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实时PCR检验在高危型人乳头瘤病毒中的诊断价值分析
目的:研究高危型人乳头瘤病毒患者采取实时PCR检验的诊断价值.方法:选择我院2015年7月-2017年10月纳入的80例高危型人乳头瘤病毒患者,按照随机数字法分为两组各40例,研究组采取实时PCR检验,对照组采取第二代杂交式捕获法(HCⅡ),对比两组诊断结果.结果:研究组检出率90.00％ 高于对照组检出率77.50％,差异有统计学意义(P<0.05).结论:高危型人乳头瘤病毒患者采取实时PCR检验效果显著,有效提高检出率,为临床治疗及预后提供保障,值得临床推广及应用.
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应用Taqman实时PCR法检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌
目的 建立敏感快速的检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌的实时PCR方法.方法 以hlyA基因为靶标,建立并验证实时PCR法的特异性.选用单核细胞增生李斯特菌CMCC 54004,制备不同浓度的纯菌液,用实时PCR进行检测,制作标准曲线并计算扩增效率.进行人工染菌实验,染菌量分别为每25g猪肉样本1.3 ×l00、1.3 ×101、1.3×102、1.3×103、1.3×104、1.3 ×105和1.3×106 CFU.分别在增菌0、4、8、12、18、24、30、36和46 h取1 ml培养液,提取DNA进行实时PCR检测,并用PCR和传统方法进行检测,比较3种方法检测的敏感性和特异性.采集24份市售猪肉样本,用这3种方法进行检测,进一步比较三者的阳性检出率.结果 建立的实时PCR法特异性好,对纯菌液的检出限为1.3 × 103 CFU/ml.人工染菌样本增菌24 h后,实时PCR检出限1.3 CFU/25 g,PCR及传统方法达到这一检出限需要增菌46 h.根据增菌24 h的检测结果,建立实时PCR样本标准曲线.24份猪肉样本,实时PCR检出17份阳性,阳性率70.83％ (17/24),与PCR和传统方法的阳性率一致.根据所得的样本标准曲线,对检测样本进行定量分析,确定了阳性样本中初始含量菌.结论 所建立的实时PCR具有快速简便、敏感特异等优点,整个操作可在27 h内完成,适用于猪肉中单核细胞增生李斯特菌的快速定量检测.
关键词： 实时PCR 单核细胞增生李斯特菌 检测 猪肉 -
阪崎肠杆菌zpx基因的分子信标-实时PCR技术研究
目的 建立分子信标-实时PCR技术检测婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速方法.方法 在PCR反应体系中加入分子信标探针,探针的5′端标记FAM,3′端标记TAMRA,建立阪崎肠杆菌zpx基因分子信标-实时PCR技术快速检测方法.结果 检测方法特异性强,无非特异性扩增；分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为180fg/PCR反应体系,纯阪崎肠杆菌菌液的检出限为102 CFU/ml,无交叉反应；以此反应体系检测23份样品,其中2份为阳性,余未检出,与传统检测方法结果一致.结论 分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速检测.
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Tropic1808在PC12细胞中的表达
目的构建稳定表达tropic1808基因的PC12细胞株,并通过观察稳定株中高分子量神经丝蛋白(NFH)的表达以初步观察该基因的作用. 方法构建重组真核表达载体pcDNA-HA-tropic 1808,转染PC12细胞,经G418筛选、Western blot鉴定.采用RT-PCR,实时PCR,Westem blot和细胞组织化学方法观察tropic1808稳定株中NFH的表达.结果Western blot检测表明,tropic1808基因稳定表达,RT-PCR,实时PCR,Western blot和细胞组织化学方法均观察到NF-H在tropic1808稳定株中的表达高于空载体对照.结论Tropic1808基因可以在PC12稳定表达且NF-H在tropic1808稳定株中表达上升.
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实时PCR仪中温度控制的计算与模拟
本研究自行设计了一个PCR反应池的模型,并对该反应池和反应样品的温度进行了理论计算,在此基础上进行了温度场动态分布仿真分析,仿真结果与理论计算相吻合,为自行设计的实时PCR仪的研发提供了理论基础.
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急性白血病MLL融合基因新检测方法的建立和应用
本研究旨在建立一种快速检测急性白血病中常见MLL融合基因的方法.针对10种常见的MLL融合基因,首先通过检索文献及数据库,确定已报道的所有融合形式并据此设计引物和探针.其次,以构建的16个阳性质粒和阴性细胞系建立和优化多重实时PCR检测体系.后,利用所收集的54份白血病标本对该体系进行临床评估,并对检出的阳性标本进行测序验证.结果:该体系可对所有阳性质粒进行有效检测,且灵敏度均可达10个拷贝.在54份标本中,检出MLL-AF4、MLL-AF9、MLL-AF10、MLL-ELL4种类型的融合基因,对阳性标本进行测序,测序结果与检测结果一致.结论:本研究建立了一种筛查MLL融合基因的多重实时PCR方法,能够对发生频率约占MLL融合类型90％的10种融合基因进行检测.该体系具有快速、灵敏、特异、可靠的优点,将有助于临床上MLL融合基因阳性患者的诊断和管理.
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急性髓系白血病CBFB-MYH11融合基因检测新方法的建立和应用
本研究建立急性髓系白血病CBFB-MYH11融合基因检测新方法并探讨其应用价值.通过检索文献及数据库,确定已报道CBFB-MYH11融合基因的所有融合形式,据此设计引物和探针并构建了3个阳性质粒和阴性细胞系作为对照,完成多重实时PCR扩增CBFB-MYH11融合基因和GUSB(内控基因)的检测体系.使用该体系对58份急性髓系白血病标本进行分析并对所有检出的阳性标本进行测序验证.PCR扩增结果显示,本方法可对所有阳性质粒进行有效检测,且灵敏度均可达10个拷贝；在58份标本中,检出4份阳性标本,阳性率6.9％,分别为A型和J型.与染色体核型分析结果相比,本方法多检出了1例阳性标本；与测序相比,结果均一致.结论:本研究建立的逆转录多重PCR检测体系可用于筛查所有融合形式的CBFB-MYH11融合基因,具有快速、全面、灵敏、可靠的优点,有助于临床上CBFB-MYH11融合基因阳性患者的诊断和疗效评价.
关键词： 急性髓系白血病 CBFB-MYH11融合基因 实时PCR -
实时PCR定量分析体内基因转染效率的可行性
为了探索实时PCR技术评价基因转染效率的可行性,利用克隆PCR检测逆转录病毒载体介导的neo基因导入原代成肌细胞的转染效率,同时行实时PCR检测,对二者结果进行对比分析;利用线性扩增介导的PCR(LAM-PCR)技术和逆转录病毒5′LTR插入细胞基因组位点的分析,确定单细胞内基因转染的拷贝数.结果显示:①在低转染率的情况下(<36%)二者的结果相近,但是在高转染率情况下二者的结果差别明显; ②逆转录病毒载体介导的转染,在原代成肌细胞中为单拷贝基因导入基因组内.结论:实时PCR可以比较精确地估计体内病毒载体介导的基因转染效率;而在体外由于多为高转染率,不适合用此方法进行检测.
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快速检测副溶血弧菌及其毒力株方法的建立
目的 利用实时PCR技术,建立检测副溶血弧菌及其毒力株的方法.方法 根据副溶血弧菌的跨膜转录激活蛋白toxR基因序列设计引物和改良分子信标(ROX标记),建立检测所有副溶血弧菌菌株的方法.通过与文献报道的检测直接耐热溶血素(TDH)基因的实时PCR体系合并,建立了同时检测副溶血弧菌及其毒力株的双重实时PCR方法.结果 通过对9个属的101株菌株进行试验,所有的52株副溶血弧菌均产生ROX阳性信号(toxR+),其余菌株均检测为阴性,其中46.2%(24/52)的副溶血弧菌产生HEX阳性信号(tdh+).检测toxR基因的实时PCR体系DNA灵敏度为10～100 fg/PCR体系,菌液灵敏度为59.2～592 CFU/ml或2.96～29.6 CFU/PCR体系.另外成功构建了双重实时PCR体系,能同时对副溶血弧菌的toxR和tdh基因进行检测.结论 建立的双重实时PCR体系能同时检测副溶血弧菌及其毒力株,从而为食品的安全检疫提供有效手段.
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LNA 探针实时荧光定量 PCR 检测HBV DNA 的研究
目的建立一种LAN探针实时荧光定量PCR检测血清/血浆中乙型肝炎病毒（ HBV） DNA的方法。方法建立LAN探针实时荧光定量PCR准确定量检测HBV DNA的方法，以TaqMan探针法为对照，进行LNA针实时PCR的方法学评价。用LNA探针法和TaqMan探针法两种方法检测39例慢性乙型肝炎患者血清样品，对检测结果进行比较。结果相对于普通的TaqMan探针法，LAN探针实时荧光定量PCR检测HBV DNA具有更宽的检测范围、更高的灵敏度、稳定性、扩增效率和更低的探针浓度。在15例单纯HBsAg （＋）标本中，有4例TaqMan探针实时PCR检测为HBV DNA为阴性，LNA探针法检测为阳性（ P＜0.05）。应用LNA探针法和TaqMan探针法检测35份HBV DNA阳性血清样本，结果表明LNA探针法和TaqMan探针法具有很好的可比性（ r＝0.9636，P＜0.05）。结论 LNA探针实时PCR比TaqMan探针法有更高的灵敏度、稳定性、扩增效率和较低浓度的探针浓度，是一种更为可靠的检测HBV DNA的方法。
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OmpA-VS2为靶基因的非标记实时荧光PCR检测沙眼衣原体感染
目的 建立一种以OmpA-VS2为靶基因的非标记实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法,以检测沙眼衣原体.方法 设计15种型别沙眼衣原体通用引物,对OmpA-VS2进行套式PCR扩增和实时荧光PCR检测,并对其敏感性、特异性进行评价,并用临床标本进行验证.结果 15种型别沙眼衣原体均扩增出168bp的目的片段;敏感性为每个反应1个拷贝.特异性分析可见,与10种泌尿生殖道病原体和共生菌均没有交叉反应.临床标本验证的结果显示,该方法与以质粒为靶基因的核酸扩增检测的Amplicor CT/NG方法的检测结果一致.结论 该方法具有敏感性高、特异性强、扩增后无需PCR后处理等特点,可望用于临床与防治项目中沙眼衣原体的检测.
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实时荧光PCR法检测DPYD*9等位基因的单核苷酸突变
目的:建立一种简便、特异的对二氢嘧啶脱氢酶基因DPYD*9进行等位基因分型的方法.方法:以DPYD基因为靶合成含突变位点的野生型引物WF、突变型引物TF和共同的下游引物R,用DNA荧光嵌入染料SYBR Green Ⅰ进行荧光PCR扩增,对产物进行溶解曲线分析以确定基因型;同时优化了引物浓度,分析其灵敏度并与普通PCR进行了比较,对20份PCR产物进行了验证.结果与结论:以野生型基因组为模板时,WF和R组合有荧光响应,而TF和R组合无荧光响应;当以突变型基因组为模板时,TF和R组合有荧光响应,而WF和R组合无荧光响应.两者Ct 值均为24,Tm值均为83oC.优化引物浓度为0.25 μmol/L,荧光PCR可分出10个模板拷贝数的基因型,而普通PCR只能区分模板为8.0×102拷贝数的基因型.PCR产物测序证实荧光PCR法与直接测序结果一致.该方法能准确快速地区分DPYD*9的基因型,敏感性和特异性强.
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Hendra病毒的实时PCR检测方法的建立
目的:建立针对Hendra病毒的敏感、特异和快速的实时PCR法,为Hendra病的早期诊断提供依据.方法:采用常规PCR法和实时PCR法分别对构建的Hendra病毒全长G基因的重组质粒DNA进行扩增,并比较两种方法的敏感性.结果与结论:应用常规PCR方法可检测到100 fg/μl的含Hendra病毒特异序列的重组质粒DNA,而实时PCR法则可检测到0.1 fg/μl的DNA,后者的敏感性比常规PCR法的提高了1 000倍,该方法不但操作上更加简便、快速,还可避免交叉污染,适于对Hendra病毒特异序列的检测.
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实时逆转录聚合酶链反应定量检测人 TNF-αmRNA的表达
目的建立一种快速、灵敏、特异定量检测人外周血单个核细胞(PBMC)表达TNF-α mRNA的方法.方法根据Gene Bank中TNF-α mRNA序列和MGB探针荧光定量分析原理,设计合成特异的引物和探针,优化实验条件,建立定量检测人TNF-α mRNA的实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并对10名健康体检者PBMC PHA刺激前后进行TNF-α表达检测.结果本法灵敏度为103拷贝/毫升、线性检测范围达6个数量级(103～109拷贝/毫升);特异性好,PCR产物电泳后无非特异性条带产生,非目的扩增产物用本法进行检测,均无荧光信号响应;以Ct值计算变异系数(CV值),批内批间CV值均小于5%;10名健康体检者PBMC PHA刺激前后TNF-α mRNA的平均含量分别为10 4.15±0.49 和105.19±0.43拷贝/毫升.结论Taqman-MGB实时荧光RT-PCR定量检测人TNF-α mRNA表达水平,结果快速、准确、特异、灵敏,具有临床推广价值.
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HLA-G在子痫前期患者胎盘中的表达及意义
目的 探讨人类白细胞抗原G(HLA-G)在子痫前期患者胎盘组织中的表达及意义.方法 收集重度子痫前期患者(试验组)和正常妊娠者(对照组)胎盘各20例,采用实时荧光定量PCR检测两组胎盘组织中HLA-G的表达水平,并观察两组胎盘的病理变化.结果 子痫前期患者胎盘组织中HLA-G基因表达水平低于正常妊娠组,两组差异有显著性(P=0.008)；子痫前期组与正常妊娠组孕妇相比,胎盘绒毛间质血管数及绒毛数平均值减少,合体滋养细胞结节增多,绒毛间质纤维化及纤维索样坏死显著增多,细胞滋养细胞明显增生,干绒毛小动脉管腔直径变小；相关分析显示,HLA-G表达强度与胎盘绒毛血管密度呈正相关(P=0.000,R =0.900).结论 子痫前期患者胎盘HLA-G的表达明显下降,且与胎盘病理改变呈正相关,提示HLA-G可能与子痫前期的病理生理过程密切相关.
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恩诺沙星对鸡细胞色素P450 1A5表达的影响
目的 观察恩诺沙星对鸡细胞色素P450 1A5(CYP1A5)表达的影响,为揭示兽药残留的产生机制以及临床安全联合用药提供理论依据.方法 各实验组分别给予恩诺沙星5 mg/kg(低剂量组)、25 mg/kg(中剂量组)和125me/kg(高剂量组);对照组给予相同体积的生理盐水.给药5 d后检测鸡肝微粒体蛋白含量、CYP450含量、CYP1A5 mRNA及蛋白表达量的变化.结果 中、高剂量组的肝微粒体蛋白含量、CYP450含量、CYP1A5 mRNA及蛋白表达量与对照组相比分别下降14%、36%,5%、5%,9%、20%,37%、49%,差异均有显著性(P<0.05).结论 中、高剂量恩诺沙星对CYP1A5的表达呈现出抑制作用.
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大鼠血管组织血管紧张素原基因表达的实时PCR定量分析
目的:探讨大鼠血管组织血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)低丰度mRNA表达的实时PCR定量分析方法,并将其用于检测模拟失重大鼠基底和股动脉血管组织AGT mRNA的表达.方法:提取8周模拟失重(SUS)与对照组(CON)大鼠血管组织的总RNA,进行反转录后,对目的基因AGT与内参照基因GAPDH的mRNA进行实时PCR分析.应用TaqMan-MGB探针,测出上述mRNA实时PCR反应的放大效率(E)及阈循环数Ct,再依据一定数学模型由E与Ct得出经GAPDH归一化的AGT mRNA表达变化.结果:与CON相比,SUS大鼠基底动脉组织AGT mRNA表达增加240%,而股动脉组织则降低66%.结论:本工作为定量检测大鼠血管组织低丰度mRNA表达提示了一种特异、灵敏、精确、重复性好的简便方法.
关键词： 模拟失重 血管 局部肾素-血管紧张素系统 基因表达 实时PCR -
人脑胶质瘤中BMI1的表达及其意义
目的:研究基因BMI1在中枢神经系统常见的肿瘤-胶质瘤组织中的表达情况,并探讨其表达水平与胶质瘤的恶性程度及发生、发展的关系.方法:使用荧光定量实时PCR技术检测基因BMI1在34例各级别胶质瘤手术切除组织及10例正常对照组织中的表达.同时对34例各级别胶质瘤组织及10例正常对照脑组织使用免疫组化的方法检测BMI1蛋白的表达.结果:实时PCR的结果显示,基因BMI1在对照脑组织、Ⅱ级胶质瘤、Ⅲ级胶质瘤及Ⅳ级胶质瘤组织中的表达相对值分别为0.655、2.65、5.62及5.43.胶质瘤组中BMI1的表达水平显著高于对照组(P=0.001),恶性胶质瘤组(Ⅲ级与Ⅳ级胶质瘤)中BMI1的表达水平显著高于良性胶质瘤(Ⅱ级胶质瘤),P=0.015,Ⅲ级胶质瘤组与Ⅳ级胶质瘤组之间未发现存在差异(P=0.902);免疫组化结果显示,BMI1蛋白在对照脑组织、Ⅱ级胶质瘤、Ⅲ级胶质瘤和Ⅳ级胶质瘤组织中的表达阳性率分别为10%、25%、100%和100%.各级别胶质瘤组织中BMI1蛋白的阳性表达率显著高于正常脑组织对照组(P=0.001).而且在恶性胶质瘤组织中BMI1蛋白的阳性表达率显著高于良性胶质瘤(P=0.000).结论:无论是在mRNA水平还是在蛋白水平上,BMI1在各级别脑胶质瘤标本中的表达水平均明显高于正常脑组织对照,且恶性胶质瘤中BMI1的表达要明显高于良性胶质瘤.BMI1在胶质瘤的发生、发展过程中有重要作用.
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副溶血性弧菌tdh基因的分子信标PCR技术检测
目的 采用分子信标PCR技术进行副溶血性弧菌tdh基因检测.方法 在反应体系中加入分子信标探针,对13株副溶血性弧菌和其他细菌分别进行tdh基因实时和终点法荧光检测.结果 2株副溶血性弧菌和阳性质粒的终点法检测荧光值分别为114.9,95.2,90.0.实时PCR检测的CT值分别为26.2,26.8,32.0.其他肠道细菌终点法检测荧光值为47.0～69.1;CT值＞32.0或无值,与琼脂糖电泳分析结果一致.结论 分子信标PCR技术可以准确、快速、实时、简便地进行副溶血性弧菌tdh基因检测.
关键词： 副溶血性弧菌(VP) 分子信标 tdh基因 实时PCR -
霍乱毒素基因TaqMan实时PCR检测方法建立
霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的一种以急性水样便为特征的烈性肠道传染病[1].霍乱弧菌曾引起了7次全球大流行,以发病急、传播快和波及范围广为特征[2-3].霍乱弧菌的致病因子主要是霍乱肠毒素(cholera toxin,CT),是目前已知的致泻性毒素中为强烈的毒素,是肠毒素的典型代表[4].因此,快速而特异地检测出霍乱弧菌,尤其是检测出能够产生CT的霍乱弧菌是疾病控制工作中的重要任务.目前对霍乱弧菌的检测方法主要有分离培养、Dot-ELISA和间接ELISA等免疫学方法,也有报道用常规PCR等分子生物学方法[5],但均存在着特异性、灵敏度不高,耗时长等缺点.因此,本研究以霍乱毒素基因( cholera toxin gene,ctx)为靶序列建立实时PCR检测方法,为快速检测产毒型霍乱弧菌提供一个可行的方法.
