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环介导等温扩增技术及其在肝炎病毒检测中的应用
环介导等温扩增技术LAMP法(Loop-Mediated Isothermal Amplification)是近年来发展起来的新的核酸扩增技术,与传统的核酸扩增方法相比,它具有高特异性、高效性、快速、操作简便等特点.目前在病原微生物检测、食品安全、环境监测等方面有广阔的应用前景,本文就环介导等温扩增的原理、技术特点及在肝炎病毒检测中的应用进展进行综述.
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嗜肺军团菌的环介导等温扩增检测技术研究
目的 建立一种简便、快速和高灵敏度的嗜肺军团菌的检测方法.方法 利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,根据嗜肺军团菌mip基因的特征性保守序列,设计LAMP检测引物,建立LAMP检测方法,用常规PCR检测平台和其他21种致病菌评估该方法的特异性、灵敏度、重复性及实用性,同时以荧光法建立反应阈值与模板初始浓度之间的线性标准曲线.结果 建立的LAMP方法检出限为1.0×1 02copies/μl,与其他致病菌无交叉反应,反应阈值与初始模板浓度有良好的线性关系(R2=0.9843),LAMP检测结果与传统分离培养方法具有良好的吻合性.结论 环介导等温扩增技术检测嗜肺军团菌简便、快速、敏感度高,具有广阔的应用前景.
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人冠状病毒HCoV-HKU1环介导等温扩增检测技术的研究
目的 建立一种快速、灵敏、高效的人冠状病毒HKU1 (HCoV-HKU1)LAMP扩增检测方法.方法 应用生物信息学软件设计5套LAMP扩增引物,以合成的HCoV-HKU1质粒为模板,通过实时浊度法进行佳引物组的筛选,并分析该方法的特异性和灵敏度.结果 HCoV-HKU1 LAMP扩增方法针对其他病原微生物及人类基因组无反应信号.该方法可以检测到1拷贝/μl的HCoV-HKU1质粒.结论 HCoV-HKU1 LAMP扩增方法特异性好、灵敏度高,在临床鉴别诊断和口岸冠状病毒的检测中具有很好的应用前景.
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使用环介导等温扩增技术检测炭疽芽孢杆菌及其定量检测的研究
目的 建立一种适合公共卫生机构现场使用的环介导等温扩增(LAMP)技术检测炭疽芽孢杆菌的方法.方法 根据LAMP方法的原理,建立LAMP以及荧光定量LAMP检测方法,对方法的特异性、灵敏度、重复性及模板浓度与反应时间之间的线性关系进行评估.结果 LAMP检测可在1h内完成,检出限为103拷贝/反应,灵敏度比经典PCR高10倍,与其他杆菌群细菌无交叉反应,平均试验间变异系数小于5％.反应时间与模板浓度有良好的线性关系(R2=0.9891).结论 该方法快速、灵敏、特异、操作简单、设备要求低的特点,适合基层医疗卫生机构和现场查验机构的广泛应用.
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环介导等温扩增技术检测痰标本中结核分枝杆菌的研究
[目的]寻找1种快速的,且敏感度高,特异性强的结核分枝杆菌的检测方法.[方法]环介导等温扩增基因检测(Loop-mediated isothermal amplification LAMP)是一种便捷、灵敏度高而又特异性强的核酸基因扩增检测技术.本课题组根据结核分枝杆菌gyrB特征性序列设计3对特征性引物对痰液中和培养基中的结核分枝杆菌进行检测.其中1对环状引物结合于特征性序列中环状结构部分,可极大地加快LAMP反应速度,且不干扰内引物在LAMP反应中作用.[结果]实验结果表明:使用环状引物的LAMP反应可在0.5h内完成,总共分析时间不超过1h.LAMP检测技术的灵敏度比经典PCR技术高100倍左右,LAMP检测技术具有与实时PCR(Real-time PCR)技术相同的特异度.另外,由于LAMP检测技术是在恒温的情况下进行,不需要特别昂贵的仪器设备,检测方法简单,结果判定直接.[结论]该方法的特点和优势可以使之在基层实验室及现场监测方面广泛使用,在快速检测方面具有一定的开发潜力.
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使用环介导等温扩增技术快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的初步研究
目的 探索建立一种快速、简单的食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测方法.方法 针对编码O157:H7脂多糖的rfbE基因(GenBank S83460)和编码H7鞭毛抗原的fliC基因(GenBank L07388)特征性保守序列,利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)核酸扩增基因技术,对21株O157:H7和非O157:H7菌株进行特异性检测,并与聚合酶链式反应方法进行比较.同时使用部分食品样品对LAMP法检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的实际运用价值进行评估.结果 LAMP法可以在1h内完成检测工作.LAMP法检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的灵敏度为96.72%,特异度为85.71%,准确性为93.26%.结论 LAMP检测技术的灵敏度较聚合酶链式反应技术高.LAMP是一种简单、快速的检测技术,适用于筛选可疑大肠杆菌O157:H7样本.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157 H7 环介导等温扩增 rfbE基因 fliC基因 -
食品中大肠杆菌0157∶H7的几种检测方法的比较
目的 评估平板分离培养法、免疫磁珠分离(IMS)法、VIDAS全自动酶标免疫测试系统、BAX全自动病原菌检测系统及环介导等温扩增(LAMP)技术在食品中检验肠出血型大肠埃希菌0157:H7的特异性、敏感性.方法 使用平板分离培养法、免疫磁珠分离法、VIDAS法、BAX法及LAMP法对人工制备的染菌猪肉样本进行检测,并对这几种方法进行比较.结果 BAX法和LAMP法的检出率高,分别是89.1％和85.9％,免疫磁珠法和VIDAS法检出率次之,分别是75.0％和78.1％,传统分离培养法为43.8％.结论 BAX法和LAMP法具有快速、高效、特异性好、敏感性高的特点,可快速筛选食品中可能存在的肠出血型大肠埃希菌0157∶H7.
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环介导等温扩增方法在食品中沙门菌检测的应用和评价
目的 将环介导等温扩增检测方法应用于食品中沙门菌的检验,并在检测方法特异性、灵敏度等方面与实时荧光PCR和传统检测方法进行比较.方法 针对沙门菌属高度保守的fim Y基因设计环介导等温扩增检测引物并优化反应体系,在特异性、灵敏度和实际样品检测等方面与实时荧光PCR及传统检测方法比对.结果 本研究建立的LAMP方法检测沙门菌93株和非目标菌31株,具有良好的特异性.在纯培养、无需增菌情况下,其检测灵敏度为6.4×102 cfu/ml,与实时荧光PCR方法相当.食品基质添加试验中,环介导等温扩增方法检测低限为2 cfu/25 g样品;对45份实际食品样品检测结果表明,该方法实际样品检出率为11.1％,与实时荧光PCR及传统方法检测结果一致.结论 本研究建立的沙门菌环介导等温扩增检测方法具有良好的特异性,检测灵敏度与实时荧光PCR相当,适用于沙门菌的快速筛选.
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免疫磁珠-环介导等温扩增联用技术快速检测副溶血性弧菌方法的建立
目的 建立一种快速且质优价廉的检测副溶血性弧菌的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法.方法 制备副溶血性弧菌跨膜转录调控蛋白toxR多克隆抗体,鉴定纯化后,进行磁珠包被制成免疫磁珠.利用免疫磁珠分离法和环介导等温扩增联用完成对副溶血性弧菌的检测,扩增产物经SYBR Green I染色肉眼观察和电泳鉴定.将副溶血性弧菌菌液作一系列稀释后,运用LAMP法进行敏感性检测,利用副溶血性弧菌和非副溶血性弧菌来验证LAMP方法的特异性.结果 LAMP检测副溶血性弧菌的检测下限为105 CFU/ml.副溶血性弧菌出现LAMP特征性扩增反应,非副溶血性弧菌未出现LAMP扩增.结论 LAMP检测方法为快速诊断试剂盒打下实验基础,适合日常监测,可满足快速检测的需要.
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环介导等温扩增方法检测食品中单核细胞增生李斯特菌的效果和评价
目的 将环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法应用于食品中单核细胞增生李斯特菌的检验,并在检测方法特异性、灵敏度等方面与实时荧光PCR和传统方法进行比较.方法 针对单核细胞增生李斯特菌hly溶血素基因设计LAMP引物,应用LAMP方法对88株单核细胞增生李斯特菌、1株单核细胞增生李斯特菌参考菌株ATCC 15313、33株非目标菌进行检测；并进行食品基质添加实验及对样品进行检测,同时应用实时荧光PCR方法和ISO 11290-1方法进行平行检测.对3种检测方法的特异性、灵敏度、检测低限及实际样品检验的结果进行比较.结果 LAMP和荧光PCR对89株单核细胞增生李斯特菌的检验结果均为阳性(100％,89/89),33株非目标菌的检测结果均为阴性(100％,33/33).LAMP方法的检测灵敏度为2×102 CFU/ml,与实时荧光PCR方法(2×102 CFU/ml)相同,且优于ISO 11290-1方法(2×104 CFU/ml).食品基质添加实验结果显示,3种检测方法的检测低限均为3 CFU/25 g样品.实际食品样品检测结果显示,3种方法单核细胞增生李斯特菌的检出率均为4％(2/45).结论 本研究建立的单核细胞增生李斯特菌LAMP检测方法具有良好的特异性,检测灵敏度与实时荧光PCR相当,适用于单核细胞增生李斯特菌的快速筛选.
关键词： 核酸扩增技术 聚合酶链反应 食品 单核细胞增生李斯特菌 环介导等温扩增 -
应用环介导等温扩增技术快速检测副溶血弧菌
目的 建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的副溶血弧菌快速检测方法.方法 针对副溶血弧菌toxR基因序列设计一套LAMP引物,应用LAMP技术对33株副溶血弧菌、22株其他种属细菌及含不同副溶血弧菌参考菌株( ATCC 17802)基因组拷贝数(5×100 ～5×105拷贝/μl)的样品进行检测,对平行样品分别应用普通PCR法和TaqMan探针实时PCR法进行检测,对3种检测方法的特异度、灵敏度及检测下限及反应时间进行比较.结果 LAMP技术、普通PCR法、TaqMan探针实时PCR法检测副溶血弧菌的特异度、灵敏度均为100％(分别为22/22,33/33),检测下限分别为5×101、5×103、5×102拷贝/μl,反应所需时长分别为22 main、3h、50 min.结论 与普通PCR、TaqMan 探针实时PCR检测相比,LAMP技术检测下限低,检测时长短,适于对副溶血弧菌进行快速检测.
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环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用
环介导等温扩增(LAMP)技术是近年发展起来的一项新的快速核酸恒温扩增技术,具有高效、快速、特异、易检测、易操作等特点,自面世以来被科学家认为是能替代常规PCR的一项扩增技术,非常适用于现场检测和基层检测.本文就LAMP技术的原理、特点、进展及其在病原微生物检测中的应用进行了简要的概述.
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马尔堡病毒LAMP可视化快速检测方法的建立
目的 建立马尔堡病毒的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)可视化快速检测方法. 方法 人工合成马尔堡病毒保守的核蛋白(Nucleoprotein,NP)编码基因作为阳性标准品,设计LAMP扩增引物,以HNB作为可视化指示剂,通过LAMP浊度仪测定方法的灵敏度和特异性.并与常规PCR、实时荧光定量PCR作比较. 结果 建立的LAMP方法的灵敏度为100拷贝/μl,高于常规PCR及实时荧光定量PCR的灵敏度103拷贝/μl和102拷贝/μl,方法的特异性好,仅马尔堡病毒有扩增曲线且HNB指示剂颜色发生阳性改变,其他病毒扩增均为阴性.体系的扩增效率较高,试验仅需30 min. 结论 建立的HNB-LAMP检测方法简便、快速、灵敏、特异,适用于马尔堡病毒的可视化快速检测.
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沙门氏菌LAMP检测方法的建立
目的 建立检测沙门氏菌的环介导等温扩增技术. 方法 针对沙门氏菌侵袭蛋白基因(invA),用LAMP引物在线设计软件设计4条特异性引物(内、外引物各2条),建立了快速检测食品中沙门氏菌的环介导等温扩增方法.对dNTP浓度、Mg2+浓度、内引物浓度和外引物浓度等反应条件进行优化,并测定方法的特异性和灵敏度,然后用该方法对猪肉模拟样品和猪肉实物样品进行检测. 结果 优化的LAMP反应体系为:0.8 mmol/L dNTP,6.0 mmol/LMgCl2,0.2μmol/L外引物F3和B3,1.6 μmol/L内引物FIP和BIP.对6种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅含invA基因的沙门氏菌扩增阳性.对细菌纯培养物检测的灵敏度为101 cfu/ml,对猪肉模拟样品检测的灵敏度为102 cfu/g.采用环介导等温扩增方法检测57份猪肉实物样品,invA基因阳性5份.LAMP方法检测(包括DNA提取、LAMP反应和电泳分析)可在2h内完成. 结论 检测沙门氏菌的环介导等温扩增方法快速、灵敏、特异,适合在基层食源性疾病监测和应急检测中应用.
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环介导等温扩增与实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌的比较
目的 为快速、特异、灵敏的检测和鉴定布鲁氏菌,本研究依据环介导等温扩增技术与实时荧光定量PCR技术原理设计引物,建立两种检测布鲁氏菌的方法并进行评价. 方法 根据布鲁氏菌OMP31基因序列设计6条LAMP引物和2条Real-time PCR引物,对新疆医科大学第一附属医院院确诊的10例布鲁氏菌病患者全血标本进行DNA检测.LAMP反应前加入羟基萘芬蓝(HNB)作为扩增指示剂,根据指示剂的颜色变化判定结果,并比较两种方法的特异性及灵敏度差异. 结果 LAMP反应只需30～60 min完成,在检测特异性和灵敏度方面两者结果相同,均能检出100个拷贝数的质粒DNA,且均无假阳性. 结论 LAMP方法快速、简便,经济,无需专用仪器设备,更适用于基层医院对布鲁氏菌的快速检测.
关键词： 布鲁氏菌 环介导等温扩增 Real-time PCR OMP31基因 -
犬细粒棘球绦虫感染LAMP检出日期的确定
目的 确定犬细粒棘球绦虫感染环介导等温扩增技术(LAMP)早检出日期.方法 家犬8只,口服喂饲细粒棘球绦虫原头节,建立细粒棘球绦虫感染动物模型.感染后40 d收集犬粪,用LAMP检测粪便中细粒棘球绦虫目的基因并与传统的PCR比较.结果 8只犬均获得细粒棘球绦虫感染,感染后第18dLAMP法检查犬粪中细粒棘球绦虫目的基因均阳性,较普通PCR法提早2d.结论 LAMP法简便、快捷、灵敏,有望成为早期诊断犬细粒棘球绦虫感染的重要手段.
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等温扩增法用于孕妇B族链球菌感染筛查的研究
目的 建立可用于快速筛查孕妇B族链球菌(GBS)的等温扩增法. 方法 培养GBS并提取基因组DNA.根据其cfb基因设计LAMP(环介导等温扩增)和RPA(重组酶聚合酶扩增)反应引物,进行目的基因扩增.采集临床标本50份,同时用两种方法进行检测,评价方法的特异性和敏感性. 结果 LAMP可在45 min完成基因扩增,RPA法可在15 min完成目的基因的扩增.二者均具有高度敏感性和特异性,低检出浓度均为0.01 ng DNA/μl.检测50份临床标本LAMP法4份阳性,RRP法5份阳性(其中1份假阳性). 结论 LAMP和RPA均不依赖特定仪器,在恒温条件下即可完成目的基因扩增,以LAMP方法操作更简单、快速,特异性更高,可用于女性孕期GBS感染筛查.
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环介导等温扩增技术及其在寄生虫学研究中的应用
环介导等温扩增(LAMP)技术是利用2对特殊设计的引物,一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效地扩增DNA的新技术,扩增产物为一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物,电泳图谱呈阶梯式带状分布,反应伴有白色的副产物焦磷酸镁沉淀产生,可通过肉眼定性判断反应结果:.作为一种新的核酸扩增技术,已被应用于疟疾、血吸虫等寄生虫的研究中.LAMP方法:敏感、特异,简便,在寄生虫学研究中有广阔的应用前景.
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分子生物学技术在疟原虫研究中的应用
疟原虫是单细胞原生动物,目前诊断方法以显微镜检查和快速诊断实验为主,但随着分子生物学技术的不断发展,逐步建立了核酸探针技术、PCR及其衍生技术、环介导等温扩增等分子生物学技术,使疟疾诊断工作方法日益完善.通过应用分子生物学的方法,对虫种的基因型、抗药性也有了更深刻的认识.本文对疟原虫分子生物学技术的应用进展进行综述.
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应用简便逆转录环介导等温扩增方法检测麻疹病毒核酸
目的 应用简便快速的核酸检测新方法--逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)检测麻疹病毒核酸,并与巢式逆转录多聚酶链式反应(nest-RT-PCR)方法进行比较.方法 比较RT-LAMP方法与nest-RT-PCR方法对吉林省历年麻疹病毒分离株以及临床疑似麻疹咽试子中麻疹病毒核酸检测的检出率.结果 两种方法对23株麻疹分离株麻疹病毒核酸阳性检出率均达到100%.针对18份麻疹病毒分离阴性的临床疑似麻疹咽试子分别利用RT-LAMP和巢式RT-PCR两种方法进行麻疹核酸检测,RT-LAMP方法阳性率为56.52%,巢式RT-PCR方法阳性率为47.83%.结论 RT-LAMP方法比巢式nest-RT-PCR方法更敏感.
