,通过Gluthathione-Sepharose 4B磁珠纯化蛋白质,以纯化的重组TSP6为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行细胞融合,用ELISA和有限稀释法筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及效价,Western blot分析其特异性. 结果 筛选出2株杂交瘤细胞能稳定分泌抗TSP6单克隆抗体,经鉴定均为IgG1.Western blot分析显示,制备的单抗均能与相应的重组蛋白特异性结合. 结论 制备的抗TSP6杂交瘤细胞株能分泌高特异性的McAb.
-
抗弓形虫重组SAG1抗原单克隆抗体的制备与鉴定
目的制备抗弓形虫SAG1单克隆抗体(McAb). 方法将pET32(a)-trSAG1重组质粒转化Escherichia coli BL21(DE3),用0.1 mmol/L IPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA一步法纯化,以纯化的rSAG1为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,Western blot分析其特异性. 结果筛选出能稳定分泌抗rSAG1单克隆抗体的5株杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1, 轻链均为κ链;Western blot 分析显示,5株单抗均能与弓形虫速殖子超声抗原中的天然SAG1发生特异性结合. 结论制备的抗rSAG1杂交瘤细胞株能分泌识别SAG1的高特异性单抗,为进一步研究其在弓形虫病免疫诊断中的应用奠定了基础.
-
包涵体变复性技术研究进展
现代生物技术的迅猛发展使大规模表达异源重组蛋白成为现实,这极大地促进了蛋白类产品的开发,尤其是重组蛋白药物的研发.目前非糖基化的重组蛋白表达多采用大肠杆菌的原核表达系统,该系统的突出特点是表达产物多以包涵体形式存在.与蛋白可溶性表达相比,包涵体具有产量高、蛋白稳定、容易纯化等优点,对毒性蛋白制备尤其适宜.因此,采用包涵体形式已成为规模制备重组蛋白产品的主要途径之一.
-
狂犬病病毒CTN株糖蛋白膜外区可溶性高效表达及纯化
目的 探索原核可溶性目的蛋白表达系统对狂犬病病毒糖蛋白膜外区(Ex-GP)进行高效制备及纯化的方法.方法 构建含有融合标签的狂犬病病毒糖蛋白膜外区表达质粒,筛选可溶性表达条件,采用亲和层析和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,以获得高效表达的可溶性目的蛋白.结果 成功建立应用原核表达系统高效制备重组可溶性狂犬病病毒糖蛋白膜外区蛋白的方法,获得的目的蛋白具有ELISA抗原活性,推测其构象与天然狂犬病病毒糖蛋白膜外区具有相似性.结论 本研究建立的目的蛋白高效制备方法,操作简便,表达量高,目的蛋白具有抗原性活性,适合目的蛋白规模制备,为深入研究狂犬病病毒糖蛋白生物学功能,解析糖蛋白结构,揭示狂犬病病毒致病机制及开展狂犬病诊断试剂的研发提供了思路.
-
乙脑病毒包膜蛋白可溶性表达及纯化
目的：通过原核表达载体对乙脑病毒包膜蛋白进行可溶性表达和纯化。方法筛选不同的表达载体、宿主菌株、表达条件，以获得可溶性的目的蛋白表达。采用镍柱和凝胶过滤层析对表达蛋白进行纯化。结果对不同的载体、菌株、表达条件筛选后，终发现PBCX载体与乙脑病毒包膜蛋白E406基因连接后的质粒，在低温诱导后获得可溶性E蛋白表达，且表达量较高。表达量占可溶性蛋白总量的23％。通过镍柱和凝胶过滤层析纯化后，目的蛋白纯度较高，达85％，满足试验需求。结论本研究获得了可溶性表达的乙脑病毒E蛋白，方法简单高效，为深入研究该蛋白生物学特性和功能，解析乙脑病毒的致病机制、乙脑减毒活疫苗毒株的减毒机制及其质量控制，乙脑诊断试剂开发，奠定了技术基础。
-
抗肝癌人源化Diabody在大肠杆菌中的可溶性表达及活性鉴定
目的:构建人源化抗肝癌双价抗体,并实现其在大肠杆菌中的可洛性表达.方法:缩短人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的连接肽为5肽,构建(hscFv25)2基因,克隆入原核表达载体后,转化入大肠杆菌表达,并纯化目的蛋白,细胞ELISA、免疫组织化学法检测其生物活性.结果:目的基因在大肠杆菌中得到了可洛性表达,纯化蛋白的相对亲和力比亲本抗体提高了10倍左右,对肝癌组织切片的免疫组织化学染色呈强阳性,阳性率为75%.结论:成功制备了人源化抗肝癌双价抗体,该抗体具有较高的亲和力,为进一步的临床研究奠定了基础.
-
抗肝癌人源化单链抗体hscFv25的体外亲和力成熟
目的:提高人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的亲和力.方法:设计并合成人源化抗肝癌单链抗体hscFv25重链及轻链CDR3的半随机突变引物,构建突变体抗体库,竞争筛选亲和力更高的突变体抗体,对所得到的高亲和力的候选抗体,在大肠杆菌中进行可溶性表达,并采用细胞ELISA、细胞涂片免疫组织化学染色的方法,对该抗体进行初步的活性鉴定.结果:得到了3株候选高亲和力突变体抗体,其中的一株在大肠杆菌中获得了可溶性表达后,进一步的活性检测结果表明,该抗体的相对亲和力比亲本单链抗体提高了60倍左右,同时该抗体对肝癌细胞(SMMC-7721)的免疫组织化学染色呈强阳性,着色情况与亲本抗体相一致,而对正常肝细胞(HL-02)染色呈阴性.结论:成功地构建了人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的突变体抗体库,并筛选到了一株亲和力更高的突变体抗体.
-
幽门螺杆菌18000u外膜蛋白编码基因的克隆及表达
目的:构建含幽门螺杆菌(Hp)18000 u外膜蛋白编码基因的重组载体并在E.coli BL2l中表达.为Hp的疫苗开发、快速诊断试剂盒的研究奠定基础.方法:用PCR从Hp染色体中,扩增18000 u外膜蛋白编码基因片段.将目的基因与pET32a(+)同时经BamH I,HindⅢ双酶切、纯化、连接,转化含有目的基因的重组载体.以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE30)并表达.表达产物经纯化后,用ELISA法检测其抗原性.结果:经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hpl8000 u的外膜蛋白编码基因,与Tomb等报道相比较,有2%编码基因发生变异,1.7%氨基酸残基改变.经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白为38000 u,其中pET32a(+)表达的蛋白约为20000u,可溶性表达产物占全菌总蛋白的21.3%.重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上.ELISA法检测显示,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别,具有良好的抗原性.结论:成功地克隆并表达Hp18000 u的外膜蛋白编码基因,为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了基础.
-
人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆、表达及抗原性研究
目的:构建含人幽门螺杆菌(Hpylori)热休克蛋白A编码基因的重组载体、进行核甘酸序列分析,并在E. coliBL21中表达,研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础.方法:利用分子克隆技术从Hpylori DNA染色体中,扩增热休克蛋白A编码基因片段;将目的基因与载体pET32a(+)同时经kpnⅠ、BamH Ⅰ双酶切、纯化、连接后,转化含有目的基因的重组载体;以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE30)并表达;表达产物经纯化后,用Western blot法检测其抗原性.结果:经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hpylori热休克蛋白A编码基因,与GenBank报道的相比较,有1.6%的碱基(bp)发生变异,1.6%的氨基酸残基改变.经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白Mr为33×103,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103,可溶性表达产物占全菌总蛋白的18.96%.重组蛋白经Ni+-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上.用Westernblot方法检测显示,该重组蛋白可被Hpylori阳性患者的血清所识别,具有良好的抗原性.结论:成功地克隆并表达了H pylori热休克蛋白A码基因,为Hpylori蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础.
-
抗SSA表位特异性单链噬菌体抗体的可溶性表达及鉴定
目的 获得可溶性抗人SSA抗原表位特异性单链抗体(ScFv).方法 以赖氨酸为支架八倍体合成3条相对分子质量为60 000的SSA抗原氨基酸多肽链(MAP):MAP 482～493(P1表位)、MAP 310～323(P2表位)和MAP 230～241(P3表位).以P1～P3表位为包被抗原,富集筛选相应的噬菌体单克隆抗体(McAb);阳性克隆特异性、亲和力和序列分析鉴定;表位特异性McAb可溶性表达和鉴定.结果 5轮筛选后,获得了抗3种表位抗体的含完整插入片断的克隆株,具有较高亲和力和特异性.抗P1～P3抗体融合蛋白与相应表位反应的410 nm吸光度值分别为1.43±0.23、0.82±0.31、0.80±0.25,组间交叉反应差异有统计学意义(P值均小于0.01).其中3个克隆表位特异性McAb-ScFv克隆成功,可溶性表达并纯化.以Hep-2细胞为底物,间接免疫荧光法(ⅡF)检测显示,可溶性ScFv抗体具有在体活性.结论 筛选获得的阳性克隆成功,可溶性表达并具有较好的亲和力、特异性和在体活性,可胜任靶器官的表位表达情况的检测.
-
重组人KGF-2的制备及生物学活性研究
目的:实现重组人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)的原核可溶性高效表达,并获得活性良好的重组蛋白.方法:将编码人成熟KGF-2的cDNA构建至pET/21a表达载体中,利用大肠杆菌BL21进行表达,对表达条件(如诱导温度和诱导时间等)进行优化,并对目的蛋白的表达情况进行电泳分析;利用阳离子交换柱对重组蛋白进行纯化,对纯化的rhKGF-2利用MTT法检测其促IEC-6及NIH/3T3细胞的增殖活性.结果:通过对表达条件的优化,rhKGF-2的表达量可占到全菌总蛋白的25%,并且基本上全部为可溶性形式表达;利用阳离子交换柱对rhKGF-2进行纯化,薄层扫描分析其纯度高于90%.利用MTT法对rhKGF-2的活性进行研究,结果表明,低浓度的rhKGF-2就能够促进IEC-6细胞增殖,但对于NIH/3T3细胞需高浓度的rhKGF-2才能促进其增殖.结论:本研究实现了对rhKGF-2的可溶性高效表达,纯化后的rhKGF-2具有较好的活性,这为进一步的功能研究以及基因工程重组药物的开发奠定了基础.
关键词： 角质细胞生长因子-2 可溶性表达 细胞增殖 -
重组人肝再生因子可溶性表达及活性鉴定
目的 探索重组人肝细胞生成素Cn(HPPCn)蛋白可溶性表达方法和纯化工艺,提高其比活性和蛋白产量,为发展新的急性肝病治疗药物奠定基础.方法 利用分子生物学方法构建4个HPPCn原核表达载体,分别与不同的分子伴侣融合表达,助其表达后正确折叠.利用亲和层析方法纯化获得的融合蛋白,MTS法检测所得重组蛋白促进细胞增殖活性.结果 成功构建了4个HPPCn表达载体,其中pMBP-P-HPPCn实现了rhHPPCn的可溶性表达.结论 首次建立了重组HPPCn蛋白的可溶性生产方法,并对其蛋白活性进行分析和鉴定.
-
HLA-B*2705分子结构对其在原核细胞可溶性表达影响的研究
目的 研究人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-B*2705分子结构对其在原核细胞可溶性表达的影响.方法 采用RT-PCR法将HLA-B * 2705基因的全长、胞外区和α1、α2功能区分别进行克隆并连接到pET-32a(+)表达载体.经IPTG诱导表达,并经超声破碎、层析和透析纯化蛋白,再经体外微量细胞淋巴毒反应检测蛋白质活性.结果 成功构建3种pET-32a(+)表达载体,经IPTG诱导后,HLA-B* 2705基因全长和胞外区主要以包涵体的形式表达,可溶性蛋白的量较低；而α1和α2功能区则以高效可溶性形式表达,通过体外微量细胞淋巴毒实验证实,HLA-B* 2705的α1和α2功能区可溶性蛋白可与HLA-B27抗体特异性结合,并成功阻断补体介导的细胞毒作用.结论 α1和α2功能区能够在原核细胞中高效表达可溶性蛋白,并具有蛋白功能,而HLA-B* 2705基因全长和胞外区主要以包涵体的形式表达,表明蛋白质的大小和空间结构对于其可溶性表达具有重要影响.
关键词： HLA-B* 2705 分子结构 可溶性表达 包涵体 -
外源蛋白在大肠杆菌中的折叠
大肠杆菌是表达外源基因常用的宿主之一.它结构简单,遗传背景清楚,基因表达调控机制相对明确.随着对分子伴侣和折叠酶研究的深入,蛋白在大肠杆菌内的折叠机制逐渐为人们所认识.外源蛋白在大肠杆菌内的可溶性表达问题也逐步得到解决.
-
关键词：
-
抗表皮生长因子受体噬菌体抗体库的构建筛选及单链抗体可溶性表达
近年来的研究表明,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是肿瘤治疗中一个很重要的靶点.本研究应用噬菌体展示技术筛选EGFR特异性单链抗体(single chain Fv,scFv).利用高表达EGFR的人鳞状上皮癌细胞A431免疫小鼠,提取脾细胞mRNA,RT-PCR扩增VH和VL基因并拼装成scFv基因.将scFv基因连接到噬菌粒pCANTAB 5E中,电击转化E.coli TG1细胞,构建了库容为2.5×10 7的噬菌体单链抗体库.用纯化的EGFR为靶抗原对噬菌体抗体库进行5轮富集筛选,得到次级抗体库6F-10.挑取48个克隆进行ELISA测定,45个克隆为阳性.取阳性值高的克隆感染E.coli HB2151,IPTG诱导scFv的表达.scFv(约27 kD)以可溶形式存在于细胞质及细胞周质中,并可分泌至上清液.测序结果表明,scFv基因序列全长768 bp,编码256个氨基酸.VH为与小鼠Ig同源的重链可变区基因,VL为κ型轻链可变区基因;VH和VL均由3个抗原互补决定区和4个框架区构成.免疫印迹和细胞免疫荧光显示,可溶性scFv可分别与纯化的EGFR抗原以及细胞表面的EGFR发生特异性结合.抗EGFR特异性scFv的获得,为研制靶向EGFR的抗体药物与研究生物治疗提供导向载体分子.
-
pQE-hbFGF表达系统的构建及其蛋白质的表达和纯化
目的构建pQE-hishbFGF表达载体,通过一步纯化得到6×HishbFGF蛋白质.方法用PCR扩增目的基因hbFGF,连接到pQEA0载体上,转化到Top10菌株筛选重组子,经测序后将质粒转化到表达菌M15上,经IPTG诱导表达,超声波破菌后通过镍离子螯合层析一步纯化得6×HishbFGF蛋白质,ELISA鉴定产物,用MTT法检测产物促细胞增殖的生物活性.结果hbFGF基因插入pQE载体中,在M15中6×HishbFGF的表达量达到20%,且为可溶性表达.经一步纯化后得到N端带6个组氨酸的hbFGF蛋白,纯度为96%,6×HishbFGF具有免疫原性及促进NIH3T3细胞增殖的活性.结论6×HishbFGF蛋白质在M15中可溶性地高效表达,并经一步亲和层析得到纯度高活性高的产物,降低了生产成本,为大规模生产hbFGF及hbFGF的应用研究奠定了基础.
关键词： 人碱性成纤维细胞生长因子 pQE表达系统 可溶性表达 镍离子螯合层析
