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人源抗严重急性呼吸综合征(SARS)病毒基因工程抗体的初步研究
严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)或称传染性非典型肺炎,已严重威胁人民健康和生命安全.快速研制一种可用于紧急预防SARS病毒感染的基因工程抗体预防制剂迫在眉睫.为此,运用噬菌体表面呈现技术,从多个SARS病人恢复期血中获得淋巴细胞,通过基因工程手段,构建了人源抗SARS病毒基因工程抗体文库,并筛选获得37株特异抗SARS病毒基因工程Fab抗体,其中11株人源抗体结合基因工程重组的SARS病毒核(N)蛋白,其中的1株在Western blot分析中与SARS病毒结合,识别SARS病毒N蛋白线性位点.对所获抗体的功能鉴定及基因分析正在进行中.人源抗SARS病毒基因工程抗体的获得,将对SARS疾病的特异性预防,治疗和诊断提供新的途径.
关键词： 严重急性呼吸综合征(SARS) SARS病毒 抗体库 Fab抗体 -
核糖体展示技术的原理与应用
通过构建分子文库(cDNA文库、随机肽库、抗体库及其它蛋白文库),采用合适的筛选技术可以非常方便、有效、快速地筛选生物活性物质.目前分子文库技术已经广泛应用于抗原表位分析、功能小肽分子(如肽类拮抗剂和激动剂)或功能蛋白分子(如抗体)的筛选和改造等领域.筛选技术主要有两类:1. 体内筛选技术,如噬菌体展示技术[1]、选择性感染噬菌体技术[2]等.
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人源性bFGF单链抗体的筛选、表达及鉴定
目的 用重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与bFGF特异性结合的人源性单链抗体(scFv).方法 用rhbFGF对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过phage ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步进行原核可溶性表达及鉴定.结果 从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗bFGF的抗体,通过对抗体可变区基因进行多样性分析,发现存在8种不同抗体可变区基因,挑选其中8株phage ELISA显色高的克隆进行酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中一株scFv能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合.结论 通过筛选噬菌体抗体库获得到7株抗bFGF特异性抗体,其中一株抗体能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1的结合.
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热点突变法提高人源抗TNF-α抗体的亲和力
目的通过热点突变法对一株人源抗TNF-α ScFv进行体外亲和力成熟.方法根据体内抗体亲和力成熟时V基因体细胞突变的热点,设计引物进行多步重叠PCR,在本株ScFv的H-CDR3和L-CDR3热点部位引入随机突变,构建噬菌体抗体库,采用硫氰酸盐洗脱法对抗体库进行筛选,对选出的克隆测定其相对亲和力,并进一步将4株转换表达成为可溶性Fab,以非竞争ELISA法测定其亲和常数.结果构建了库容为1.8×107的热点突变抗体库,筛选得到了多株亲和力明显提高的抗TNF-α抗体的突变体(多达10倍).结论热点突变法是体外提高抗体亲和力的有效和可行的方法.
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人源抗戊型肝炎病毒单克隆抗体的获得与鉴定
目的获得人源中和性抗戊型肝炎病毒(HEV)单克隆基因工程抗体. 方法采用五轮筛选法(逐轮降低抗原包被量,严格洗脱条件),以固相化的4种含中和抗原表位的HEV 代表株ORF2重组混合抗原淘筛本室构建的HEV 患者外周血源的噬菌体抗体库.获得有特异结合活性的噬菌体抗体,酶切鉴定抗体基因插入.切去噬菌粒上衣壳蛋白gⅢ基因构建表达载体,在大肠杆菌中可溶性表达抗HEV抗体Fab段,ELISA、Western blot检测抗体免疫学活性;测序分析抗体基因. 结果筛选出4株与含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异结合而与BSA、HBsAg无交叉结合反应的噬菌体抗体,可能为中和抗体.切去gⅢ基因,在大肠杆菌中表达可溶性抗体Fab段,表达量在细菌培养液上清和细菌裂解液中差异无显著性.可溶性抗体与含中和抗原表位的HEV ORF2重组混合抗原有特异结合活性,与BSA、HBsAg无交叉结合反应.Western blot显示在相对分子质量(Mr)略大于45×103处有一明显条带,与Mr 48×103的Fab大小一致.DNA测序分析表明,Fab段VH属于IgG VH3基因家族,VL属于Vκ1基因家族. 结论利用噬菌体抗体库技术成功获得抗HEV的人源单克隆抗体.
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启动子控制严密性对抗体库多样性影响的研究
目的比较阿拉伯糖(arabinose, Ara)启动子和Lac启动子的控制严密性,探讨启动子控制严密性对抗体库多样性的影响,寻找适合构建抗体库的启动子. 方法 1.以Ara启动子和Lac启动子驱动抗HBs、TNF-α及角蛋白的人Fab段,比较其本底表达.2.比较2种启动子表达载体对宿主菌生长的影响.3.观察2种启动子在抗体库扩增过程中对含有抗体基因的克隆重组率的影响. 结果1.本底表达在Lac启动子载体远高于Ara启动子载体; 2.经相应诱导物诱导后二者表达水平相似; 3.相同条件下,含有Lac启动子的抗体表达载体的细菌与Ara启动子相比处于生长劣势.4.在抗体库扩增过程中,含Lac启动子的抗体库中抗体基因克隆的重组率逐渐下降,而使用Ara启动子基本无变化. 结论启动子控制严密性差会导致抗体克隆重组率下降而影响抗体库的多样性,Ara启动子更适合于构建噬菌体抗体库.
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人噬菌体抗体库的构建和甲肝抗体的筛选
目的 构建人噬菌体抗体组合文库,筛选人单克隆抗体.方法 用RT-PCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,电转化E.coli形成噬菌体抗体库;以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体.结果 17对免疫球蛋白引物全部能够扩增出目的片段;经数次电转化构建了库容为6.93×107的抗体库,滴度为8×1014 PFU/ml,Fab基因重组率为40%.以单抗捕获的甲肝抗原淘洗3轮,出现特异性富集;阳性克隆经直接ELISA和竞争抑制性ELISA实验证实具有良好的抗甲肝抗原特异性,无交叉反应性.结论 成功构建了抗体组合文库,从中获得抗甲肝抗原的特异性人抗体.
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抗肝癌人源化单链抗体hscFv25的体外亲和力成熟
目的:提高人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的亲和力.方法:设计并合成人源化抗肝癌单链抗体hscFv25重链及轻链CDR3的半随机突变引物,构建突变体抗体库,竞争筛选亲和力更高的突变体抗体,对所得到的高亲和力的候选抗体,在大肠杆菌中进行可溶性表达,并采用细胞ELISA、细胞涂片免疫组织化学染色的方法,对该抗体进行初步的活性鉴定.结果:得到了3株候选高亲和力突变体抗体,其中的一株在大肠杆菌中获得了可溶性表达后,进一步的活性检测结果表明,该抗体的相对亲和力比亲本单链抗体提高了60倍左右,同时该抗体对肝癌细胞(SMMC-7721)的免疫组织化学染色呈强阳性,着色情况与亲本抗体相一致,而对正常肝细胞(HL-02)染色呈阴性.结论:成功地构建了人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的突变体抗体库,并筛选到了一株亲和力更高的突变体抗体.
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基于CHO细胞定点整合技术的新型抗体呈现系统的构建
目的 建立一个以CHO定点整合系统为基础的高通量抗体筛选平台,筛选获得抗VEGF高亲和力突变体抗体.方法 设计并构建了基于CHO细胞定点整合系统的通用minibody展示载体,将3株亲和力已知的抗VEGF抗体(A6,A63,A657)和1个抗VEGF轻链抗体库分别呈现在CHO细胞的表面,通过Western印迹、Bia-core3000、流式细胞分析等对该展示系统进行验证和评价,并通过流式细胞分选技术对抗体库进行了细胞筛选.结果 成功实现了抗VEGF抗体在CHO细胞表面的展示,流式细胞分析抗体的亲和力与Biacore测定全抗体亲和力结果一致;通过筛选获得3株抗VEGF高亲和力突变体抗体.结论 建立了基于CHO定点整合技术的新型抗体库展示系统,为抗体的亲和力成熟、分子改造等突变库的构建和筛选提供了新的技术支持.
关键词： 抗体库 CHO细胞 展示系统 高通量筛选 抗VEGF特异性抗体 -
新型pⅨ噬菌体展示系统的建立及初步评价
目的:构建新型噬菌体展示载体,评价其展示效果,为构建scFv库寻找新的展示体系.方法:PCR分离、扩增M13KO7中pⅨ蛋白编码基因,克隆入噬菌体展示载体PHB-gⅢ,替换原载体中的gⅢ-CT段,构建载体PHB-pⅨ,并将相对分子质量约50×103的碱性磷酸酶的编码基因分别克隆入两展示载体,观察其展示碱性磷酸酶能力的差别.结果与结论:成功构建了展示载体PHB-pⅨ,该载体具有与PHB-gⅢ相当的展示碱性磷酸酶的能力,且相同滴度的PHB-gⅢ噬菌体DNA含量略高于PHB-pⅨ噬菌体DNA含量,提示PHB-gⅢ系统展示外源蛋白时存在感染能力下降.PHB-pⅨ系统具有用于展示噬菌体抗体库的良好应用前景.
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优化宿主菌在重组系统中构建大容量天然噬菌体抗体库
制备大容量天然噬菌体抗体库.从健康成人外周血和新生儿脐带血中提取淋巴细胞总RNA,反转录后PCR分别扩增抗体重链和轻链基因.将获得的基因片段通过overlap PCR连接为单链抗体基因(scFv),限制性内切酶酶切后连入pDAN5a载体中,连接产物转化大肠杆菌XL2-blue MRF’.与XLl-blue菌株相比,初级库库容增加了3.9倍.再将初级库噬菌体感染含有Cre重组酶的大肠杆菌BS1365,抗体基因在重组酶作用下发生同源重组,终得到库容为1.7×1011的噬菌体抗体库.经检测,该抗体库多样性良好,利用该库可获得针对6种抗原的抗体.以上结果表明,应用XL2-blue MRF’作为抗体基因的转化宿主,提高了噬菌体抗体库的库容,获得的抗体库可用于下一步抗体药物的筛选.
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用于大容量人源天然噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定
目的 构建一个应用于大容量Fab段天然噬菌体抗体库的表达载体.方法 用定点突变技术将表面呈现噬菌粒载体pDF上的BssHⅡ酶切位点改为BglⅡ酶切位点,然后分别在抗体轻链和重链位置插入自杀基因SacB,构建含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB；利用抗乙肝表面抗原抗体的基因为模板,PCR扩增重链和轻链基因片段.将PCR扩增的轻链基因和重链基因分别插入载体pDF-D-SacB内,利用电转化的方法将其转入Transl-Blue大肠杆菌,构建2个初级质粒,再利用初级质粒超感染BS1365菌,使其轻链与重链发生重组,获得重组质粒,进一步获得抗乙肝表面抗原抗体的噬菌体.之后利用该噬菌体感染大肠杆菌Transl-Blue进行扩增,得到大量抗乙肝表面抗原的噬菌体抗体.后,通过酶联免疫吸附剂测定检测所获得的抗体.结果 通过向pDF重轻链区域插入SacB基因,改造抗体基因克隆位点,构建了pDF-D-SacB载体；经检测,pDF-D-SacB可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,可以在分泌Cre蛋白酶的细菌胞内发生预期的Cre-Loxp介导的定点重组.结论 所获得的含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB适用于构建大容量噬菌体抗体库.
关键词： 噬菌体 抗体库 Cre-Loxp重组系统 乙肝表面抗原 -
单链抗体的研究进展
抗体技术由细胞工程抗体(杂交瘤-单克隆抗体)发展到基因工程抗体,尤其是抗体库技术的出现,将抗体工程发展到了一个新阶段.本文从抗体库技术等方面介绍单链抗体(single-chain Fv antibody,scFv)的进展情况.
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触减PCR在扩增抗体重链和轻链可变区中的应用
目的 探讨扩增人免疫球蛋白重链和轻链可变区基因的方法. 方法 提取经免疫的具有乙肝表面抗体的人外周血淋巴细胞总RNA,反转录合成cDNA,采用普通PCR和触减PCR两种方法扩增抗体重链和轻链可变区基因. 结果 利用触减PCR方法,扩增出抗体重链和轻链的可变区基因,基因片段分别约为340 bp和325 bp,而普通PCR没有得到预期的结果. 结论触减PCR比普通PCR更容易扩增出抗体可变区基因片段.
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噬菌体作为模式生物在蛋白表达和病毒学方面的应用
近年来,随着噬菌体研究的不断深入,人们逐渐意识到噬菌体巨大的应用潜力.噬菌体表面展示技术、噬菌体抗体库、噬菌体核酸疫苗是将噬菌体作为载体而实现基因型与表型的结合,在病毒学方面噬菌体常被作为模式生物应用于多个研究领域.本文就以上各点作一综述.
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噬菌体抗体库技术
噬菌体抗体库技术以其简便和高效,大大地促进了抗体产业的发展.抗体库技术的出现离不开与社会需求的相互促进;抗体库的构建和筛选离不开对传统方法的改进和创新;抗体库技术的应用突破了传统杂交瘤技术的束缚.科研实践中处处体现着辩证法,了解一些辩证法知识,能够指导我们的科研实践,使其事半功倍.
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噬菌体抗体库技术筛选结肠癌单抗MC3的抗独特型抗体
目的：获得结肠癌单抗MC3的噬菌体呈现型抗独特型抗体(anti-Id)。方法：分离经单抗免疫鼠脾脏的mRNA，经RT-PCR分别扩增抗体VH和VLDNA，进而连接形成ScFv DNA。将ScFv DNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1，经M13KO7挽救后获得噬菌体呈现型ScFv文库。以MC3对文库进行四轮筛选后，随机挑取克隆经ELISA筛选呈现anti-Id ScFv的噬菌体单克隆。结果：VH、VL和ScFv DNA分别约为340、320和750 bp。抗体ScFv文库经四轮筛选后，在随机筛检的50个克隆中得到15个呈现anti-Id ScFv的噬菌体单克隆。结论：用噬菌体抗体库技术成功地获得了单抗MC3的anti-Id ScFv，从而为进行结肠癌重组anti-Id疫苗作用的研究提供了候选分子。
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大容量人源噬菌体抗体库的构建
目的:构建大容量易于改造成Diabody的噬菌体单链抗体库,筛选人源性抗体.方法:从正常成人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞提取RNA,经RT-PCR扩增轻重链可变区基因(VL和VH),通过重叠PCR(over-lap PCR)将VL和VH拼接成单链抗体(ScFv)基因(其中VH两侧是两个非同源的loxp基因),并克隆入噬菌体表达载体PDF,得到初级噬菌体抗体库.将初级抗体库以高MOI超感染Cre+菌株BS1365,通过loxp-cre定位重组系统,介导轻重链在菌内重组配对,然后低感染XL1-Blue菌,得到大容量的次级抗体库.以多种不同抗原对库进行筛选,得到多样性较好的特异性抗体.结果:经超感染重组,得到1.2×1010的大容量抗体库.经三种蛋白抗原筛选,均得到多株特异性较好的噬菌体抗体,并成功构建为活性较好的Diabody.结论:经Loxp-Cre定位重组系统在单细胞内重组,能够高效地构建大容量噬菌体单链抗体库.
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KGla细胞免疫小鼠脾细胞scFv噬菌体展示文库的构建及其表达
目的:用噬菌体展示技术构建KGla免疫小鼠的脾细胞scFv表达文库.方法:用人髓系白血病细胞系KGla细胞免疫小鼠,取其脾细胞,RT-PCR扩增VH和Vκ基因并克隆入噬菌体展示表达载体,构建scFv文库,并测定文库的库容量和BstN1酶切单个克隆分析文库的多样性.用KGla作为固相抗原,进行四轮吸附-洗脱-富集的筛选,SDS-PAGE检验筛选后文库scFv的呈示表达.结果:文库的库容为3×106cfu,单个克隆的BstN1 Ⅰ酶切图谱显示多样,提示文库的容量和多样性均能满足进一步筛选分离目的基因的需要,筛选后的文库能很好地表达外源scFv.结论:文库的构建为进一步地分离KGla细胞表面分子抗体基因提供了必要而可靠的基础.
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用于大容量噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定
目的:构建一个适用于大容量抗体库的噬菌体抗体表达载体.方法:通过插入人工合成寡核苷酸、PCR介导的定位突变等技术,将载体p3MH进行改造,使之更适于构建大容量抗体库.通过噬菌体抗体的表达、ELISA及细胞内重组试验鉴定所获得的表达载体.结果:通过插入loxp511和loxp序列,将Lac启动子更换为阿拉伯糖启动子、改造抗体基因克隆位点等,将p3MH改造成pAL.经检测pAL可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,其表达调控更为严密,可以在cre+细菌胞内发生预期的loxp-cre介导的定位重组.结论:所获得的表达载体pAL适用于构建大容量Fab噬菌体抗体库.
关键词： 噬菌体 抗体库 Loxp-cre重组系统 体内重组
