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3M分子检测系统新的食源性致病菌快速筛选方法
在食品安全与卫生检测中,食源性致病菌的检测越来越受重视,因此全球各国的食品工业中该类项目的检测数量逐年增大.如何准确、快速与简便地检测出产品中的致病菌以适应企业规模化和效率化的发展成为该行业发展中极为关注的焦点.新上市3M分子检测系统将环介导等温核酸扩增技术(LAMP)和生物荧光实时检测技术(BART)结合在一起,这种创新技术全面提升了操作简便性,准确性,检测速度和性价比,在分子层面上实现了针对食源性致病菌准确、高效的检测.其检测灵敏度是普通PCR的10倍,引物设计远比普通PCR更加巧妙,检测结果也更加准确;扩增效率更高,检测时间更短,检测步骤更少,操作中发生人为污染和技术错误的概率大大降低;可以同时检测多个项目,是高通量、多检测项目的技术;实时且自动化的结果判读;对环境要求更低,适用范围更广.
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利用噬菌体扩增技术快速检测结核分枝杆菌
结核病是当今全球范围内一个严重的公共卫生问题. 结核病人的细菌学检查,是发现传染源的主要途径和手段.目前常规细菌学检查存在灵敏度低,不易标准化等缺点[1].因此发展特异、敏感、快速、简便的检查方法是大家共同期盼的.FASTplaque TB噬菌体扩增技术就是这样一种方法[2].现报道如下.
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噬菌体扩增法快速筛选结核分支杆菌对抗结核药物敏感性的研究
目的:利用噬菌体扩增技术对结核分支杆菌临床分离株进行异烟肼和氧氟沙星药物敏感性分析,评价该表型鉴定法的应用价值.
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环介导等温扩增技术快速检测肠出血型大肠杆菌O157:H7
肠出血型大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)主要包括O157:H7、O26:H11和O111等几种血清型,其中O157:H7是典型菌株,对人有很强的致病力.有研究表明O157:H7导致的感染占EHEC感染的50%~80%,它能引起出血性结肠炎、阑尾炎、食管狭窄和结肠穿孔等严重胃肠道并发症.
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环介导等温扩增技术在流感病毒检测中的应用
流感病毒是引起人类流感的病原体之一,属于正黏病毒科,分为甲型、乙型和丙型流感病毒,其中甲型和乙型流感病毒对人类具有流行病学意义.流感病毒感染可导致一系列呼吸道疾病,临床症状从轻微的上呼吸道症状至急性呼吸窘迫综合征和多器官功能衰竭,甚至死亡[1].流感大流行传播迅速,波及范围广,发病率和死亡率高,严重威胁着人类健康.1918年的H1N1"西班牙流感"、1957年H2N2"亚洲流感"和1968年H3N2"香港流感"三次流感大流行导致全球超过5000万人死亡.近暴发的2009年新甲型H1N1流感大流行,全球估计有数亿人感染,约2万确诊死亡病例[2].因此流感病毒的早期快速检测技术对于流感的防控及治疗具有重要的意义.
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等温核酸扩增技术检测KPC耐药方法的建立及初步评价
碳青霉烯类抗生素是治疗重症感染有效的抗生素之一。近10年来,对碳青霉烯类抗生素耐药的细菌在世界各地的不断暴发威胁着人类的生命健康。产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制,其中报道较多的是肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶( Klebsiella pneumoniae carbapenema-ses,KPC)。而且携带KPC的细菌感染与高死亡率呈正相关。因此及时、准确、快速地检出产KPC酶细菌对预防、控制耐药菌株流行具有重要意义。碳青霉烯酶表型检测方法均较费时;PCR扩增是常见的分子生物学检测方法,检测时间大大缩短,但对模板DNA质量、仪器设备和场所要求较高。等温核酸扩增技术( nucleic acid sequence-based amplifica-tion,NASBA)具有快速、灵敏、特异的优点。本研究以RNA为靶序列,建立了 NASBA 快速检测细菌KPC耐药的方法。
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多重连接依赖探针扩增技术在假肥大型肌营养不良症基因诊断中的应用
杜氏肌营养不良( Duchenne muscular dystrophy, DMD)为儿童期常见的重症肌营养不良疾病,多于5岁前发病,大多数患有DMD的男童12岁后基本丧失行走能力,少数存活至25岁。贝氏肌营养不良( Becker muscular dystrophy, BMD)临床症状轻于DMD,多于16岁后丧失独立行走能力。DMD和 BMD 都是由定位于 Xp21.2的肌营养不良蛋白( dystrophin)基因突变引起的X连锁隐性遗传疾病。目前此病尚无有效的治疗方法,故确诊先证者、检出携带者并实施有效的产前诊断,杜绝患儿出生是干预出生缺陷的关键手段。
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杂交捕获法与荧光定量PCR法在高危型HPV检测的比较
宫颈癌为女性常见的癌症之一,我国宫颈癌的发病率和死亡率占全世界的1/3,且有年轻化的趋势[1-2].大量研究显示,持续的高危型人乳头瘤病毒(humarl papillornavims,HPV)是宫颈癌及癌前病变发生的必要条件.据国际宫颈癌生物学研究(IBSCC)机构报道,宫颈癌组织中HPV DNA的检出率高达93%[3].因此,将HPV DNA检测纳入宫颈癌及癌前病变筛查势在必行.目前使用多的是美国Digene公司的2代杂交捕获分析(hybrid capture 2,HC2),也是美国食品和药品管理局(FDA)惟一批准用于临床的非放射性HPVDNA检测技术,具有较高的敏感度和特异度[4],但此检测试剂昂贵,完全依赖进口,在经济欠发达地区很难推广.实时荧光定量PCR检测(FQ-PCR)是敏感的核酸扩增技术,可在较短时间内获得非常准确的结果,检测HPV的成本明显低于HC2分析.本研究通过比较HC2和FQ-PCR法检测HPV DNA结果,评价FQ-PCR的临床应用价值.
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RNA病毒扩增检测的质控品和标准品研究进展
RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)等的核酸检测对于感染的早期诊断和抗病毒治疗疗效的动态观察具有重要价值.自1983年发明聚合酶链反应(PCR)技术以来,出现了基因扩增的概念.目前多采用核酸扩增技术(NAT)检测病毒RNA,常用的是逆转录(RT)-PCR方法.核酸扩增检测想得到可靠的结果,必须使用质控品进行严格的质量控制,而对病毒进行定量测定,通常还须有病毒RNA标准品.目前RNA病毒扩增检测的质控品和标准品分为两大类,一是裸露的RNA片段,二是内含特定RNA的病毒样颗粒或称之为带盔甲的RNA(armored RNA).
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突变受阻性扩增系统快速检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的初步研究
利福平(RFP)是结核化疗方案中的一个关键药物,它的应用可明显缩短结核病的疗程.因此,创建快速、简便的检测方法一直是基础研究中的一个重要课题.突变受阻性扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)[1]是一种可以检测任何已知点突变或小基因片段缺失的扩增技术,简便、可靠、无同位素污染.我们选择与结核分枝杆菌(结核菌)RFP耐药相关的rpoB基因中突变频率高的3种突变形式:531 TCG→TTG,526 CAC→TAC,516 GAC→GTC来设计ARMS特异性突变引物,ARMS-聚合酶链反应(PCR)扩增后结合微孔板探针杂交酶免疫技术(EIA)加以检测其扩增产物,进而推断其RFP耐药与否.
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应用NucliSens Easy Q定量检测人类免疫缺陷病毒1型RNA
获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)而导致的一种致死性疾病.目前,检测HIV-1 RNA的病毒载量主要有3种方法:分枝放大技术(bDNA)、逆转录酶扩增技术(RT-PCR)和核酸序列扩增技术(NASBA).这3项技术具有很好的相关性、敏感性和准确性[1],但是这3项技术的操作较为复杂和费时,且不能实时动态对扩增过程监控.NucliSens Easy Q是一种新的检测HIV-1RNA病毒载量技术.它结合了NASBA的扩增特点和新的分子信标技术[2,3],在本项研究中,我们通过将Nuclisens Easy Q和NASBA对临床样本及其标准血清盘的检测比较,来对这种新方法进行初步评价.
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核酸扩增试验诊断结核淋巴结炎:系统性回顾
资料背景:淋巴结炎是结核病常见的肺外表现.常规诊断方法,例如涂片镜检和培养,对于结核性淋巴结炎的诊断都不是非常精确.核酸扩增试验(NAAT)可以提供有益的辅助诊断.目的:通过系统回顾,评价NAAT方法诊断结核性淋巴结炎的实际效果.实验设计:我们进行了文献检索,发现36篇文章中包含了49个NAAT与结核性淋巴结炎参比标准的比较研究.每一个研究估计的灵敏度和特异性均采用树状图和概括性接收器工作特性曲线(SROC)来体现.结果:所有研究的质量大致相当,但很多研究的报告质量较差.各研究估计的NAAT的灵敏度(2%~100%)和特异性(28%~100%)差异很大,可能是由于研究的人群、质量和检测技术不同所致.商业化的NAAT试验应用20μl以上的模板,包含差异分析的报告提供了较高的诊断精确性.双盲、模板体积和差异分析可能解释一些结果不同的原因.结论:检测结核性淋巴结炎的NAAT研究所获得的结果高度可变,而且不一致,不可能成为临床确诊的指标.研究报告未标准化,而且通常包含的信息量不足.由于可能存在假阳性和假阴性结果,因此NAAT方法需与常规的方法联合应用,对临床可疑病例需依具体情况判断.
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FACTT 一种新的抗原检测系统
免疫学方法检测抗原的灵敏度受到抗原浓度及抗原与所使用抗体的亲和力的限制,ELISA是目前常用的抗原检测方法,其检测极限在0.01~50 ng/ml之间.不能满足于一些低丰度蛋白或微量标本中的蛋白的检测.T7RNA聚合酶具有在体外结合T7启动子后高效转录产生RNA的功能.据此特点,美国华裔学者Zhang等发明了一种抗原检测系统(fluorescent amplification catalyzed by T7 polymerase technique FACTT),即:T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术.该技术比传统的ELISA的敏感度至少提高几个数量级.而且该方法是在等温条件下进行,所以实验具有较好的重复性而且易如操作,显示了良好的应用前景[1].
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多重连接依赖性探针扩增技术及其在临床中的应用
多重连接依赖性探针扩增(Multiplex Ligation dependent Probe Amplification,MLPA)技术是一种高效、特异、快速、简便,针对待检核苷酸序列进行定性和相对定量分析的技术.2002年Schouten等[1]在多重扩增探针杂交(Multiplex amplifiable probe hybridisation,MAPH)技术基础上进行改进而建立了MLPA技术.该技术在一次性反应中可检测45个核苷酸序列拷贝数的改变,目前已广泛应用于染色体数目异常、基因缺失/重复、DNA甲基化检测等多个分子生物学诊断领域.
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长距离PCR技术的建立及其在重型血友病甲Ⅷ因子倒位基因诊断中的应用
血友病甲(HA)是由于凝血因子Ⅷ基因缺陷所致的X-连锁遗传性出血疾病,其基因突变高度异质.1993年,Lakich和Naylor分别发现,此前多年来找不到FⅧ基因缺陷的约半数重型HA的患者,是由于FⅧ基因第22内含子(IVS22)内的F8A1与其远端约400~500kb处高度同源的序列F8A2或F8A3发生基因倒位所致.迄今,国际上检测这种基因倒位都是用Southern印迹杂交技术.虽然这种技术能够准确地查出是否有基因倒位,并能区分远端倒位与近端倒位等不同的类型,但此技术操作步骤繁多,流程长,出结果慢,难度大,且要操作放射性同位素标记的探针等.我们从1996年开始在国际上率先研究利用长距离DNA扩增技术(LD-PCR)替代Southern印迹杂交进行FⅧ基因倒位的诊断.经二年努力终获成功,并进行了推广应用.
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荧光定量PCR技术及其应用
PCR技术是一种体外核酸扩增技术.1986年第1台PCR热循环仪的问世使PCR技术实现了操作自动化.通过PCR技术可对特定基因进行扩增,其主要应用领域是基因检测和临床基因诊断.但是,PCR技术应用于基因诊断还存在许多局限性,主要表现在不能准确定量和易产生假阳性和交叉污染等.
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应用RACE技术获取小鼠乳腺癌转移相关基因 G15γ5′端未知序列(论著摘要)
G15γ5′是本组以往用mRNA差异显示法从γ干扰素预处理的小鼠腺癌细胞系MA891中分离出的cDNA片段,推测其代表的基因可能与肿瘤转移有关.为进一步研究其功能,采用cDNA未端快速扩增技术(RACE),以获取该片段5′端未知序列.用IFN-γ(200 U/ml)处理MA891细胞48 h,提取总RNA并用DNaseI纯化.根据G15γ5′端序列,设计合成3个基因特异性引物GSP1,GSP2和GSP3.以GSP1为引物合成cDNA第1链,用末端转移酶在cDNA第1链的3′端进行同聚物加尾,对加尾后的cDNA先后用GSP2和GSP3与锚定引物进行初级及巢式PCR扩增,终得到一552 bp的扩增产物并将其克隆至pCRTM Ⅱ载体,经Northern印迹分析及序列分析证实,所得片段确实是G15γ5′的5′端延续.
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探讨干细胞在临床医学中的应用
20世纪末,世界生命科学领域重要的进展之一是干细胞生物学研究取得突破,为一些组织和器官损伤后的修复带来了一种新的治疗手段.目前在临床应用中,干细胞治疗范围广阔,可以在多个系统疾病内应用.干细胞用途广泛,涉及医学多个领域.从20世纪80年代至今,干细胞移植已成为某些血液病、遗传性疾病、自身免疫病等多种疾病重要治疗手段[1] .干细胞种类众多,在某些因素诱导下可向特定组织定向分化,诱导剂、细胞因子是目前常用手段.随着体外扩增技术不断进步,细胞因子相关研究的深入,作为组织工程种子细胞引发了世界范围内的研究热潮.
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多重连接依赖性探针扩增技术在产前诊断中的应用
产前诊断是在遗传咨询的基础上,主要通过遗传学检测和影像学检查,对高风险胎儿进行明确诊断,通过对患胎的选择性流产达到胎儿选择的目的,从而降低出生缺陷率,提高优生质量和人口素质.多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术是在多重扩增探针杂交(MAPH)技术的基础上改进而来,基本原理是针对基因组内拷贝数变异(CNV)对可与样本DNA正确杂交并被连接酶连接的探针进行扩增和半定量分析,具有精确度高、重复性好、操作简便及通量大等特点.MLPA已广泛应用于染色体数目异常、遗传性疾病基因缺失重复、单核苷酸多态性、甲基化等多个研究领域等.随着MLPA不断被改进,目前已成为临床上常用的产前诊断工具之一,因此本文就其在产前诊断中的应用做一总结.
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核酸扩增技术在血液检测中的应用
目前我国主要采用酶联免疫吸附法(ELISA)对献血者的血液进行检测,将核酸扩增技术(nucleic acid testing,NAT)应用于血液的检测已成为当前的热点问题.NAT可显著降低已经感染但无症状的处于"窗口期"的献血者的漏检,避免或减少输血传播疾病.现就NAT及其在血液检测中的应用情况作一介绍,并对该方法在我国推广和应用的必要性和可行性作初步探讨.