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肺腺癌中EGFRvⅢ蛋白表达与EGFR基因突变的临床意义
目的 探讨肺腺癌组织中EGFRvⅢ蛋白表达与EGFR基因突变之间的关系.方法 以免疫组化及基因测序方法检测114例肺腺癌肿瘤组织的EGFRvⅢ蛋白表达及EGFR基因的突变.结果 114例中EGFRvⅢ蛋白检出率为30.7％(35/114);EGFR基因突变检出率为47.4％ (54/114),主要发生在19、21号外显子.结论 EGFRvⅢ蛋白表达与EGFR基因突变呈正相关,EGFRvⅢ蛋白检测也许可以作为指导肺腺癌患者用药的一种新方法.
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EGFR和EGFRvⅢ在胃癌中的表达及意义
目的:检测表皮生长因子受体(EGFR)及表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)在胃癌组织中的表达,探讨其与胃癌发生、发展的关系及其与各临床病理特征之间的关系.方法:采用免疫组织化学染色法(S-P法)检测105例胃癌组织及癌旁正常胃组织中EGFR和EGFRvⅢ蛋白的表达水平,并将检测结果与临床病理参数进行综合分析.结果:胃癌组织及正常胃组织EGFR和EGFRvⅢ的表达率分别为46.67%、35.24%和7.62%、3.81%,胃癌组织表达明显高于正常胃组织(P<0.01);二者的表达与性别和年龄均无相关性(P>0.05),与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及临床分期有相关性(P<0.05).结论:EGFR和EGFRvⅢ在胃癌组织中存在高表达,与胃癌的发生、发展有一定关系,并与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及临床分期密切相关.
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PTEN下调FAK磷酸化来抑制EGFR受体突变体引起的胶质瘤细胞侵袭
背景与目的:抑癌基因PTEN在胶质瘤中突变率达20%～40%,且PTEN缺失和表皮生长因子受体突变体EGFRvⅢ同时存在EGFR表达的胶质瘤组织中.PTEN通过直接与FAK作用从而降低其酪氨酸磷酸化来抑制肿瘤细胞侵袭.EGFRvⅢ表达,PTEN缺失都是肿瘤细胞侵袭性增加的原因之一.PTEN功能的丧失可能是EGFRvⅢ表达的肿瘤进一步发展成恶性侵袭性肿瘤的原因之一.本文将探讨在EGFRvⅢ表达和PTEN缺失的肿瘤细胞中转入PTEN以观察其是否能抑制EGFRvⅢ所引起的肿瘤细胞的侵袭.方法:将野生型PTEN及其突变体分别导入人胶质瘤细胞U87ΔEGFR中,利用Transwell-细胞侵袭实验观察细胞侵袭运动变化;免疫印迹实验检查FAK磷酸化变化;FAK表达载体来转染FAK磷酸化程度低的U87ΔEGFR-wtPTEN细胞,观察细胞侵袭运动变化.结果:PTEN和PTEN(G129E)能够抑制U87ΔEGFR细胞侵袭,并且下调FAK 397位点磷酸化水平.U87ΔEGFR-wtPTEN细胞中FAK 397位点磷酸化水平增加伴随着细胞侵袭能力的提高.结论:PTEN 可能通过下调FAK 397位点磷酸化水平来抑制EGFRvⅢ引起的胶质瘤细胞侵袭.
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CAR-T在实体瘤治疗中的抗原选择及其相关临床研究现状
CAR-T是一种基因改造后的细胞免疫治疗手段,T细胞输入体内后可持续活化增殖,非限制性识别并杀伤肿瘤细胞.嵌合CD19受体的CAR-T在急性淋巴细胞白血病中的平均有效率接近80％,但在实体肿瘤中却未观察到明显疗效.肿瘤抗原识别不佳及肿瘤微环境抑制是影响疗效的主要原因,提升抗原的特异性既能增加疗效也能避免脱靶效应的发生.本文主要综述肿瘤抗原的特点及其在CAR-T治疗实体瘤中的应用现状,重点分析神经节苷酯(disialoganglioside,GD2)、EGFRvⅢ、CEA抗原特点及应用情况,探讨如何对抗原进行精准选择,其中基因突变后产生的新抗原有成为特异性抗原的潜力.
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人脑胶质瘤组织中CD133与EGFRvⅢ的共表达及其临床意义
目的:观察人脑胶质瘤组织中肿瘤干细胞标记物CD133与表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variantⅢ,EGFRvⅢ)的共表达情况及其临床意义.方法:取河南省人民医院自2011年1月至2011年6月手术切除的脑胶质瘤组织40例,其中Ⅱ级17例、Ⅲ级12例、Ⅳ级11例.流式细胞术检测不同级别脑胶质瘤中CD133+、EGFRvⅢ+和CD133+/EGFRvⅢ+细胞所占的比例,分析其临床意义.结果:CD133、EGFRvⅢ在人脑胶质瘤组织中的表达率及其阳性表达细胞比例均随肿瘤级别逐步升高(均P＜0.05).不同级别脑胶质瘤中均发现CD133和EGFRvⅢ共表达细胞,CD133 +/EG-FRyⅢ+细胞共表达率在(4.75±1.26)％～(18.26±3.45)％之间,Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中CD133+/EGFRvⅢ+细胞的共表达率高于Ⅱ级(P＜0.05).CD133 +/EGFRvⅢ+细胞比CD133+细胞、EGFRvⅢ+细胞对脑胶质瘤患者的生存期影响更大,共表达细胞患者的中位生存时间明显缩短.结论:人脑胶质瘤组织中存在CD133+/EGFRvⅢ+共表达细胞,其与胶质瘤的恶性程度及患者生存时间有关,本研究为脑胶质瘤的靶向治疗提供了潜在新的靶点.
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EGFRvⅢ特异性单链抗体的制备及其靶向性能
目的:应用噬菌体展示技术筛选出能与EGFRvⅢ特异性结合的单链抗体(single-chain Fv,scFv),并研究其靶向性能.方法:构建EGFRvⅢ特异性scFv噬菌体库,ELISA筛选阳性克隆,阳性EGFRvⅢ-scFv质粒重新克隆人pCANTAB-Throm-bin-His载体,转化E.coli HB2151,IPTG诱导可溶性EGFRvⅢ-scFv表达.间接免疫荧光及裸鼠活体成像技术鉴定EGFRv Ⅲ-scFv与EGFRvⅢ的特异性结合.结果:成功构建了EGFRvⅢ-scFv噬菌体库,ELISA筛选得到16个EGFRvⅢ-scFv克隆,取一克隆命名为EGFRvⅢ-scFv-2Al.EGFRvⅢ-scFv-2Al质粒重新克隆人pCANTAB-Thrombin-His载体,成功表达可溶性EGFRvⅢ-scFv-2Al.EGFRvⅢ-seFv-2Al在体外可特异性结合HuH7-EGFRvⅢ肝癌细胞,但不结合HuH7-EGFR和HuH7肝癌细胞;荧光标记的EGFRvⅢ-scFv-2Al裸鼠体内可特异性结合U87MG-EGFRvⅢ胶质瘤细胞移植瘤,而不结合U87MG细胞移植瘤.结论:成功制备的EGFRvⅢ-scFv-2Al可特异性靶向结合EGFRvⅢ,在肿瘤的诊断和靶向治疗中具有潜在应用价值.
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EGFRvⅢ/CAR-T对EGFRvⅢ+U87胶质瘤细胞和裸鼠移植瘤的特异性杀伤作用
目的:制备靶向EGFRvⅢ的第三代CAR-T(EGFRvⅢ/3CAR-T),检测其在体外和体内对EGFRvI+ U87胶质瘤细胞的特异性杀伤效应.方法:用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染HEK293T细胞包装EGFRvⅢ/3CAR慢病毒(LV-EGFRvⅢ/3CAR),感染健康人CD3+T细胞,Western blotting和流式细胞术检测T细胞中EGFRvⅢ/3CAR的表达水平,51Cr释放法检测EGFRvⅢ/3CAR-T对EGFRvⅢ+ U87细胞的体外杀伤效应,ELISA法检测EGFRvⅢ/3CAR+T的IFN-γ分泌水平.构建裸鼠异种胶质瘤移植模型,检测EGFRvⅢ/3CAR-T对移植瘤的体内杀伤活性.结果:EGFRvⅢ/3CAR慢病毒包装成功,滴度值为5×106 TU/ml.Western blotting在相对分子质量58 000处检测到EGFRvⅢ/3CAR表达,未转导组无相同分子量蛋白表达.流式细胞术检测结果显示EGFRvⅢ/3CAR转导效率平均为52.3％,51Cr释放法检测EGFRvⅢ/3CAR-T特异性杀伤作用与E∶T值(E∶T为4∶1、为8∶1、16∶1、32∶1)呈正比关系.ELISA法检测到细胞因子IFN-γ分泌量为(1 836±148.2) pg/ml,与NTT和GFP+T细胞相比差异有统计学意义(P＜0.01).EGFRvⅢ/3CAR+T细胞的特异性杀伤活性及IFN-γ分泌均依赖于EGFRvⅢ在U87细胞中的表达水平.体内肿瘤生长检测结果显示,注射后3周EGFRvⅢ/3CAR+T组肿瘤体积较GFP+T细胞和PBS组差异有统计学意义(P＜0.01).结论:EGFRvⅢ/3CAR-T在体外和体内均能发挥靶向杀伤EGFRvⅢ+脑胶质瘤细胞的作用,为后续临床试验提供依据.
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EGFRvⅢ与S100A9在人脑胶质瘤中的表达、相关性及其与预后的关系
目的:探讨表皮生长因子受体变异体Ⅲ (epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRv Ⅲ)和S100钙结合蛋白A9 (S100 calcium binding protein A9,S100A9)在人脑胶质瘤组织中的表达水平及其相关性,以及2种蛋白表达与胶质瘤预后的关系.方法:收集重庆医科大学第二附属医院2008年1月-2015年4月收治的110例经病理确诊的新发胶质瘤标本及其临床资料.同时,收集10例非肿瘤脑组织作为对照.采用免疫组织化学法检测胶质瘤标本和对照脑组织中EGFRv Ⅲ和S100A9蛋白的表达水平,运用Spearman等级相关分析法分析蛋白表达与胶质瘤患者临床病理因素的相关性.随访其中75例胶质瘤患者,实访67例,采用Kaplan-Meier法对随访资料进行生存分析.结果:低级别胶质瘤(Ⅰ～Ⅱ级)中EGFRv Ⅲ的中高表达率为20.00％,而高级别胶质瘤(Ⅲ～Ⅳ级)中EGFRv Ⅲ的中高表达率为38.00％,两者差异有统计学意义(P＜0.001);低级别胶质瘤(Ⅰ～Ⅱ级)中S100A9的高表达率也明显低于高级别胶质瘤(Ⅲ～Ⅳ级)中S100A9的高表达率(11.67％ vs 66.00％,P＜0.001).EGFRvⅢ和S100A9蛋白表达水平之间呈明显的正相关性(rs=0.785,P＜0.001).Kaplan-Meier生存分析表明,EGFRvⅢ和S100A9蛋白均表达阳性的胶质瘤患者的预后较差(P=0.002).结论:EGFRv Ⅲ和S100A9蛋白均随着胶质瘤恶性等级升高而表达增强.联合检测EGFRvⅢ和S100A9蛋白水平可以有效判断胶质瘤患者的恶性程度及预后,有助于为胶质瘤患者制定个体化的治疗方案.
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舌癌细胞 exosome 中致癌因素的细胞间转移研究
目的：观察人舌癌细胞Tca8113来源exosome与人正常口腔黏膜上皮细胞间进行致癌因素的细胞间转移，探索正常口腔黏膜上皮细胞是否是舌癌细胞exosome的靶细胞。方法构建含有EGFRvⅢ绿色荧光蛋白表达载体，用脂质体转染入舌癌细胞Tca8113，倒置荧光显微镜下观察转染情况；采用超滤离心结合蔗糖密度梯度超速离心的方法从已转染舌癌细胞的培养上清液中分离出exosome，在透射电子显微镜下观察确认；将ex-osome与人正常口腔黏膜上皮细胞共培养，倒置荧光显微镜下观察人正常口腔黏膜上皮细胞是否能摄取exo-some。结果重组质粒pEGFP-N1-EGFRvⅢ转染的舌癌细胞在倒置荧光显微镜下呈现绿色荧光；透射电子显微镜下观察exosome 具有特征性的盘状结构，由双层膜构成，直径在30～100nm之间；exosome与口腔黏膜上皮细胞共培养2h后，黏膜上皮细胞荧光显微镜下观察到绿色荧光。结论成功分离人舌癌细胞exosome，人正常口腔黏膜上皮细胞是人舌癌细胞exosome的靶细胞，exosome能进行致癌因素的细胞间转移。
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CD133、EGFRvⅢ在人脑胶质瘤组织中的共表达及临床意义
目的 探讨CD133、EGFRvⅢ在人脑胶质瘤组织中的共表达及临床意义.方法 选择行手术治疗的脑胶质瘤患者40例,采用免疫组化双重染色法检测其脑胶质瘤组织中的CD133、EGFRvⅢ表达.结果 40例患者脑胶质瘤组织中的CD133+细胞、EGFRvⅢ+细胞阳性表达率分别为100％、40％,二者双染阳性表达率为35％.CD133呈棕黄色,位于细胞质和细胞膜上,多数阳性细胞在肿瘤组织中散在分布,部分呈聚集现象;EGFRvⅢ呈深蓝色,主要分布在细胞膜上,细胞质中有少量分布;在肿瘤组织靠近血管区两种阳性细胞存在共聚集现象.结论 CD133、EGFRvⅢ在脑胶质瘤组织中的分布具有相关性,在细胞水平上存在共表达,二者可以成为胶质瘤干细胞治疗的分子靶点.
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EGFR及其下游通路在胶质瘤治疗中的 研究进展
0引言神经胶质瘤约占颅内原发恶性肿瘤的40%,多形性胶质母细胞瘤( GBM)是神经胶质瘤中常见、恶性程度高的一种类型,预后极差,超过90%的GBM是原发性GBM,绝大部分患者在确诊后的生存期只有一年,两年生存期的患者小于10%[1].在GBM中频繁出现人类表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和它的突变体(epidermal growth factor receptor typeⅢvariant,EGFRvⅢ)的扩增和过表达,单一的和联合的EGFR靶点治疗方法虽然在实验室的研究已经获得成功,但是临床试验却显示GBM患者生存率改善不明显[2].本文将综述胶质瘤中EGFR靶点治疗耐药和放疗耐受的研究进展.
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EGFRvⅢ的表达对吉非替尼作用卵巢癌SKOV3细胞敏感性的影响
目的:探讨EGFRvⅢ的表达与卵巢癌SKOV3细胞对化疗药吉非替尼敏感性之间的关系,为临床治疗并合理选用抗肿瘤药物提供参考.方法:将质粒pcDNA4/TO-EGFRvⅢ稳定转染入SKOV3细胞,并用zeoein抗生素筛选出稳定表达EGFRvⅢ蛋白的细胞株(命名为SKOV3-EGFRvⅢ),用MTT法检测转染稳定株和原始株在吉非替尼作用下细胞的存活能力.然后,以吉非替尼分别对2株细胞建立的裸鼠异体肿瘤模型进行治疗,通过测量肿瘤体积大小评价肿瘤模型对吉非替尼的敏感性.结果:通过Western blot鉴定,SKOV3-EGFRvⅢ稳定株建立成功:MMT法结果表明SKOV3 EGFRvⅢ细胞在吉非替尼的作用下,其死亡率低于原始细胞株,且吉非替尼对SKOV3-EGFRvⅢ细胞建立的裸鼠肿瘤模型的抑制效果明显低于原始细胞株.结论:EGFRvⅢ的过表达导致卵巢癌SKOV3细胞及其体外移植肿瘤模型对化疗药吉非替尼的敏感性减弱.
