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药材天麻ITS2特异性引物的筛选
目的：药材天麻由于隶属于单子叶植物兰科天麻属，天麻中含有大量多糖、蛋白质以及大量次生代谢物质，使其提取的DNA质量不高，影响后续的PCR扩增。且ITS2通用引物在单子叶植物部分物种通用性很差。本研究通过对DNA提取过程、PCR扩增过程进行优化，设计出一对用于鉴别天麻药材的ITS2引物，为中药材天麻的鉴定提供一种新方法。方法：以通用ITS2引物扩增出的两条序列为研究对象，经Primer Premier 5.0设计出3对特异性引物，通过对22份样品进行研究，筛选出一条高特异性的ITS2引物。结果：在54益的退火温度下，TM2F-2R对天麻的鉴定效率高达90.9%。结论：TM2F-2R可作为天麻ITS2序列的特异性引物，为天麻的分子鉴定提供了一套准确、稳定的鉴定方法。
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柴胡及其常见伪品的DNA指纹鉴定
目的:建立柴胡及其伪品DNA指纹鉴别方法.方法:采用改良的CTAB法提取柴胡及常见伪品的干根基因组DNA,设计鉴别正品柴胡及其伪品的特异性引物,利用PCR扩增技术对正品柴胡及其伪品进行DNA指纹鉴定.结果:改良的CTAB法提取出大小为23 kb的基因组DNA条带,纯度在(1.71±0.11),且经特异引物PCR扩增,只有正品柴胡能扩增出173bp大小的片段,而伪品未能扩增出目的片段.结论:柴胡DNA具有特异性指纹特征,可作为市售柴胡的真伪鉴定依据.
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石斛属RAPD分析及鉴定铁皮石斛的特异性引物设计
目的：对石斛属植物亲缘关系进行分析，并设计一对能方便准确地鉴别铁皮石斛的特异性引物。方法：用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对石斛属内26个种和金石斛属的1个种进行了基因组DNA多态性分析，并构建聚类树状图。根据筛选到的DNA片段序列，将Sangon18引物从3'端延长至20 bp,得到所要的特异性引物。结果和结论：设计成的特异性引物能方便快捷地鉴别出铁皮石斛。此技术为药材的分子鉴定提供了一个新思路。
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微卫星锚定PCR及其在寄生虫学中的应用
微卫星DNA是新近发现的一种DNA遗传标记,已初步应用于寄生虫学研究中.要扩增出目标微卫星DNA,往往需要根据已知的模板序列来设计一对特异性引物,在目前对寄生虫基因组还知之甚少的情况下,这无疑给研究带来了极大的困难.微卫星锚定PCR不需要事先知道模板的序列,而是利用引物与微卫星DNA序列互补结合(在引物的3′端或5′端锚定一个或几个寡核苷酸分子),进而扩增出微卫星DNA之间的序列,从而揭示物种基因组DNA的差异.微卫星锚定PCR克服了一般PCR、RFLP以及RAPD等方法的某些不足,具有操作简便、DNA用量少、重复性好、特异性高等优点,已被用于分子生物学方面的研究.本文概述了微卫星DNA的概念、结构特点,微卫星锚定PCR的实验原理和方法及其在寄生虫学研究中的实际应用.
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PCR快速检测粪便中志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌IpaH基因及其临床应用
煮沸法从粪便标本中快速抽提出细菌DNA作为聚合酶链反应(PCR)模板,用自行设计的1对特异性引物扩增位于志贺菌和侵袭性大肠埃希菌染色体和质粒DNA上的多拷贝侵袭性质粒抗原(Ipa)H基因,扩增产物为620bp,以常规细菌培养检出率为对照.用20种常见肠道病原菌标准菌株的DNA抽提物进行PCR反应的方法来对PCR反应的特异性进行检验.用DNA序列分析的方法对PCR扩增产物的特异性进行检验.共检测81份门诊粪便标本,细菌培养阳性有27例,福氏志贺菌25株,宋内志贺菌2株,培养阳性率为33.3%,PCR检测阳性有39例,阳性率为48.1%,PCR检测阳性率比常规细菌培养阳性率高14.8%,其中细菌培养阳性的标本PCR检测均为阳性,29例住院病人经过正规治疗1周后,PCR检测12例仍然阳性.统计学分析显示两者之间差异有显著性(P<0.05).标准菌的PCR检测和PCR产物的DNA序列测定结果显示我们设计的PCR方法具有较高的特异性.本研究中采用的PCR方法是一种快速简便、特异性高和敏感性强的检测细菌性痢疾病原菌的现代分子生物学方法.
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原代猪肝细胞PERV检测及其意义
目的:探讨猪肝细胞内源性逆转录病毒(PERV)检测方法及意义.方法:采用体外二步灌流法获取猪肝细胞,使用特异性引物对其前病毒序列进行观察;以未逆转录PCR为对照,采用RT-PCR方法检测原代猪肝细胞PERV携带及释放情况,并用套式RT-PCR对扩增产物进行鉴定.结果:原代猪肝细胞基因组中可检测到PERV前病毒序列,肝细胞中亦可检测到特异性的PERV RNA序列.在缺乏有丝分裂原刺激的情况下,猪肝细胞普通培养的不同时段均可检测到病毒释放,并可持续至细胞死亡.结论:中国实验小型猪肝细胞携带PERV病毒序列,猪肝细胞普通培养时可释放该病毒,其感染性及生物安全性尚需进一步研究.
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厦门市乙型肝炎患者病毒基因型的分析
目的:采用多对型特异性引物,通过巢式PCR法检测厦门市乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情况.方法:收集250例HBV感染患者血清,提取血清中HBV DNA作为模板,设计HBV前S1基因和S基因中区域内设计出10条内外引物,并将其中8条型特异性内引物分成A,B两组,分别扩增A,B,C和D,E,F型HBV,然后将第2轮PCR产物以用30 g/L琼脂糖进行电泳,根据PCR产物电泳显示的产物长度判定HBV基因型,以了解厦门HBV基因型分布情况.结果:共120例确定了HBV基因型.患者群中慢性乙型肝炎90例,占75.0%,急性乙型肝炎、肝炎肝硬化、原发性肝癌分别占5.8%(7/120)、6.7%(8/120)和12.5%(15/120).分型结果:B型58例(48.3%)、C型30例(25.0%),B/C混合型32例(26.7%).HBeAg阳性患者中B基因型占63.8%,B/C型混合感染21.9%;抗-HBe阳性患者中以B/C型混合感染68.8%,B型25.9%,HBeAg阳性组与抗-HBe组之间比较发现B型和B/C混合型之间(P＜0.05).结论:厦门乙型肝炎患者HBV基因型以B型为主,B/C混合感染是一个值得重视的问题.
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广西人上消化道疾病患者幽门螺杆菌cagA基因检测及其临床意义
目的:研究广西人上消化道疾病患者幽门螺杆菌(H pylori)细胞毒素相关蛋白(cagA)基因的阳性率,从而明确广西人群感染H pylori菌株的毒力状况.方法:在广西南宁市几家大医院的慢性胃炎(CG)、消化性溃疡(PU)患者胃黏膜中分离出45株Hpylori,用特异性引物扩增H pylori cagA基因的297 bp片段,经聚合酶链反应(PCR)进行检测.同时收集患者临床和胃镜诊断资料,分析Hpylori cagA基因与胃十二指肠疾病的关系.结果:在45株Hpylori中有84.4%(38/45)的菌株含有cagA基因,其中PU患者感染菌株cagA基因阳性率为76.0%(19/25),CG患者cagA基因阳性率为95.0%(19/20),二者比较差异无显著性(X2=3.054,P＞0.05),各年龄组患者感染H pylori菌株cagA基因阳性率差异无显著性(P＞0.05),而女性患者阳性率(100.0%)显著高于男性(73.1%,P＜0.01).结论:广西人上消化道疾病患者Hpylori cagA基因阳性菌株感染率较高;PU患者感染菌株cagA基因阳性率低于CG患者;女性患者感染Hpylori菌株cagA基因阳性率明显高于男性;但各年龄组患者阳性率无差异.
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支气管哮喘患者外周血T淋巴细胞凋亡及相关基因的表达
我们对哮喘患者的外周血T淋巴细胞的活化诱导细胞凋亡(AICD)及影响细胞凋亡的分子调控机制进行了检测和分析，以期为揭示哮喘的慢性气道炎症机制提供依据。 对象与方法按1997年《支气管哮喘防治指南》［1］，选择初治哮喘患者10例为哮喘组，男、女各5例，平均 (35.8±10.3)岁。选择10名无吸烟史的健康人为对照组，男、女各5例，平均(35.9±11.0)岁。于淋巴细胞分离液中分离外周血单个核细胞（PBMC），尼龙毛柱分离出T淋巴细胞。一部分加入PHA-P液（终浓度为10 μg/ml）和IL-2（终浓度为50U/ml），另一部分仅加入IL-2（终浓度为50 U/ml），然后同时体外培养24 h。回收培养T细胞用AnnexinV法和碘化丙啶(PI)染色法检测T细胞凋亡。AnnexinV凋亡检测试剂盒购自美国Pharmingen公司，按说明书进行免疫荧光标记和流式细胞分析。PI染色法：将细胞加入75%乙醇，-20℃冻存12 h以上。检测前取出细胞加入PI、RNAase，避光孵育15 min后行流式细胞分析。用荧光素(FITC)-Fas单抗及藻红素（PE）-CD3单抗标记，流式细胞检测T细胞膜表面Fas受体的表达情况。用TRIZOL反应剂提取培养T细胞的总RNA，用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增Bax、Bcl-XL特异性基因片段。特异性引物序列（Bax：5′GGACCCGGTGCCTCAGGA，3′CAAAGATGGTCACGGTCTGC；Bcl-XL：5′TTGGACAATGGAC TGGTTGA，3′GTAGAGTGGATGGTCAGTG）及反应条件参照文献［2］。通过凝胶图像扫描及分析系统，以扩增的特异性DNA片段的荧光强度与同时扩增的内参照GAPDH片段的荧光强度比值作为特异性扩增片段的半定量检测值。统计学分析采用F检验、t检验、直线相关分析。
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胎儿ABO血型的产前诊断
母儿血型不合中以ABO血型不合多见,常导致早期流产、胎儿贫血、水肿、甚至胎死宫内.为探讨产前诊断胎儿ABO血型的简便、准确、敏感性高、特异强的方法,我们根据B基因、A2基因、O1基因、O2基因与A1核苷酸序列突变位点的不同,设计出相应的特异性引物,用特异性序列-聚合酶链反应法,对2000年3月～2001年9月,在我院产科分娩的56例未破膜孕妇(新生儿、胎儿)及其丈夫[其中足月分娩28例(剖宫产23例,阴道分娩5例),引产28例(死胎9例,妊娠合心脏病2例,肺部恶性肿瘤1例,再生障碍性贫血2例,胎儿畸形8例,妊娠合并糖尿病酮症酸中毒1例,重度妊高征2例,羊膜带综合征1例,胎儿生长受限并巨细胞病毒感染2例)]进行羊水细胞A1、A2、B、O1、O2血型基因型检测.
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基于特异性聚合酶链式反应的西红花快速分子鉴别研究
目的 建立一种基于特异性聚合酶链式反应(PCR)及荧光染料检测快速鉴别西红花真伪品的方法.方法 通过对叶绿体基因片段测序和比对分析,找出西红花与其常见掺伪品序列差异,针对差异碱基设计特异性引物,构建并优化聚合酶链式反应扩增反应体系,使用荧光染料法检测聚合酶链式反应产物,实现西红花的快速鉴别.结果 建立了基于psb A-trnH序列的西红花鉴别体系,优化后的聚合酶链式反应反应条件为90℃预变性l min,90℃变性5 s,58℃延伸5 s,26个循环.在聚合酶链式反应反应产物中加入染料SYBR Green Ⅰ,西红花正品出现强烈绿色荧光,而伪品无荧光.结论 位点特异性聚合酶链式反应方法可以简单快速鉴别西红花及其掺伪品.
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鹿茸线粒体DNA的指纹鉴定研究
目的 通过鹿茸特异性引物鉴别和随机扩增多态DNA(RAPD)鉴别的比较,选择一种更简便的方法用于鉴别鹿茸.方法 采用盐析法从梅花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸、市售鹿茸等样品中抽提线粒体DNA,并应用试剂盒进行纯化.进行特异性引物扩增和序列测定,同时进行随机扩增多态DNA扩增.结果 梅花鹿茸,马鹿茸,驯鹿茸以及部分市售鹿茸经特异性引物扩增后均可在琼脂糖凝胶中显示313 bp片段,只是条带亮度不同.而其余市售鹿茸无扩增条带；随机扩增多态DNA不仅有效显示阳性与阴性的DNA扩增结果,而且对梅花鹿茸,马鹿茸,驯鹿茸的聚合酶链反应产物的差异,以不同的条带数目和条带亮度得以验证.结论 随机扩增多态DNA鉴别鹿茸真伪的方法更准确快捷,通过随机扩增多态DNA扩增后主条带与梅花鹿茸或马鹿茸扩增的条带大小和亮度一致,则为正品；如不一致,则为《中国药典》规定外的鹿茸或其他混淆品.这种方法对于筛选、甄别市售动物中药材,特别是名贵中药具有广阔的应用前景.
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环介导等温扩增过程监测与结果分析技术研究进展
2000年,Notomi等[1]建立了一种新颖的核酸扩增方法-环介导等温扩增(loop -mediated isothermal amplification,LAMP).该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域,在恒温条件进行反应,不需要模板的热变性和长时间温度循环.较之于传统的PCR方法,其不但简便、快速、不需要昂贵的仪器设备,适合现场使用、特异性好,而且甚至可以免模板DNA提取操作,因此解决了基于核酸的分子生物学检测技术的诸多难题,使快速、廉价诊断成为可能[2-6].近年来,LAMP技术在微生物检测及动物胚胎性别鉴定等很多领域得到广泛的研究与应用.比如在日本,其已成为病原微生物常规检测的官方推荐手段[6 ].
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应用RACE技术获取小鼠乳腺癌转移相关基因 G15γ5′端未知序列(论著摘要)
G15γ5′是本组以往用mRNA差异显示法从γ干扰素预处理的小鼠腺癌细胞系MA891中分离出的cDNA片段,推测其代表的基因可能与肿瘤转移有关.为进一步研究其功能,采用cDNA未端快速扩增技术(RACE),以获取该片段5′端未知序列.用IFN-γ(200 U/ml)处理MA891细胞48 h,提取总RNA并用DNaseI纯化.根据G15γ5′端序列,设计合成3个基因特异性引物GSP1,GSP2和GSP3.以GSP1为引物合成cDNA第1链,用末端转移酶在cDNA第1链的3′端进行同聚物加尾,对加尾后的cDNA先后用GSP2和GSP3与锚定引物进行初级及巢式PCR扩增,终得到一552 bp的扩增产物并将其克隆至pCRTM Ⅱ载体,经Northern印迹分析及序列分析证实,所得片段确实是G15γ5′的5′端延续.
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各类病毒的PCR检测
1 检测人类T-细胞淋巴瘤/白血病病毒 应用体外基因扩增技术棗PCR大大地增进了人类癌基因逆转录病毒的检测,因此PCR技术作为人类T-淋巴瘤/白血病病毒(HTLV-1.II)的临床诊断和流行病学研究的手段,广泛地应用于淋巴细胞增生性疾病和神经系统疾病的病人和携带者的检测.由于该技术具有相当高的敏感性,可以准确地鉴别出已发生感染的无症状携带者,因此还可能促进分子流行病学的建立.引物的探针系统包括普遍性和特异性两种.普遍性引物和探针系统用于扩增和检测HTLV-1和HTLN-II,而特异性引物和探针系统用于区别这两种病毒.对于流行病学筛选,常规应用普遍性引物探针系统进行初筛,对于阳性的DNA再进一步进行特异性分析.
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致病菌PCR快速鉴定研究进展
尽管美国是世界上公认的食品供应安全国家,但每年仍有上千万例疾病与食源性致病菌污染有关,因此,引起消费者、相关行业及相应机构的广泛关注[1].美国食品与药品管理局(FDA),规定大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌等致病菌食品中不得检出[2].但由于食品中成分复杂,利用常规方法检测致病菌存在周期长、步骤繁琐、工作量大、准确性差等缺点,如何快速、准确地从食品中检出致病微生物已成为当前研究热点之一.PCR技术因具有快速、准确、特异、灵敏等优点[1],适合出入境商品和食品中检出鉴定致病菌工作的需要而备受青睐.根据所选择引物的特异性、种类,利用PCR技术检出鉴定致病菌可大致分为2类,即:通用引物(UP)PCR技术和特异性引物(SP)PCR技术,本文对UP-PCR和SP-PCR技术的研究进展作一综述.
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使用ERIC-PCR技术检测嗜酸乳杆菌
目的 利用ERIC(enterobacterial repetitive intergenic consensus)-PCR技术,设计引物,特异性检测嗜酸乳杆菌.方法 以本实验室保藏的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)SYP-B2340基因组DNA为模板,通过四因素三水平正交试验,优化嗜酸乳杆菌ERIC-PCR反应体系,对所获得的PCR条带进行测序和分析,进一步设计特异性引物,实现对嗜酸乳杆菌的特异性鉴别.结果 通过四因素三水平正交实验,成功优化ERIC-PCR反应条件;根据ERIC-PCR片段,设计三对特异性引物,可在多种混合基因组DNA中灵敏鉴别出嗜酸乳杆菌.结论 基于ERIC-PCR设计的特异性引物,可简便、快速的鉴定嗜酸乳杆菌.
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细胞毒性T淋巴细胞抗原4基因第一外显子多态性在类风湿关节炎发病中的意义
文献报道，细胞毒T细胞抗原4(CTLA4)是一种T细胞活化的重要负调节因子，编码这一蛋白的基因有一定的多态性，并可影响到某些自身免疫病的发病[1]。本文通过对CTLA4基因变异分析，探讨该基因在类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)发病中的意义。1 材料与方法1.1 实验对象中全部RA病例来自我院和解放军总医院风湿科1996．7～1998．12门诊或住院患者，共63例(RA)，均符合1987年美国抗风湿联盟(ACR)的诊断标准。另选择60名健康献血员作为对照组。所有受试对象均抽取静脉血2ml。1.2 实验方法1.2.1 酚/氯仿/异戊醇法提纯外周血基因组DNA。1.2.2 CTLA4基因第一外显子+49位等位基因的检测采用PCR-RFLP分析方法[1]。PCR产物阳性条带为162bp。将产物以内切酶BbvI在37℃水浴2h。酶切后显示88bp和74bp2条带型者定为G(Ala)，仍显示162bp者定为A(Ihr)。内切酶BbvI和纯合子、杂合子阳性对照标本由德国JohannnWolfgang Goethe大学Badenhoop教授赠送。1.2.3 用组特异性引物扩增DRB1基因第2外显子，筛选DR4阳性标本[2]。1.3 分别计算RA组和对照组CTLA4等位基因A与G、表现型A与G及纯合子、杂合子频率。2个样本率的比较用χ2检验。2 结果2.1 CTLA4等位基因A与G、表现型A和G以及杂合子AG、纯合子AA与GG的频率在RA组和正常对照组之间无显著差异(P＞0．05)。2.2 杂合子AG及纯合子AA在DR4+RA组频率分别显著高于和低于DR4+正常对照组(χ2分别为5．84和5．46，P＜0．05)；表现型G在DR4+RA组显著高于DR4+正常对照组(χ2=5．84，P＜0．05)。纯合子GG、表现型A在DR4+RA组和DR4+正常对照组无显著差异。各等位基因频率在DR4-RA组和DR4-正常对照组间也无显著差异。
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红色毛癣菌的研究进展
红色毛癣菌是常见的也是世界范围内传播广的一种皮肤癣菌，属毛癣菌属。本文简述了近几年在该菌的基因鉴定、基因分类、基因结构的分子生物学研究和免疫学研究方面的主要进展。在基因鉴定中发展了红色毛癣菌特异性探针TR20S和毛癣菌属特异性引物TR1、TR2和NS5、NS6；利用测序方法对毛癣菌属进行了重新分类，并且用探针、限制性片段多态性分析等方法对红色毛癣菌进行了种内分型研究。
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丙型肝炎病毒型特异性聚合酶链反应基因分型的临床应用
目的 探索丙型肝炎病毒(HCV)基因型在不同人群中的分布规律及流行优势型。方法 分别对健康体检者、住院患者和血液透析患者抗HCV IgG阳性标本，用自行设计的5’非编码区(5’-NCR)1、2、3、1b型特异性引物进行扩增和基因分型。结果 3组人群中血液透析患者HCV感染率高，抗HCV IgG和HCV RNA阳性率分别为55.37%和38.84%。基因型以1b亚型为主，1b及1b的相关型占91.67%。结论 本地区HCV流行优势型为1b亚型。
