HPV外壳蛋白L1 B细胞共同表位短肽免疫学特性研究

目的:明确一种人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)外壳蛋白L1 B细胞共同表位短肽作为HPV疫苗发展的可能性.方法:通过对几种主要致病型别HPV外壳蛋白L1 的三维结构及其氨基酸序列的分析,构建HPV外壳蛋白L1 B细胞共同表位短肽疫苗,以该短肽对动物进行免疫接种诱导抗短肽抗血清,再用ELISA、SDS-PAGE电泳、Western blot及免疫组化等方法对短肽和抗短肽血清的免疫学特性进行检测.结果:短肽自身免疫原性较差,而短肽与Furend's完全佐剂合用免疫动物则能诱导较高滴度的抗短肽血清并且该抗血清能与多种型别HPV蛋白发生反应.结论:HPV外壳蛋白L1 B细胞共同表位短肽有望作为HPV疫苗候选物.

Syncytin在妊娠高血压疾病胎盘组织中的表达及与围生结局的相关性研究

目的 探讨胎盘组织中Syncytin的表达在妊娠高血压疾病发病中的作用及与围生结局的相关性.方法 采用Westem blot法、免疫组化方法测定syncytin蛋白表达水平与定位,并与围生结局进行相关性分析.结果 子痫组、重度子痫前期组、轻度子痫前期组及妊娠期高血压组的Syncytin蛋白表达水平分别为(8.2±0.6)、(9.1±0.4)、(10.8±0.8)及(11.4±0.4),均显著低于正常对照组(20.1±2.2),差异有统计学意义;子痫组与重度子痫前期组差异无统计学意义,轻度子痫前期与妊娠期高血压组差异无统计学意义,其余组别两两之间差异均有统计学意义;Syncytin蛋白定位于胎盘组织滋养细胞的细胞浆内,Syncytin蛋白强阳性反应呈棕黄色;Syncytin蛋白的表达与24 h尿蛋白定量、收缩压、舒张压均存在负相关性;Syncytin蛋白表达与产后出血量相关性无统计学意义;各组新生儿体重比较,差异均有统计学意义,新生儿体重与Syncytin蛋白的表达水平无相关关系,但Syncytin蛋白表达有随体重增加而增加的趋势.结论 Syncytin可能与妊娠高血压疾病的发病和围生结局相关,可能是疾病发展程度的一个重要表达指标.

痰瘀通胶囊含药血清对HUVEC增殖及eNOS蛋白表达的影响

目的 观察痰瘀通胶囊含药血清对人脐静脉内皮细胞增殖及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达的影响,探讨其抗动脉粥样硬化及调脂的可能机制.方法 用SRB法检测痰瘀通胶囊含药血清对内皮细胞增殖的变化;用Western Blot法检测其对内皮细胞eNOS蛋白表达的变化.结果 痰瘀通胶囊含药血清能促进人脐静脉内皮细胞增殖,上调eNOS的蛋白表达水平.结论 痰瘀通胶囊含药血清通过上调eNOS的蛋白表达水平,促进内皮细胞增殖,具有保护血管内皮细胞的功能,从而达到抗动脉粥样硬化和防治高脂血症的作用.

增液汤干预干燥综合征模型鼠 AQP1／AQP8的表达规律研究

目的：观察增液汤干预下干燥综合征（Sjogren＇s Syndrome，SS）模型小鼠肺及结肠组织中水通道蛋白AQP1（aquaporin1）、AQP8（aquaporin8）的表达规律。方法：选用BALB/c小鼠，各组10只，免疫诱导法建立干燥综合征小鼠模型，产生SS特异性临床表现和病理改变，采用免疫组化和Western blot蛋白质印迹法观察增液汤对SS模型小鼠肺及结肠组织中AQP1/AQP8表达的影响。结果：增液汤可以增强肺及结肠组织中AQP1的蛋白表达（ P＜0.01），对AQP8无影响。结论：AQP1在干燥综合征模型鼠多组织中的表达下调，可能是干燥综合征水液代谢障碍，多脏器损伤的机制之一；增液汤恢复机体阴液，起到“增水”功效可能与上调AQP1蛋白表达有关。

异常黑胆质成熟剂对人增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β1表达的影响

目的:观察不同浓度异常黑胆质成熟剂(ASMq)对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞(HSFBs)转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白及mRNA表达的影响,在分子水平上探讨其抑制增生性瘢痕生长的作用机制.方法:体外培养人HSFBs,选取第3-5代细胞采用含不同浓度异常黑胆质成熟剂(200、400、600μg/mL)的DMEM培养液培养48h,运用RT-PCR技术检测各组TGF-β 1 mRNA表达水平.运用Western bolt方法测量TGF-β 1蛋白表达水平.结果:与对照组相比,3个药物剂量组HSFBs TGF-β 1蛋白及mRNA的表达均减少(p＜0.05),药物浓度为400μg/mL时效果佳,且TGF-β 1蛋白及mRNA表达的变化具有一致性.结论:ASMq有抑制体外培养的人HSFBs TGF-p 1表达的作用,初步探讨了ASMq发挥抑制增生性瘢痕生长的作用机制,为ASMq药物的开发利用提供理论依据.

杨梅醇对人肝癌HepG2细胞Caspase-9、Bcl-2、p21和Bax表达水平的影响

目的:检测杨梅醇体外对人肝癌HepG2细胞肿瘤相关基因表达的影响.方法:采用qRT-PCR和Westemblot分别检测杨梅醇处理前后HepG2细胞肿瘤相关基因在mRNA和蛋白质水平的表达变化.结果:杨梅醇降低了Caspase-9和Bcl-2基因和蛋白的表达水平,同时提高了p21基因和蛋白以及Bax蛋白的表达水平.结论:杨梅醇通过下调Caspase-9和Bcl-2基因表达,同时上调p21和Bax基因表达而发挥抑制HepG2细胞增殖的作用.

化瘀通络中药对肾衰大鼠肾组织CTGF蛋白表达的实验研究

目的:采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测化瘀通络中药肾络通对5/6肾切除肾衰大鼠残余肾结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达的影响.方法:5/6肾切除制备肾衰大鼠模型,随机分为假手术组、模型组、肾络通组和缬沙坦组,分别灌胃给药16周取材,应用Western Blot法检测肾组织CTGF蛋白的表达.结果:模型组与假手术相比,CTGF蛋白的表达明显增高;肾络通组CTGF蛋白表达较模型组显著降低.结论:肾络通可使慢性进展性纤维化肾组织CTGF蛋白表达下调,延缓5/6肾切除肾衰大鼠的病程进展,提示以CTGF为切入点,运用不同的有效中药组方对其加以研究,将为肾纤维化防治提供新的思路.

吴茱萸致小鼠肝毒性分子机制研究

目的:研究吴茱萸提取物致小鼠肝毒性的分子机制.方法:30只KM小鼠随机分为3组,连续灌胃给予吴茱萸提取物15 d后,Western blot法检测小鼠肝脏Erk1/2,CDK8,CK1e,Stat3,Src蛋白表达量.结果:吴茱萸提取物导致Erk1/2,CDK8,CK1e表达量上调(P＜0.01),Stat3,Src表达量下调(P＜0.01).结论:吴茱萸致肝毒性分子机制可能与Erk1/2,CDK8,CK1e,Stat3和Src信号分子相关.

人参总皂苷对γ射线照射后大鼠肝P450酶调节作用研究

该研究用5.5Gy的γ射线照射大鼠,用Cocktail探针法结合液质联用、qPCR和Western blot法检测P450各个同工酶的酶活性、mRNA和蛋白表达来评价人参总皂苷对γ射线照射后大鼠肝P450酶调节作用.结果发现,辐射组CYP1 A2,2B1,2E1,3A4与空白组相比,表达增加;人参总皂苷组CYP1 A2,2B1,2E1,3A4与辐射组相比,表达下降.表明人参总皂苷对辐射诱导大鼠P450酶上调起到反向干预作用.

决明子水提液对大鼠肝脏CYP450酶的影响

该文研究决明子水提液对大鼠肝脏CYP450酶酶活性、mRNA及蛋白表达水平的影响.取SD大鼠,口服灌胃受试药物后,处死,用冰冷生理盐水灌流肝脏,提取大鼠肝脏微粒体、肝脏总RNA和总蛋白,采用Cocktail体外孵育法结合液质联用(LC-MS)技术对大鼠肝脏中CYP1 A2,2B1,2C11,2D2,2E1,3A1各亚酶的酶活性进行测定,并应用荧光定量PCR技术和Western blot对上述亚型的mRNA和蛋白表达水平进行检测.结果表明,酶活性方面,决明子水提液组与空白组比较可明显诱导CYP1 A2,2B1,2C11,2D2,2E1,3A1的酶活性,其中决明子低剂量组对CYP2D2有明显的抑制作用,中、高剂量组对CYP2D2有明显的诱导作用,且都呈剂量依赖性增加,但对CYP3A1的诱导不呈剂量依赖性;mRNA表达方面,决明子水提液对CYP1 A2,2C11,2D2,2E1mRNA的表达具有显著诱导作用,其中对CYP1 A2,2D2,2E1诱导作用呈剂量依赖性,与酶活性水平具有一致性,对CYP2B1,3A1没有明显作用;蛋白表达方面,决明子水提液对CYP2C11,2E1的表达也具有诱导作用,但没有统计学差异.决明子水提液对CYP450同工酶不同程度诱导或抑制作用,特别是对于CYP2C11,2E1亚型酶,酶活性与mRNA,蛋白表达水平具有一致性,提示当与这些酶底物合并用药时,尤其是与CYP2C11,2E1代谢有关的药物合用时,应充分考虑到潜在的有益和不利的药物相互作用.

SARS冠状病毒结构蛋白在血清学诊断中潜在应用价值的比较

为了确定特异的SARS抗体检测抗原,比较了SARS冠状病毒(SARS-CoV)主要结构蛋白与SARS患者血清的反应性.从SARS死亡患者的肺组织提取的总RNA为模板,用RT-PCR技术分别扩增S、N、M和E 4种结构蛋白基因,对3种S截短突变体和N、M、E的重组蛋白在大肠杆菌中进行表达.以表达的蛋白为抗原,应用Westernblot跟踪检测11例SARS患者血清54份.结果显示:SARS-CoV的重组N蛋白和S蛋白有很强的抗原性,S蛋白的3个区段的抗原性强弱存在差异,S3抗原性强于S1和S2;在患病第1周、2周、3周及3周以上,N蛋白和S3蛋白抗体检出率分别为40%、65.2%、100%、100%和40%、61%、76.2%、100%;提示SARS-CoV重组N蛋白和S3蛋白在SARS的血清学诊断中有一定的应用价值.

一种基于链霉素沉淀的PrPSc检测方法的建立

建立一种新的基于链霉素沉淀的PrPSc的Western blot检测方法,用终浓度为60 mmol/L的链霉素处理蛋白酶K消化的PrPSc贮存液,通过离心沉淀PrPSc,用Western blot对PrPSc的链霉素富集效果进行检测.结果显示,链霉索能够与PrPSc结合形成高分子量复合物,但不影响糖基化形式.此外,基于链霉素沉淀的Western blot,无论是在低浓度或是大容积的条件下,均可显著地提高对PrPSc检测的敏感性.基于链霉素沉淀的Western blot试验是一种敏感、特异、快速及灵活的检测方法,有潜力用于脑组织、外周组织及体液中低水平的PrPSc的检测.

传染性法氏囊病病毒VP3抗原表位的鉴定

利用肽扫描技术对4株IBDV VP3的单克隆抗体(HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E)的抗原表位进行了研究.通过Western blot和ELISA鉴定,将HRB-3F和HRB-7B的抗原表位定位于VP3 109～119 aa(位于IB-DV聚合蛋白的864～874 aa),HRB-7C和HRB-10E的抗原表位定位于VP3 177～190 aa(位于IBDV聚合蛋白的932～945 aa).进一步检测其反应原性及免疫原性,结果表明,这两个表位均能与抗IBDV阳性血清反应.将这两个表位短肽免疫BALB/c小鼠,其血清可以和IBDV反应,具有较好的免疫原性.与D6948、HK46和UK661等多株IBDV相应区域的同源性进行了比较,结果显示,这两个表位在多种毒株中同源性为100%.通过IBDV VP3抗原表位的研究,筛出两个新的保守线性表位并进行精确定位,对进一步分析IBDV结构与功能以及建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法具有重要的意义.

黄地老虎颗粒体病毒enhancin-like基因的表达与增效功能研究

增效蛋白(ENHANCIN)是一种主要在昆虫杆状病毒中存在的杀虫增效因子,黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum granulovirus,AgseGV)基因组中有一个ORF的编码产物为杆状病毒ENHANCIN同源物,命名为enhancin-like.生物信息学分析结果表明,AgseGV的enhancin-like基因编码产物含有ENH ANCIN的保守域,无信号肽序列,不存在a螺旋跨膜区,在其C-末端拥有类似哺乳动物的脯氨酸富集区.为了确定AgseGV的ENHANCIN-like蛋白是否具有增效功能,构建了AgseGV的enhancin-like全基因和5′端片段(1017bp)的原核表达载体.利用层析技术纯化截短片段的原核表达产物,以其为抗原制备了抗体.利用自制抗体和His-tag抗体,Western blot检测了enhancin like全基因的表达产物.结果表明,在融合蛋白预期大小处显示出阳性条带,证明目的基因得到了良好的表达.以棉铃虫为供试虫进行生物测定,证明在棉铃虫核多角体病毒(HaNPV)浓度为1.17×102 PIBS/mL时,AgseGV enhancin-like的全基因原核表达产物能使其感染3龄初幼虫的死亡率提高16.25％,增效作用显著.但是,5′端截短片段的原核表达产物对HaNPV没有增效作用.

Objective A subcutaneous transplantation tumor model of human HT-29 cells in nude mice was established to evaluate anticarcinogenic activities, and the apoptosis-regulated mechanism effect of aqueous extract of fermented wheat germ with Lactobacillus plantarum dy-1 (LFWGE).
Methods The HT-29 cells were transplanted via subcutaneous injection of 1×107 cells into the right flank of each nude mouse. Then, nude mice were treated for 30 d with LFWGE (high-dose 2 g/kg/d;low-dose 1 g/kg/d) and for 7 d with 5-fluorouracil (5-FU, 25 mg/kg/d) by gavage and intraperitoneal injection, respectively. An inhibition of tumor growth was observed.
Results Tumor volume and weights decreased significantly in both groups of nude mice treated with LFWGE. In addition, the cell apoptosis rate of the LFWGE group (2 g/kg/d, 60.1%±4.4%; 1 g/kg/d, 58.6%±6.9%) was significantly higher than that of the control group (11.5%±1.6%) and 5-FU group (32.1%±3.5%) as measured by the TUNEL assay. Moreover, the real-time fluorescent quantitative PCR and Western blot method further confirmed these enhancing apoptosis and growth inhibition effects. The involvement of LFWGE in inducing apoptosis was confirmed by the expression of Bax, Bcl-2, Caspase-3, and CyclinD1.
Conclusion The results showed that LFWGE could induce subcutaneous transplantation tumor apoptosis in nude mice and could be as a natural nutrient supplements or chemopreventive agent in the treatment of human colon cancer.

NGF及其受体P75在四氯化碳中毒性大鼠肝组织中表达增强

目的 观察四氯化碳中毒时神经生长因子(NGF)及其受体P75在大鼠肝组织的表达变化,探讨NGF在肝纤维化发生机制中的可能作用.方法 用四氯化碳致大鼠肝中毒模型,用RT-PCR法和Western blot法,分别检测NGF 及其受体P75在大鼠肝组织中的表达.结果 与对照组大鼠肝组织中NGF mRNA及其受体P75蛋白表达量比较,造模组24 h显著增高(P＜0.01,n=6),造模48 h和72 h迅速回降,但仍显著高于对照组(P＜0.05,n=6).结论 在四氯化碳中毒性大鼠的肝组织中,NGF及其受体P75的表达可能与肝纤维化的形成密切相关.

NSBP1基因干扰RNA慢病毒载体的构建及效应检测

目的 构建和鉴定NSBP1基因RNA干扰慢病毒表达载体.方法 针对NSBP1 mRNA设计了3条siRNA,并构建pGCSIL-GFP-NSBP1慢病毒质粒,测序鉴定.用pGCSIL-GFP-NSBP1、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度.将慢病毒转染前列腺癌DU145细胞,Western-blot检测NSBP1表达,MTT法检测细胞生长活性,用转染细胞种植裸鼠成瘤,观察抑瘤效果.结果 PCR和测序证实,成功构建LV-shNSBP1的慢病毒载体,病毒滴度达2×10~8TU/mL.转染细胞中NSBP1蛋白表达显著降低,且MTT检测细胞生长活性明显减慢,转染细胞在裸鼠体内成瘤率没有影响,但对肿瘤的生长有明显抑制作用.结论 人NSBP1基因RNA干扰慢病毒载体构建成功,且NSBP1对前列腺癌激素非依赖DU145细胞的生长具有重要作用.

人CD23基因的扩增及其在HEK 293T细胞的高效表达

目的 建立一个有效表达CD23的系统.方法 采用RT-PCR方法,从外周血淋巴细胞中扩增人的CD23 cDNA基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1B上,构建成pcDNA3.1/CD23 质粒表达载体;将pcDNA3.1/CD23质粒转染HEK293T细胞,通过流式细胞仪和Western blot检测CD23在细胞中的表达情况.结果 扩增的CD23 cDNA序列与文献报道的一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了CD23 cDNA在293T细胞膜上的表达.转染效率达80%以上,并获得了较高水平的表达.结论 扩增CD23 cDNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了CD23在HEK293T细胞的高效表达.

Tropic1808在PC12细胞中的表达

目的构建稳定表达tropic1808基因的PC12细胞株,并通过观察稳定株中高分子量神经丝蛋白(NFH)的表达以初步观察该基因的作用. 方法构建重组真核表达载体pcDNA-HA-tropic 1808,转染PC12细胞,经G418筛选、Western blot鉴定.采用RT-PCR,实时PCR,Westem blot和细胞组织化学方法观察tropic1808稳定株中NFH的表达.结果Western blot检测表明,tropic1808基因稳定表达,RT-PCR,实时PCR,Western blot和细胞组织化学方法均观察到NF-H在tropic1808稳定株中的表达高于空载体对照.结论Tropic1808基因可以在PC12稳定表达且NF-H在tropic1808稳定株中表达上升.

弓形虫ROP21基因的原核表达与免疫学鉴定

目的 原核表达弓形虫棒状体ROP21基因,并对rROP21蛋白进行免疫学鉴定. 方法 根据已发表的ROP21基因序列设计引物,通过RT-PCR方法扩增弓形虫RH株的ROP21基因.将ROP21基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)后转化大肠埃希菌BL21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达目的蛋白,纯化后进行SDS-PAGE分析、Western blot及IFA分析. 结果 经PCR和酶切鉴定,成功构建重组表达载体.重组质粒转化BL21(DE3)后经IPTG诱导,重组蛋白(rROP21)以包涵体形式高效表达,分子质量单位约为45 ku.Western blot显示重组rROP21蛋白能被his标签抗体及弓形虫病患者血清识别.用rROP21免疫小鼠,获得滴度为1∶104的抗体血清.IFA显示弓形虫速殖子体内存在ROP21蛋白. 结论 构建的重组质粒pET28a ROP21表达的弓形虫rROP21具有抗性,可作为血清学诊断候选抗原,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.