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C-GPC3蛋白的表达及人源GPC3抗体的筛选
目的 构建C-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)基因真核表达质粒,表达C-GPC3蛋白,并通过哺乳动物展示型全人源scFv抗体库筛选GPC3抗体.方法 通过PCR从含有全长GPC3的质粒中扩增C-GPC3基因,将其克隆至p3457-his载体中,构建重组真核表达质粒p3457-C-GPC3,转染293T细胞,对C-GPC3蛋白的表达进行Westem blot鉴定.将质粒p3457-C-GPC3瞬时转染293E细胞,获得C-GPC3蛋白,采用Ni亲和柱纯化后,进行FITC标记.以本课题组构建的哺乳动物展示型全人源scFv抗体库为起始文库,FITC-C-GPC3抗原按照10、2和0.8 nmol/L的浓度梯度,通过流式细胞术进行分选,获得荧光强度强、比例约为0.1％的阳性细胞.结果 重组表达质粒p3457-C-GPC3经菌液PCR和测序鉴定证明构建正确;瞬时转染293T和293E细胞均可表达相对分子质量约为25 000的C-GPC3蛋白;获得了可与C-GPC3结合的阳性率约为0.1％的阳性细胞.结论 成功构建了重组真核表达质粒p3457-C-GPC3,并从哺乳动物展示型全人源scFv抗体库中筛选出了阳性细胞,为后期全人源GPC3抗体的构建和表达奠定了基础.
关键词： 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 C-末端 293E细胞 哺乳动物展示型抗体库 ScFv 流式细胞术 分选 -
阿片受体C-末端的功能及与其相互作用蛋白的研究进展
阿片受体C-末端氨基酸在激动剂作用后受体的磷酸化、脱敏及内吞过程中发挥了重要作用,C-末端部分缺失或不同氨基酸位点的突变对受体功能有明显影响,如μ阿片受体C-末端的Thr394、Thr383、Thr357、Ser355,δ受体C末端的Ser363和κ受体C末端的Ser369等.除了公认的参与阿片受体C-末端磷酸化的激酶,近年来,人们寻找到其他一些与C-末端相互作用的蛋白,这些相互作用蛋白对阿片受体功能有不同的影响,如PPL、FilaminA、PLD2、PKCI、GASP和EBP50/NHERF等,但不能很好的解释阿片类物质的依赖、耐受与成瘾.因此,寻找特异性与C-末端相互作用的蛋白,成为阿片成瘾机制研究的一个方向.
