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抗肝癌人源化单链抗体hscFv25的体外亲和力成熟
目的:提高人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的亲和力.方法:设计并合成人源化抗肝癌单链抗体hscFv25重链及轻链CDR3的半随机突变引物,构建突变体抗体库,竞争筛选亲和力更高的突变体抗体,对所得到的高亲和力的候选抗体,在大肠杆菌中进行可溶性表达,并采用细胞ELISA、细胞涂片免疫组织化学染色的方法,对该抗体进行初步的活性鉴定.结果:得到了3株候选高亲和力突变体抗体,其中的一株在大肠杆菌中获得了可溶性表达后,进一步的活性检测结果表明,该抗体的相对亲和力比亲本单链抗体提高了60倍左右,同时该抗体对肝癌细胞(SMMC-7721)的免疫组织化学染色呈强阳性,着色情况与亲本抗体相一致,而对正常肝细胞(HL-02)染色呈阴性.结论:成功地构建了人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的突变体抗体库,并筛选到了一株亲和力更高的突变体抗体.
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骆驼纳米抗体随机突变噬菌体展示文库的构建与质量分析
目的 构建人工突变的噬菌体展示文库并与天然噬菌体展示文库序列对比,进而对人工突变的噬菌体展示文库的质量进行科学评价,为纳米抗体的进一步改造提供鉴.方法 对结合人卵泡刺激素受体(FSHR)的纳米抗体的抗原互补决定区3(CDR3)进行NNY定点饱和突变,合成VHH06-ΔCDR3随机突变DNA.将突变DNA序列连接到载体pMECS上,构建VHH06-ΔCDR3突变噬菌体展示文库.通过DNA测序和分析,比较该文库与FSHR免疫的VHH噬菌体展示文库的多样性和CDR3区的氨基酸分布.采用FSHR对文库进行6轮亲和筛选,测定筛选后克隆的富集程度.结果 按照NNY突变原则,合成了长度为16个氨基酸的CDR3随机突变基因库.成功构建了库容量为7.36×108 cfu/ml的VHH06-CDR3随机突变噬菌体展示文库.多克隆与单克隆phage酶联免疫吸附实验结果显示,经过6轮筛选,输出噬菌体与FSHR的结合明显得到富集,但获得的克隆与FSHR没有明显结合.结论 VHH06-ΔCDR3随机突变噬菌体展示文库尽管具有序列多样性,但由于CDR3缺乏功能多样性,导致其在亲和筛选中不利于获得目标抗体.
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骨髓增生异常综合征造血细胞基因异常研究进展
骨髓增生异常综合征(MDS)是源于造血干/祖细胞突变的异常克隆逐步替代正常造血的白血病前期状态,其演变可能与一系列随机突变的积累有关,是内在的DNA缺陷和外源致突变物两方面作用的结果.现综述迄今有关MDS造血细胞基因研究的主要进展.
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酶定向进化的研究策略
定点突变是酶工程中研究酶的结构与功能的常规手段,并广泛用于改变酶的性能.酶的体外定向进化是改造生物催化剂的一种有效的新策略,主要是模拟自然进化进程,通过容错PCR等技术对编码酶的基因进行随机突变,再由DNA改组、交错延伸过程、随机引导重组、递增截短技术等进行突变基因的体外重组,终经筛选获得所需的酶.本文综述了酶定向进化的研究与应用.
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PCR介导的定点突变与随机突变的应用
蛋白质的结构与其功能之间的关系是蛋白质组学研究的重点内容之一.体外突变技术是研究这种复杂关系的有力工具,也是实验室中改造/优化基因常用的手段[1].定点突变技术可对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入;随机突变则可在特定编码序列的多个位点上产生随机的突变体.我们现介绍两种在实验中总结出来的用PCR方法对克隆化DNA进行定点突变和随机突变的技术.
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抗CD20嵌合抗体突变型Fab'片断诱导凋亡过程中活性氧Caspase-3的变化
目的研究抗CD20嵌合抗体突变型Fab'片断诱导Raji细胞凋亡过程中活性氧(ROS),Caspase-3的变化.方法利用MTT法测定突变型Fab'片断抑制细胞生长,形态学方法观察凋亡细胞的变化,用流式细胞仪检测DCFH-DA荧光探针标记细胞内ROS的变化,以及用酶标仪和Western blot 检测细胞内Caspase-3的变化.结果MTT法测定突变型Fab'片断对Raji细胞的生长具有抑制作用,其抑制作用呈明显的剂量依赖性,荧光显微镜下观察细胞出现凋亡,流式细胞仪,酶标仪以及Western blot检测细胞内ROS,Caspase-3的表达增高,并与作用时间,剂量呈依赖关系.结论ROS,Caspase-3表达的增高,在抗CD20嵌合抗体突变型Fab'片断诱导Raji细胞凋亡的过程中起到重要作用.
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鼻咽癌相关新基因NPCEDRG突变型重组表达载体的构建及生物信息学分析
目的 构建带His标签的突变型及野生型pcDNATM3.1/myc-HisB/NPCEDRG重组表达载体.方法 以pcDNA3.1-NPCEDRG重组质粒为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增NPCEDRG基因编码区,利用PCR过程中的碱基错配,随机突变产生NPCEDRG的突变体,分别将野生型及突变型NPCEDRG基因编码区cDNA插入pcDNATM3.1/myc-HisB真核表达载体,双酶切鉴定,测序验证,生物信息学方法进行蛋白质结构预测.结果 双酶切突变型及野生型pcDNATM3.1/myc-HisB/NPCEDRG重组表达载体,均产生519 bp长度的目的 片断.测序结果证实,突变型NPCEDRG基因有两个点发生了突变,分别是T260-C260和T287-C287,但没有移码突变,在线生物信息学分析结果示其相应氨基酸序列改变为V73-A73和M82-T82;野生型NPCEDRG基因序列与Genebank已知序列一致.两个重组载体插入片段大小均为513 bp,插入方向及位置正确,能表达预期所要的融合蛋白.结论 成功构建了带His标签的突变型及野生型pcDNATM3.1/myc-HisB/NPCEDRG重组表达载体,为深入研究NPCEDRG基因功能和揭示鼻咽癌发病分子机制提供实验手段.
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修正达尔文理论是发展科学,不是反对科学
ID运动没有全盘的否定达尔文主义,也不否定进化现象的存在,而是批评达尔文及其追随者把自然选择和随机突变作为进化现象主要的、甚至唯一的根源.实践是检验真理的标准,在化石发现和科学研究的证据面前纠正错误是在发展科学,而固步自封才是反对科学的进步.
