Objective. To construct ScFv and Fab from murine anti-gastric cancer monoclonal antibody( mAb)3H11. Methods. At first,3H11 ScFv and Fab were constructed with V genes PCR amplified by degenerate primers for FRI. The bacterial expressed 3H11 Ab fragments showed no antigen binding activity. Then, phage antibody library andrandom mutated library were constructed from 3H1 1 hybridoma cells and panning selection was performed. Again the i-dentification of positive clone was failed. Finally the N-terminal sequences of V regions were resumed to 3H1 1 original sequences by site-directed mutagenesis via PCR. Results. Binding activity to gastric cancer cells was detected only from N-terminal sequence corrected 3H11 ScFv and Fab,though the expression of the Ab fiagments was not affected. Correction of either VL or VH N-terminal se-quences could partially resume the antigen binding activity. Conclusion. Sequence changes of V region N terminal introduced by PCR may seriously affect antigen binding without affecting the expression of antibody.Received for publication Oct. 26,1998.

小鼠ScFv基因片段的构建

目的利用分子重组技术构建小鼠单链抗体片段(ScFv).方法采用PCR反应从小鼠脾细胞扩增鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区,利用连结引物将重链和轻链DNA组装成单链抗体(ScFv)片段.结果克隆出VH,VL基因,用Linker将VH,VL连接起来后的ScFv构建成功,其分子量为750 bp.结论 ScFv分子小,异源性低,可以结合与噬菌体载体中形成融合蛋白表达,该技术是抗体制备的一种简便、可靠的方法.

抗Pgp基因工程抗体ScFv的构建、表达及其活性测定

目的:构建表达抗PgpScFv,进行体外活性的测定.方法:利用RT-PCR方法,克隆抗Pgp杂交瘤细胞PHMAO2的重链可变区基因(VH),轻链可变区基因(VL),拼接为单链抗体(ScFv),再克隆到具有强启动子的PET28a(+)载体上进行表达,并进行了表达产物体外活性的测定.结果:构建了表达质粒PET28a(+)-ScFvPGP.表达产物可与表达Pgp抗原的K562/A02细胞特异性结合,并不抑制Pgp外排泵的功能.结论:构建表达的抗PgpScFv只有针对Pgp抗原的识别功能,并无抑制作用,因此应用于人体后不会干扰正常细胞的排泄分泌功能,无论是作为靶向诊断治疗的载体还是作为双功能抗体的一臂,均具有广泛的应用前景.

KGla细胞免疫小鼠脾细胞scFv噬菌体展示文库的构建及其表达

目的:用噬菌体展示技术构建KGla免疫小鼠的脾细胞scFv表达文库.方法:用人髓系白血病细胞系KGla细胞免疫小鼠,取其脾细胞,RT-PCR扩增VH和Vκ基因并克隆入噬菌体展示表达载体,构建scFv文库,并测定文库的库容量和BstN1酶切单个克隆分析文库的多样性.用KGla作为固相抗原,进行四轮吸附-洗脱-富集的筛选,SDS-PAGE检验筛选后文库scFv的呈示表达.结果:文库的库容为3×106cfu,单个克隆的BstN1 Ⅰ酶切图谱显示多样,提示文库的容量和多样性均能满足进一步筛选分离目的基因的需要,筛选后的文库能很好地表达外源scFv.结论:文库的构建为进一步地分离KGla细胞表面分子抗体基因提供了必要而可靠的基础.

抗Aβ42细胞内抗体TAT-6His-mAbA/B的构建

目的 构建能够在细胞内特异性拮抗Aβ42的小分子细胞内抗体TAT-6His-mAbA/B,为细胞内抗体技术用于AD的诊断和治疗提供新依据.方法 根据GenBank提供的Aβ42单克隆抗体的已知序列,选取重链和轻链可变区(CDR1和CDR3)进行偶联,应用DNASIS计算机软件设计引物,通过两次PCR获得目的 片段mAbA/B.将目的 片段与pGEM-Teasy载体相连,限制性内切酶酶切鉴定重组质粒,Sanger单链末端终止法测出克隆的核苷酸序列.结果 限制性内切酶EcoRI酶切pGEM-T Easy/mAbA/B,可见132bp或141bp的目的 片段,与理论值一致;DNASIS软件分析测序结果与GenBank所报道的结果完全一致.限制性内切酶PamHI和BamH I联合酶切pssHG-CMV/TAT-6His-mAbA/B,琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒,得到大小约为400bp的融合基因TAT-6His-mAbA/B目的 片段,与理论值一致.结论 通过PCR方法成功克隆了Aβ42小分子细胞内抗体TAT-6His-mAbA/B片段.

C-GPC3蛋白的表达及人源GPC3抗体的筛选

目的 构建C-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)基因真核表达质粒,表达C-GPC3蛋白,并通过哺乳动物展示型全人源scFv抗体库筛选GPC3抗体.方法 通过PCR从含有全长GPC3的质粒中扩增C-GPC3基因,将其克隆至p3457-his载体中,构建重组真核表达质粒p3457-C-GPC3,转染293T细胞,对C-GPC3蛋白的表达进行Westem blot鉴定.将质粒p3457-C-GPC3瞬时转染293E细胞,获得C-GPC3蛋白,采用Ni亲和柱纯化后,进行FITC标记.以本课题组构建的哺乳动物展示型全人源scFv抗体库为起始文库,FITC-C-GPC3抗原按照10、2和0.8 nmol/L的浓度梯度,通过流式细胞术进行分选,获得荧光强度强、比例约为0.1％的阳性细胞.结果 重组表达质粒p3457-C-GPC3经菌液PCR和测序鉴定证明构建正确;瞬时转染293T和293E细胞均可表达相对分子质量约为25 000的C-GPC3蛋白;获得了可与C-GPC3结合的阳性率约为0.1％的阳性细胞.结论 成功构建了重组真核表达质粒p3457-C-GPC3,并从哺乳动物展示型全人源scFv抗体库中筛选出了阳性细胞,为后期全人源GPC3抗体的构建和表达奠定了基础.

从噬菌体单链抗体库中筛选MMP7单链抗体

目的:从人天然噬菌体单链抗体库中筛选与MMP7特异结合的单链抗体(scFv),并对其特异性及活性进行分析.方法:转化MMP7质粒,分离、纯化与鉴定表达的MMP7.以MMP7为靶标对人天然噬菌体单链抗体库进行4轮的筛选富集,初步筛选到能与MMP7结合的scFv.通过ELISA和Western 对所获scFv的特异性进行分析.结果:分离纯化鉴定了MMP7,筛选获得了结合MMP7的人噬菌体抗体.ELISA和Western 表明筛选到的scFv特异性较好.结论:利用噬菌体抗体库技术可直接获得特异人源MMP7抗体,为抗MMP7单抗药物的研发提供了新的可能性.

含有E tag的抗结肠癌相关抗原单链抗体的研制

在已构建的抗结肠癌相关抗原单链抗体基因的基础上,为方便其活性测定,设计了含有E tag的引物进行PCR扩增,以scFv-E tag融合基因的形式构建在质粒pET-22b(+)中,并在大肠杆菌中进行了表达.对表达产物的主要成分包涵体进行了变性、复性,ELISA及免疫组化SABC法对该单链抗体进行活性测定,结果表明它具有与原代单克隆抗体相似的抗原结合活性及组织特异性.

ScFv噬菌体抗体库技术研究进展及其在寄生虫学上的应用

随着蛋白组学时代的到来,对目的抗体的需求量的增加,噬菌体抗体库技术获得抗体的优越性得到充分发挥.该文主要介绍噬菌体抗体库技术的重要一种ScFv(单链抗体)噬菌体抗体库技术.从理想ScFv噬菌体抗体库的构建、可溶性表达、液体和固体筛选的优缺点及其在寄生虫学的应用等几个方面对此技术的研究进展作一综述.

EGFRvⅢ特异性单链抗体的制备及其靶向性能

目的:应用噬菌体展示技术筛选出能与EGFRvⅢ特异性结合的单链抗体(single-chain Fv,scFv),并研究其靶向性能.方法:构建EGFRvⅢ特异性scFv噬菌体库,ELISA筛选阳性克隆,阳性EGFRvⅢ-scFv质粒重新克隆人pCANTAB-Throm-bin-His载体,转化E.coli HB2151,IPTG诱导可溶性EGFRvⅢ-scFv表达.间接免疫荧光及裸鼠活体成像技术鉴定EGFRv Ⅲ-scFv与EGFRvⅢ的特异性结合.结果:成功构建了EGFRvⅢ-scFv噬菌体库,ELISA筛选得到16个EGFRvⅢ-scFv克隆,取一克隆命名为EGFRvⅢ-scFv-2Al.EGFRvⅢ-scFv-2Al质粒重新克隆人pCANTAB-Thrombin-His载体,成功表达可溶性EGFRvⅢ-scFv-2Al.EGFRvⅢ-seFv-2Al在体外可特异性结合HuH7-EGFRvⅢ肝癌细胞,但不结合HuH7-EGFR和HuH7肝癌细胞;荧光标记的EGFRvⅢ-scFv-2Al裸鼠体内可特异性结合U87MG-EGFRvⅢ胶质瘤细胞移植瘤,而不结合U87MG细胞移植瘤.结论:成功制备的EGFRvⅢ-scFv-2Al可特异性靶向结合EGFRvⅢ,在肿瘤的诊断和靶向治疗中具有潜在应用价值.

小细胞肺癌2F7单抗ScFv的高效表达及复性研究

目的在大肠杆菌中高效表达小细胞肺癌单抗2F7的单链抗体(ScFv),并获得具有生物学活性的ScFv.方法利用PCR方法将2F7单抗重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一人工设计的柔性连接肽(Linker)连接,再将单链抗体基因重组到原核表达载体pQE31中,构建单链抗体高效表达载体pQE-2F7-ScFv.将pQE-2F7-ScFv质粒转化大肠杆菌M15后诱导表达,并对表达产物进行纯化和稀释复性.结果获得了2F7单链抗体的高效表达,表达蛋白大小约27.4kD,以包涵体形式存在.包涵体蛋白在经过变性、纯化和稀释复性后,获得了有功能的单链抗体.结论成功地构建和表达了小细胞肺癌单抗2F7的单链抗体,并对其进行了纯化和复性,将进一步促进2F7单抗小分子抗体的应用.

错配PCR致突变的实验条件研究

目的 :对目前常用的致突菌株和PCR随机突变方法进行评价.方法:用单链抗体表达质粒转化致突菌株XL1-Red,转种传代7 d,选取克隆测定DNA序列.用错配PCR在相同基因中引入突变,比较不同Mg2+ 浓度、不同dNTP的浓度、不同dITP等条件下所致突变率.结果:在XL1-Red菌株中转种7 d(约50代)后,测定突变率<0.1%.在错配PCR中,增加Mg2+ 浓度可提高突变率,增加dTTP和dCTP浓度的致突变效果优于增加dATP和dGTP的效果.在dITP配以低浓度的dATP 或dGTP时突变率较低,使用5 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L MnCl2、1 mmol/L dTTP和dCTP的条件下,经2轮PCR( 共60个循环)突变率可>2%.其突变类型有明显偏向性,以A/T的突变为主,转换多于颠换. 结论:用致突菌株引入的突变率过低,不适用于抗体亲和力成熟,错配 PCR在合适条件下可达到2%以上突变率,适用于随机突变抗体库的构建,但其突变类型有偏向性,应予以考虑.

抗日本血吸虫单链抗体免疫毒素的构建表达及生物学活性鉴定

目的 构建抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4单链抗体和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核融合表达载体,并对其表达产物进行生物学活性鉴定.方法 应用PCR方法体外扩增NP11-4 V_H、V_L、scFv和PE38KDEL基因,经测序后将scFv及PE38KDEL基因通过限制性内切酶双酶切及连接反应,构建原核表达载体pBAD/gIII A-scFvPE38KDEL,转化E.coli Top10F',L-阿拉伯糖诱导表达,表达产物经Western blot及ELISA鉴定其活性.结果 构建了重组免疫毒素表达载体pBAD/gIII A-scFv-PE38KDEL,诱导表达产物主要以包涵体形式存在,分子量约为70 kD;经变性、复性后的重组免疫毒素与血吸虫可溶性虫卵抗原有较好的结合活性.结论 构建及表达了抗日本血吸虫单链抗体免疫毒素,为血吸虫病治疗提供了一条新思路.

运用生物信息学技术分析预测抗氨基末端脂多糖结合蛋白(NH-LBP)单链抗体的结构

应用生物信息学技术预测人工构建的人源化抗氨基末端脂多糖结合蛋白(NH-LBP)单链抗体(scFv)的结构及其生物学活性.利用在线生物信息学工具分析抗NH-LBP的scFv的理化特性及该抗体的二、三级结构.预测结果表明抗NH-LBP的scFv属于较稳定蛋白质,体内半衰期较长;该抗体与数据库中收录的单链抗体的二级结构十分相似;该抗体的三维空间结构为一种球形的蛋白质.通过在线生物信息学工具获得了抗NH-LBP scFv的一、二、三级结构及理论功能,为进一步研究该抗体的体内外生物学活性提供了理论依据.

抗人死亡受体5单链抗体的构建表达纯化及活性分析

目的 构建、表达、纯化抗人死亡受体5(DR5)单链抗体,并检测其诱导肿瘤细胞凋亡的活性.方法 采用RT-PCR获取鼠源性抗人DR5单克隆抗体重链和轻链可变区基因序列,以一柔性连接肽连接二者,转入表达载体,以大肠杆菌表达融合蛋白,亲和色谱纯化后用MTT实验和凋亡检测试剂盒检测其凋亡诱导活性.结果 获得的序列经比对为抗体重链和轻链可变区基因,表达纯化后的重组蛋白具有接近完整抗体的肿瘤细胞凋亡诱导活性.结论 抗人DR5 scFv可作为诱导肿瘤细胞凋亡的候选药物,为肿瘤免疫学研究提供材料.

全人源药用抗EGFR ScFv（HL-L-L）的构建、表达及抗肿瘤活性分析

目的：对抗EGFR单克隆抗体重链可变区（VH）和轻链全长（L）经柔性肽链（linker）连接而成的单链抗体（VH-L-L）进行构建、表达及其抗肿瘤活性的分析，并对其进行生物信息学分析和相关谱学表征。方法通过OVER LAPING技术得到EGFR ScFv （HL-L-L）基因，然后构建原核表达载体pET-28a-c（＋）-VH-L-L，经诱导表达、Ni柱纯化后得到目的蛋白HL-L-L，并对其利用SWISS-MODEL进行三级结构预测；通过紫外扫描分光光度计，进行吸收波长的扫描；用NanoZSP表征目的蛋白VH-L-L的粒度和电位；随后利用药理学方法，研究HL-L-L对乳腺癌细胞的增殖抑制情况。结果成功构建了原核表达载体pET-28a-c（＋）-VH-L-L；获得了较高纯度的VH-L-L蛋白，并成功预测了其三维结构；其粒度约为489.7 nm，Zeta电势为-38.1，带负电；HL-L-L对MCF-7具有一定的增殖抑制作用，与空白组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。结论成功表达了全人源药用抗EGFR ScFv（HL-L-L），其对乳腺癌细胞的增殖抑制作用显著，为下一步研制抗EGFR的小分子抗体药物提供基础。

抗CD40单链抗体的慢病毒载体的构建和表达

目的 克隆大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体(CD40-scFv),并构建可表达大鼠抗小鼠的抗CD40抗体的单链抗体(CD40-scFv)的重组慢病毒.方法 采用RT-PCR法从分泌大鼠抗小鼠抗CD40激活型抗体的杂交瘤细胞株(FGK-115)中克隆VH和VL基因,用重叠延伸PCR法将VH和VL拼接在一起,构建抗CD40抗体的scFv基因,将CD40-scFv基因连接至PEGM-T克隆载体,限制性内切酶酶切及测序鉴定；构建含有大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体(CD40-scFv)的慢病毒穿梭质粒,并与其它包装质粒一起通过磷酸钙法感染293T细胞；获得病毒颗粒并感染人慢性髓系白血病细胞MEG-01,检测其感染效率.结果 含大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体(CD40-scFv)的慢病毒穿梭质粒构建成功；通过磷酸钙感染293T细胞所得病毒上清可成功感染MEG-01细胞,流式细胞术检测阳性率可达96％.结论 成功克隆了大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体(CD40-scFv)基因,并建立其重组慢病毒表达系统,为后续的实验及应用研究工作奠定了基础.

酶斑点杂交法与双抗体夹心法检测汉坦病毒感染的比较

目的 将酶标抗汉坦病毒NP抗原单链抗体应用于酶斑点杂交法和双抗体夹心法,检测汉坦病毒感染,探索价格低廉早期HFRS诊断试剂.方法 以戊二醛偶联辣根过氧化物酶和抗汉坦病毒NP抗原单链抗体,制备酶标单链抗体,并应用于酶斑点杂交法和双抗体夹心法中,检测56份早期HFRS患者血清及66份阴性对照血清.结果 56份HFRS患者血清中,双抗体夹心法检测出29例阳性,阳性率为51.79%,酶斑点杂交法检测出28例阳性,阳性率为50.00%,两方法 检测66例阴性对照血清,结果 均为阴性.统计学处理,两方法 差异不显著.结论 以酶标抗汉坦病毒NP抗原单链抗体制备的酶斑点杂交和双抗体夹心诊断试剂,均为稳定性好、假阳性率低、造价低廉、诊断可靠的诊断试剂.

融合蛋白ScFv（3G11）-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a（＋）-ScFv-mms13，在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13，经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a（＋）质粒，构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中，利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达融合蛋白，通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a（＋）-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达，且确定了在IPTG终浓度为0．2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在，部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合，提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a（＋）-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。

重组超抗原SEB-scFv融合蛋白的体内抑瘤作用

以单克隆抗体(mAb)作为载体的宫颈癌靶向治疗目前取得了一定的进展,但是多次使用会产生人抗鼠抗体反应(HAMA),限制其临床应用,同时完整抗体分子量大、穿透能力差、血液清除率慢致使肿瘤/血比值低,为克服mAb的上述缺点,我们在克隆出抗宫颈癌单克隆抗体轻、重链可变区基因的基础上,利用重组聚合酶链反应反应(PCR)方法制备抗宫颈癌单链抗体(ScFv),并将其与金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因融合,构建表达出融合蛋白SEB-scFv,注射到宫颈癌动物模型体内,进行抑瘤作用的初步研究.