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mIL-21-hIgGFc融合蛋白在293 E细胞中的表达纯化及其对CD8＋T细胞表型的影响
目的：在293 E细胞中表达小鼠IL-21-hIgGFc融合蛋白，并检测该蛋白对CD8＋T细胞表型的影响。方法：运用RT-PCR方法从BALB／c小鼠脾脏淋巴细胞扩增出 IL-21基因，插入到 PTT3-hIgGFc 载体上，获得重组质粒 PTT3-mIL-21-hIgGFc；用磷酸钙瞬时转染293E细胞，48 h和72 h后分别收集培养上清。培养上清经MOLLIPORE LabscaleTM TFF system浓缩后， Protein G琼脂糖柱纯化获得mIL-21-hIgGFc融合蛋白，再用ELISA和SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的含量和纯度。mIL-21-hIgGFc刺激P1A小鼠的CD8＋T细胞，72 h后，运用流式细胞术检测其表型改变情况。结果：重组质粒PTT3-mIL-21-hIgGFc经酶切和测序确定载体构建成功，ELISA检测表明293E细胞上清中含有787 ng／ml，SDS-PAGE结果显示得到了较纯的融合蛋白，纯化后获得500μg融合蛋白mIL-21-hIgGFc。融合蛋白mIL-21-hIgGFc 处理P1A小鼠CD8＋T细胞后，CD44low CD62Lhi CD8＋T细胞明显增多。结论：我们成功构建了PTT3-mIL21-hIgGFc重组质粒，在293E细胞中表达并纯化出mIL21-hIgGFc融合蛋白。 mIL21-hIgGFc能促进CD8＋T细胞向CD44lowCD62Lhi CD8＋记忆干细胞表型分化，这对于肿瘤过继免疫治疗方案的改进具有重要的参考意义。
关键词： 白细胞介素21(IL-21) 293E细胞 表达纯化 CD8+T细胞 -
C-GPC3蛋白的表达及人源GPC3抗体的筛选
目的 构建C-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)基因真核表达质粒,表达C-GPC3蛋白,并通过哺乳动物展示型全人源scFv抗体库筛选GPC3抗体.方法 通过PCR从含有全长GPC3的质粒中扩增C-GPC3基因,将其克隆至p3457-his载体中,构建重组真核表达质粒p3457-C-GPC3,转染293T细胞,对C-GPC3蛋白的表达进行Westem blot鉴定.将质粒p3457-C-GPC3瞬时转染293E细胞,获得C-GPC3蛋白,采用Ni亲和柱纯化后,进行FITC标记.以本课题组构建的哺乳动物展示型全人源scFv抗体库为起始文库,FITC-C-GPC3抗原按照10、2和0.8 nmol/L的浓度梯度,通过流式细胞术进行分选,获得荧光强度强、比例约为0.1％的阳性细胞.结果 重组表达质粒p3457-C-GPC3经菌液PCR和测序鉴定证明构建正确;瞬时转染293T和293E细胞均可表达相对分子质量约为25 000的C-GPC3蛋白;获得了可与C-GPC3结合的阳性率约为0.1％的阳性细胞.结论 成功构建了重组真核表达质粒p3457-C-GPC3,并从哺乳动物展示型全人源scFv抗体库中筛选出了阳性细胞,为后期全人源GPC3抗体的构建和表达奠定了基础.
关键词： 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 C-末端 293E细胞 哺乳动物展示型抗体库 ScFv 流式细胞术 分选
