阪崎肠杆菌zpx基因的分子信标-实时PCR技术研究

目的 建立分子信标-实时PCR技术检测婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速方法.方法 在PCR反应体系中加入分子信标探针,探针的5′端标记FAM,3′端标记TAMRA,建立阪崎肠杆菌zpx基因分子信标-实时PCR技术快速检测方法.结果 检测方法特异性强,无非特异性扩增；分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为180fg/PCR反应体系,纯阪崎肠杆菌菌液的检出限为102 CFU/ml,无交叉反应；以此反应体系检测23份样品,其中2份为阳性,余未检出,与传统检测方法结果一致.结论 分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速检测.

光敏剂分子信标的研究与应用进展

光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)是一种联合利用光、光敏剂和氧分子,通过光动力反应选择性地治疗疾病的靶向疗法.光敏剂作为PDT的关键要素之一,其性能直接决定着PDT的疗效.笔者首先介绍了应用于PDT的光敏剂分子信标(photosensitizer molecular beacons,PMB)的基本原理,重点分析和总结了PMB中特异性肽链、淬灭基团和光敏剂等组分的研究进展.后展望了PMB的发展趋势和潜在应用前景.

分子信标与毛细管电泳--激光诱导荧光检测联合筛查野生型基因

目的利用毛细管电泳--激光诱导荧光检测系统(CE-LIF)和分子信标杂交理论,建立一种新的聚合酶链反应(PCR)产物分析方法,以应用于野生型基因的临床筛查.方法 PCR扩增30例胃癌组织DNA的p73基因第3外显子、p53基因第5外显子和p16基因第2外显子,所得PCR产物与分子信标杂交,利用CE-LIF检测杂交产物,检出野生型基因.对照方法为单链构象多态性(SSCP)分析.结果 CE-LIF分子信标法与SSCP分析相比较,测得p73第3外显子野生型百分率分别为100%和100%;测得p53第5外显子野生型百分率分别为60.0%和63.3%(P=0.99);测得p16第2外显子野生型百分率分别为20.0%和20.0%.结论利用分子信标与CE-LIF联合检测野生型基因,是一种良好的筛选方法,高效快速、简便、成本低,适宜应用于临床.

什么是分子信标技术?

应用NucliSens Easy Q定量检测人类免疫缺陷病毒1型RNA

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)而导致的一种致死性疾病.目前,检测HIV-1 RNA的病毒载量主要有3种方法:分枝放大技术(bDNA)、逆转录酶扩增技术(RT-PCR)和核酸序列扩增技术(NASBA).这3项技术具有很好的相关性、敏感性和准确性[1],但是这3项技术的操作较为复杂和费时,且不能实时动态对扩增过程监控.NucliSens Easy Q是一种新的检测HIV-1RNA病毒载量技术.它结合了NASBA的扩增特点和新的分子信标技术[2,3],在本项研究中,我们通过将Nuclisens Easy Q和NASBA对临床样本及其标准血清盘的检测比较,来对这种新方法进行初步评价.

基于分子信标技术对活细胞内miR-155检测用于肺癌诊断

目的 探讨激光共聚焦检测miR-155 MB对肺癌活细胞中miR-155的识别成像功能.方法 设计锁核酸修饰的miR-155分子信标(MB),同时设计不和任何序列结合的随机序列分子信标(RS MB)作为阴性对照;采用液相分子杂交试验验证其灵敏性和特异性,并进一步在肺肿瘤组织水平上验证.以纳米壳聚糖(CS)作为载体转染miR-155MB,检测miR-155MB对肺癌细胞中miR-155识别成像功能;同时采用miR-155抑制剂antagomir抑制miR-155的表达后检测miR-155 MB对肺癌细胞中miR-155的识别成像功能.结果 液相分子杂交实验中miR-155+miR-155 MB组荧光强度为miR-155 MB组的58倍,RS+RS MB组荧光强度为RS MB组的43倍(P＜0.05).在肺鳞癌、腺癌组织中,激光共聚焦可检测到较强的荧光信号,阴性对照组未检测到明显荧光信号.纳米壳聚糖转染miR-155 MB后,可在肺癌活细胞中检测到较强的荧光信号,antagomir抑制miR-155的表达后,发现荧光信号明显降低(P＜0.05).结论 利用分子信标技术可以实现通过识别肺癌活细胞中的miR-155并成像肺癌细胞,从而为发现肺癌细胞并用于肺癌诊断提供了新的理论基础.

分子信标探针荧光芯片检测结核分支杆菌的实验研究

目的 研究运用分子信标探针荧光芯片检测结核杆菌的一种新方法并优化杂交条件.方法 设计出针对结核杆菌检测的特异性分子信标探针并运用于荧光芯片,提高杂交效率部分优化包括分子信标探针浓度及纯度;杂交温度、杂交时间、杂交液配方;4种分子对分子信标荧光信号比较.结果 Mg2+终浓度为5 mmol/L时,PCR扩增效率高,分子信标荧光强度强;单侧延长臂分子信标采用淬灭分子中间标记,能很好的结合在芯片上;3种杂交液的杂交结果比较:0.15%SDS效果好于0.2%SDS,10×SSC效果好于5×SSC;Cy3-BDH分子信标探针浓度约15 μmol/L、FAM-DABCLYE探针浓度约9 μmol/L时,杂交反应达到7 h可检测到较强信号;Cy3-BDH组成分子信标荧光-淬灭效率较Cy3-DABCLYE高.结论 单侧延长臂分子信标探针设计较巧妙地把分子信标高特异性、高敏感性的优势自然运用到芯片技术上,结核杆菌分子信标荧光芯片检测具有良好的检出率、特异性与敏感性.

结核分枝杆菌Emb330codon分子信标杂交及荧光显微观测

目的 设计结核分枝杆菌耐乙胺丁醇embB330codon位点分子信标,运用荧光显微镜观测分子DNA探针与embB330codon扩增产物杂交后的荧光信号,比较该位点突变株与标准株.方法 运用软件Beacon designer设计embB基因包含330codon的分子信标,应用荧光显微镜检测embB330codon扩增片段与探针杂交后荧光信号,比较扩增产物测序结果.结果 通过荧光显微镜观测到结核标准株及embB330codon突变株PCR产物与探针杂交后荧光信号差异有统计学意义;33株耐乙胺丁醇组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐乙胺丁醇组embB330codon突变检出率为3%,测序法突变检出率为3%.结论 分子信标技术可以有效检测embB330codon单碱基靶点突变,应用荧光显微镜观测荧光杂交信号非常灵敏.

婴幼儿人巨细胞病毒基因分子信标杂交荧光检测的研究

目的 选择人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)基因序列设计分子信标,建立扩增体系及分子信标(molecular beacon)芯片检测方法.方法 选取2008年6月1日至2008年7月30日,人巨细胞病毒呈阳性的临床血标本来源于重庆市四所医院(重庆市儿童医院为9例、重庆市计生医院为8例、第三军医大学西南医院为7例、第三军医大学新桥医院为5例),共计29例纳入感染组.选取同期来源于上述四所医院(第三军医大学西南医院为5例、重庆市计生医院为4例、第三军医大学新桥医院为4例、重庆市儿童医院为3例)的人巨细胞病毒呈阴性临床标本,共计16例纳入对照组.无探针包被位点(n=10)纳入空白对照组(本研究遵循的程序符合第三军医大学西南医院人体试验委员会所制定的伦理学标准,得到该委员会批准,取得受试对象的知情同意,并与试验患儿监护人签署临床研究知情同意书).运用Beacon designer软件设计人巨细胞病毒分子信标及其单侧延长臂分子信标,建立扩增体系及分子信标芯片人巨细胞病毒检测方法,应用荧光显微镜观测荧光信号强度.结果 荧光显微镜观测人巨细胞病毒感染组与对照组PCR产物与分子信标杂交后荧光信号强度区别明显;29例人巨细胞病毒婴幼儿感染(感染组)与16例无人巨细胞病毒感染(对照组)的荧光信号强度比较,差异有显著意义(P<0.05).结论 分子信标芯片技术检测婴幼儿人巨细胞病毒基因具有灵敏、快速、可批量处理等优特点.采用荧光显微镜观测荧光杂交信号具有更强的荧光信号识别、放大功能及结果判断更准确等优点.

核酸适配体分子信标探针在肿瘤研究中的应用进展

核酸适配体是从随机寡核苷酸文库中筛选出来,可以高特异性和高亲和力与靶点结合的寡核苷酸序列,具有靶点范围广、相对分子质量小、化学稳定性高、易于合成和修饰等优点.分子信标是一种具有特殊发夹结构的新型荧光探针,具有背景信号低、灵敏度高、特异性识别强、操作简单以及不必与未反应的探针分离即可实时检测等优点.将核酸适配体的分子识别特性和分子信标的光学检测性能相结合,在生命科学研究领域有着良好的应用前景.但核酸适配体的应用研究仍处于初级阶段,还有许多问题需要解决,为解决这些问题,进一步拓展核酸适配体分子信标在生命科学领域,特别是肿瘤领域的应用,需要科学工作者不断的努力和突破.同时随着核酸适配体的发展,越来越多与不同靶点特异性结合的核酸适配体将被筛选出来,并被应用于生命科学研究领域.本文主要对以核酸适配体为基础的分子信标探针在肿瘤研究中的应用进展进行综述.

纳米壳聚糖递送分子信标成像肺癌细胞的研究

目的 采用纳米技术和分子信标(MB)技术,研究纳米壳聚糖(CS)作为miR-155 MB载体用于肺癌细胞成像的效果.方法 设计并合成锁核酸修饰的miR-155MB,采用自组装方法合成纳米壳聚糖分子信标复合物(CS-MB)并对其抗DNase Ⅰ特性、粒径大小、zeta电位等理化性质进行检测.以CS作为载体转染miR-155MB,激光共聚焦检测miR-155 MB对肺癌细胞中的miR-155的识别能力并进行成像,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行进一步验证,以随机序列分子信标(RS MB)作为阴性对照.结果 按照7∶1的质量比合成的CS-MB,其包封率高,能抵抗DNase Ⅰ的降解,粒径小,带正电荷,适合基因转染.CS转染miR-155MB后可在肺癌细胞中看到较强的红色荧光,RS MB组未检测到荧光信号(P＜0.05),且荧光信号强弱趋势与实时荧光定量PCR检测的miR-155表达趋势较一致.结论 CS可作为miR-155MB载体检测肺癌细胞中miR-155的表达并进行肺癌细胞成像,为肺癌的诊断提供了新思路和新技术.

应用分子信标荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒核酸的评价

目的:分子信标(Molecular Beacon)是近年新发展的一种荧光标记发夹形寡核苷酸探针.本文目的在于对国产分子信标荧光PCR定量检测HBV核酸试剂盒(厦门泰伦生物工程有限公司的"乙型肝炎病毒荧光PCR定量检测试剂盒")的主要性能进行评价.方法:以Roche公司的乙型肝炎病毒(HBV)定量检测试剂盒AMPLICOR HBV MONITORTM Test Kit为参比,对分子信标定量检测临床血清标本HBV DNA的结果,进行比较和分析.结果:根据两种试剂盒定量检测34份乙型肝炎和非肝炎血清及一份系列10倍稀释血清(含高水平HBV DNA)的数据,并以Roche试剂盒的结果为参比标准,分子信标试剂盒定量检测HBV DNA的相对敏感性、特异性和符合率均为100%(分别为:19/19,15/15和34/34);其定量检测HBV DNA的线性范围和下限分别为103～108 copies/ml和103copies/ml;两种试剂盒定量检测HBV DNA的相关系数(r)=0.987.结论:初步结果表明:该国产分子信标荧光PCR定量检测HBV核酸试剂盒的主要性能,与Roche公司的AM-PLICOR HBV MONITORTM Test试剂盒相似,并具有较后者更宽的线性定量范围.

分子信标实时荧光PCR检测登革病毒方法初步建立

目的 建立登革病毒分子信标实时荧光PCR检测方法.方法 针对登革病毒3'-UTR保守区设计引物和分子信标探针,构建阳性参考质粒,建立登革病毒分子信标实时荧光PCR检测方法.应用建立方法对血清标本进行检测,检测结果与TaqMan探针法进行比较.结果 所建立的分子信标荧光PCR检测方法灵敏度达102 copies/μL,与其它病毒无交叉反应;对70份血清标本检测结果与TaqMan探针法一致.结论 所建立的分子信标荧光探针法具有较高的灵敏度和特异度.

分子信标技术在人类传染病检测中的应用

分子信标是一种基于荧光共振能量转移原理设计的一种新型核酸荧光探针,因其检测具有高灵敏、高特异性,并且可用于活体的实时检测,因而被广泛的应用于生化分析、生物医学等很多领域.随着分子生物学技术的发展和新型分子信标的不断出现,分子信标的应用将会越来越广泛,该文就分子信标技术的原理及其在传染病中的应用作一综述.

Survivin基因表达的拷贝数与细胞凋亡的关系

目的:研究胃癌组织中Survivin基因表达的mRNA拷贝数、细胞中蛋白表达及凋亡情况,结合临床资料分析三者间及其与病理的关系,讨论其在胃癌诊断、预后等方面的意义.方法:Survivin mRNA拷贝数采用分子信标荧光定量PCR方法,以其读码框部分cDNA克隆重组子为标准品进行绝对定量测定;细胞中蛋白表达采用免疫组化方法;细胞凋亡采用TUNEL方法.结果:Survivin mRNA拷贝数和蛋白表达阳性率,肿瘤组织显著高于正常组织(P＜0.05);细胞凋亡指数AI,肿瘤组织显著低于正常组织.肿瘤组织中Survivin mRNA拷贝数与患者的生存状况和病理类型显著相关,且与AI呈显著负相关(r=-0.252,P＜0.05);Survivin蛋白表达阳性率与患者生存状况显著相关,蛋白表达阳性组mRNA拷贝数高于蛋白表达阴性组,AI低于表达阴性组,但无统计学意义(P＞0.05);Survivin mRNA表达和蛋白表达无显著相关性(P＞0.05).结论:Survivin mRNA和蛋白在胃癌中表达上调,可作为判断预后的生物学指标.

实时荧光定量聚合酶链反应技术及应用

从1985年Kary Mullis发明了聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,到1988年Saiki发现耐热DNA聚合酶,使PCR进入应用阶段,至今已有近20年的历史了.实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)在核酸定量方面具有高敏感性、特异性强、可重复性等优点,从应用以来,给分子诊断领域带来了一次革命,并被广泛应用,成为科研的主要工具之一.本研究旨在阐述RQ-PCR的基本原理,介绍5种荧光化学方法:水解探针(hydrolysisprobes)、分子信标(molecularbeacons)、荧光标记引物(fluorescently-labeled primer)、双杂交探针(dual hybridization probes)、双链DNA嵌合剂SYBR Green Ⅰ(the double-stranded DNA-intercalating agent SYBR Green Ⅰ),并阐述其研究进展及应用.

副溶血性弧菌tdh基因的分子信标PCR技术检测

目的 采用分子信标PCR技术进行副溶血性弧菌tdh基因检测.方法 在反应体系中加入分子信标探针,对13株副溶血性弧菌和其他细菌分别进行tdh基因实时和终点法荧光检测.结果 2株副溶血性弧菌和阳性质粒的终点法检测荧光值分别为114.9,95.2,90.0.实时PCR检测的CT值分别为26.2,26.8,32.0.其他肠道细菌终点法检测荧光值为47.0～69.1;CT值＞32.0或无值,与琼脂糖电泳分析结果一致.结论 分子信标PCR技术可以准确、快速、实时、简便地进行副溶血性弧菌tdh基因检测.

毛细管电泳、分子信标技术及其在遗传学中的应用

毛细管电泳和分子信标技术是近年来发展起来的新兴技术,在遗传领域有着广泛的发展前景.本文分别综述了它们的基本原理及在遗传领域中的应用.

分子信标在DNA生物传感器中的应用

DNA传感器是基于DNA分子相互作用原理设计而成的一种新型的检测技术,具有快速,简单等优点,在基因分析及其他应用领域已显示出越来越重要的价值.分子信标是一种具有发卡式结构的寡核苷酸,由于其能够很好地识别单碱基错配序列,基于发卡式DNA的传感器较传统的单链DNA传感器有更好的检测特异性,目前得到广泛的研究.本文介绍了DNA生物传感器及分子信标的有关原理,并着重介绍了发卡式DNA的结构及其在DNA生物传感器中的应用.

新型分子信标技术的研究进展

分子信标是一种设计巧妙的新型荧光标记核酸探针.特殊的发夹结构使分子信标具有很强的特异性识别靶标序列的能力,目前已成为生物学中一种强有力的研究工具.本文介绍了近年来出现的各种新型的分子信标(MB)的结构及工作原理,简要概述了MB技术在生命科学领域中的应用,展望了MB技术的发展趋势.