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Cre重组文献资料
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大容量人源噬菌体抗体库的构建
目的:构建大容量易于改造成Diabody的噬菌体单链抗体库,筛选人源性抗体.方法:从正常成人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞提取RNA,经RT-PCR扩增轻重链可变区基因(VL和VH),通过重叠PCR(over-lap PCR)将VL和VH拼接成单链抗体(ScFv)基因(其中VH两侧是两个非同源的loxp基因),并克隆入噬菌体表达载体PDF,得到初级噬菌体抗体库.将初级抗体库以高MOI超感染Cre+菌株BS1365,通过loxp-cre定位重组系统,介导轻重链在菌内重组配对,然后低感染XL1-Blue菌,得到大容量的次级抗体库.以多种不同抗原对库进行筛选,得到多样性较好的特异性抗体.结果:经超感染重组,得到1.2×1010的大容量抗体库.经三种蛋白抗原筛选,均得到多株特异性较好的噬菌体抗体,并成功构建为活性较好的Diabody.结论:经Loxp-Cre定位重组系统在单细胞内重组,能够高效地构建大容量噬菌体单链抗体库.
