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采用脉冲场凝胶电泳和自动化核糖体分型技术分析MPN法分离出的副溶血性弧菌的同源性
目的 对15管MPN法分离的78株副溶血性弧菌进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)和自动化核糖体分型(RP)研究,以确定其同源性.方法 EcoR I酶切DNA进行核糖体分型;限制性内切酶Sfi I和Not I在50℃和37℃酶切包被的染色体DNA,进行脉冲场凝胶电泳分析,两者的结果均用BioNumerics软件进行聚类分析.结果 78株副溶血性弧菌用EcoR I、Sfi I、Not I酶切后各产生64、68、71种带型,同一样品中分离的菌株有的带型完全相同,但大部分带型不同,且划分到不同的群中.结论 PFGE是一种快速、有力、重复性好的分型技术,而且分辨能力要高于核糖体分型;在今后的溯源研究中,要考虑对可疑食品采用MPN定量法挑取多个菌落进行亲缘关系分析,防止漏检.
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改良方法检验冷冻海产品中副溶血性弧菌
[目的]建立一种有效、可靠的方法检验冷冻海产品中副溶血性弧菌,弥补传统法的局限.[方法]用改进碱性胨水(MAPW)和盐结晶紫增菌液(SVPE)同时对5种冷冻海产品50份样进行增菌后,分别接种至科玛嘉弧菌显色培养基(CV)和硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基(TCBS),以评估2种增菌液和2种分离培养基的效果;随机选取改良方法检出的10个分离株,用PCR技术扩增副溶血性弧菌特有tl基因,以认证改良方法的准确性.[结果]当采用改良方法,即MAPW增菌CV分离时,检出率为100%;当采用传统法即SVPE增菌TCBS分离时,检出率为60%-80%;用PCR技术在所选取的10个分离株中都扩增出了tl基因.[结论]改良方法是一种高效、准确的检验方法.
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一种海马肠道疾病病原体的鉴定及其对抗生素的敏感性研究
[目的]研究海马致病病原体,筛选不同用途海马的高效病害治疗物,促进我国海马养殖的发展.[方法]室外采集标本分离患病海马病原体,从患病海马体内分离到3株菌株,用分离菌株的纯培养物感染健康海马.[结果]48h内实验海马发病,其临床症状与原患病海马相似,经形态学、生化和室内感染试验鉴定为副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus).药敏试验表明,所分离菌株对链霉素、利副平、卡那霉素、环丙沙星、氟派酸、四环素、复达欣、菌必治、奈定酸等抗菌药表现为高敏感性;对红霉素、新霉素、先锋霉素Ⅵ、强力霉素、新生霉素、头孢呋肟、呋喃妥因等药物敏感性较高;对氨苄青霉素、羟苄青霉素、头孢氨苄、林可霉素等药物敏感性较差.[结论]弧菌对海马的致病性作用很明显,但不同的情况下表现不同.不同的药物对弧菌的作用不同,而不同用途的海马其所用药物也不尽相同.
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水产品中致病性弧菌PCR快速检测研究
[目的]建立一种快速、准确、特异的方法,快速检测和鉴定出食品中的非致病性和致病性霍乱弧菌与副溶血性弧菌.[方法]针对霍乱弧菌的种特异性基因ompW、毒力基因tcpA、ctxA和副溶血性弧菌的种特异性基因tl、毒力基因tdh设计引物,建立PCR检测体系.[结果]检测结果显示,该方法能够特异性检出副溶血性弧菌或霍乱弧菌,并进一步确定其是否携带tdh、tcpA或ctxA毒力基因,检测的灵敏度可达到5×10(1)cfu/ml菌浓度.[结论]与传统方法比较,该方法快速、特异、灵敏,能在较短时间内对大量水产品样品进行检测.
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Taqman MGB探针实时PCR快速检测副溶血性弧菌
[目的]建立一种对食品中副溶血性弧菌的快速检测方法.[方法]根据GenBank公布的副溶血性弧菌的toxR基因的保守序列,设计1对引物和Taqman MGB探针,建立基于Taqman MGB探针的实时PCR快速检测副溶血性弧菌方法.[结果]通过对20种细菌的DNA进行扩增,结果6株副溶血性弧菌均可产生特异性扩增,与其他细菌无交叉反应;对纯菌而言,菌液灵敏度为23/ml,DNA浓度为130pg.定量关系式为:y=3.353151 Ln(x)+43.797989,R2=0.947952.67份冷冻海产品中2份副溶血性弧菌实时PCR检测结果阳性,相对应的有1份样品副溶血性弧菌培养阳性,检测时间仅需2h.[结论]该反应体系具有高度的灵敏度和极高的特异性,可用于食品和食物中毒样品中副溶血性弧菌的快速检测.
关键词： 弧菌 副溶血性 Taqman MGB探针 toxR基因 快速检测 -
宁波市小水产品中副溶血性弧菌的血清型、毒力及耐药性研究
目的 了解宁波市小水产品中副溶血性弧茵血清群分布、产毒素特性及耐药性,为防治副溶血性弧茵引起的食源性疾病提供依据.方法 参照GB/T4789.7-2003用标准血清和PER进行分型,用PER测定tdh和trh毒力基因;用纸片扩散法进行药敏试验.结果 27株副溶血性弧茵分属于9个血清群,分别为0:4群占33.3%(9/27)、0:3群占14.8%(4/27)、0:2群占14.8%(4/27)、0:11群占11.1%(3/27)、0:5群占7.4%(2/27)、0:1群占7.4%(2/27)、0:7群占3.7%(1127)、0:9群占3.7%(1127)、0:10群占3.7%(1/27).27株副溶血性弧菌的协与trh毒力基因均阴性.药敏试验结果显示,27株副溶血性弧菌对青霉素类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类、喹诺酮类、头孢类药物都有耐药株出现.结论 宁波市小水产品分离的副溶血性弧茵具有血清分群多样性.药敏结果多重耐药性的特点.
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北京口岸进口鲜活海产品中副溶血性弧菌致病性分析
目的 调查从北京口岸进口的鲜活海产品中是否存在致病性副溶血性弧菌. 方法 对2005年从北京口岸进口的鲜活海产品中分离的267株副溶血性孤菌(Vibrio parahaemolyticus)的尿素酶活性、神奈川现象和毒性基因(tdh和trh)进行了检测. 结果 267株副溶血性弧菌中27株尿素酶呈阳性,其中14株菌tdh基因和trh基因呈阳性.tdh基因和trh基因呈阳性的14株菌中有10株菌神奈川现象为阳性,并且全部分离自从加拿大进口的象拔蚌. 结论 北京口岸进口的鲜活海产品中存在致病性副溶血性孤菌,主要集中在象拔蚌中.应对从加拿大进口的象拔蚌加强监管,防止致病性副溶血性弧菌引起食物中毒发生.
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食品中副溶血性弧菌PCR快速检测方法的研究
为建立食品中副溶血性弧菌(VP)的PCR检测方法,选取tl基因作为靶序列设计一对引物,用该引物对14株从国内食品中分离的副溶血性弧菌(经传统方法验证)和30株非副溶血性弧菌进行PCR扩增,并用此方法对人工污染食品进行检测.扩增片段表现出极好的特异性,对人工污染的冷冻虾仁、沙丁鱼的检出限为10 CFU/g,且与传统方法结果吻合.该方法适宜于食品中副溶血性孤菌的检测.
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PCR法制备地高辛标记DNA探针斑点杂交检测副溶血性弧菌tlh基因
目的 建立检测副溶血性弧菌种特异性tlh基因的斑点杂交方法.方法 采用PCR法制备地高辛标记DNA探针,建立斑点杂交条件.杂交反应条件优化如下:杂交温度65℃,杂交时间9～12 h,探针使用浓度100～125 pg/ml.结果 地高辛标记tlh基因探针长度为450 bp,标记产量为50 μg/ml.探针具有较高的灵敏度和特异性,可重复使用4次.结论 本方法具有快速、简便、高效的特点,适用于副溶血性弧菌菌株的鉴定.
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温暖月份零售带壳牡蛎中副溶血性弧菌的定量研究
为了解温暖月份零售带壳牡蛎中副溶血性弧菌(VP)的污染情况,2003年4～8月在福建省福州和厦门两地共收集带壳牡蛎113份,样品分别来自水产品批发市场(18%),零售市场(46%)和饭店(36%).采用Vitek鉴定系统和可能数法进行VP的定量分析.结果显示,带壳牡蛎中VP密度的几何均数为60 MPN/100g,41.6%的样品VP密度低于30 MPN/100g的低检出限,仅厦门2个样品菌量超过24 000 MPN/100g.两个地区、不同采样点和不同月份之间样品VP密度的几何均数差别均有统计学意义(P＜0.01).厦门样品污染菌量高于福州;批发市场样品菌量高;5月份样品菌量高,为149 MPN/100g,而6～8月样品菌量约为40 MPN/100g.零售环节带壳牡蛎VP的检出率较高.未来应加强对生食海产品中VP污染状况的监测.
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2000-2007年上海市副溶血性弧菌致集体性食物中毒分析及对策
目的 了解上海市副溶血性弧茵致集体性食物中毒的特征.方法 收集整理2000-2007年上海市集体性食物中毒资料,对由副溶血性弧茵所致集体性食物中毒事件进行统计分析.结果 8年间副溶血性弧茴致集体性食物中毒事件起数和涉及患者人数分别占同期食物中毒事件起数和患者人数的57.4%和56.0%.5～10月是上海市副溶血性弧菌致集体性食物中毒的多发期,7、8、9月为高峰.发生的原因主要是生熟交叉污染(58.6%)和加工人员污染(18.6%).主要中毒食品是混合食品(71.4%,如盒饭和桶饭)、畜禽肉加工制品(16.4%)和水产品(8.6%).宾馆饭店是首要责任单位(33.6%),其次是集体供餐中的外送盒饭(21.4%)和单位集体食堂(20.5%).结论 副溶血性弧茵是上海市集体性食物中毒的首要致病原,应在高温季节对餐饮和集体供餐单位加强预防生熟交叉污染的培训和监督.
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上海市市售带壳牡蛎微生物污染状况调查
目的 了解上海市市售带壳牡蛎的微生物污染状况.方法 2005年4月至2006年3月在上海市水产品批发市场每月2次采集牡蛎样品,共抽取了24份.按照GB/T 4789-2003《食品卫生微生物学检验》中检验规程进行微生物检测.结果 所有抽检样品均不合格,污染严重的是大肠菌群,所检样品均超标,高污染量达1.4×106 MPN/g;其次是菌落总数,超标率达41.7%,高污染量达2.6×107 CFU/g;副溶血性弧菌污染也比较严重,检出率达29.2%,污染量在3.0×102～7.4×102 MPN/100 g;单核细胞增生李斯特菌未检出.结论 上海市市售带壳牡蛎的微生物污染状况不容乐观,已对消费者健康构成了潜在威胁.
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汕头市2005-2007年食源性致病菌监测
目的 了解汕头市2005-2007年食品中沙门菌、单核细胞增生性李斯特菌、肠出血性大肠杆菌(O157:H7)、副溶血性弧茵的污染情况.方法 按"<广东省食源性致病菌监测计划>检测技术要求"的检验方法 进行.结果 在采集的237份食品样品中,共检出5份沙门菌、8份单核细胞增生性李斯特菌和13份副溶血性弧菌.检出率分别为2.50%、3.38%和32.50%.未检出肠出血性大肠杆菌(O157:H7).以水产品和生肉食品食源性致病菌污染为严重.结论 应加强水产品和生肉食品食源性致病菌污染的监测.
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不同来源的副溶血性弧菌生物学特性研究
为掌握浙江省不同来源的副溶血性弧菌的血清型分布及毒力基因携带情况,采用血清凝集试验对333株副溶血性弧菌进行血清型分型,采用PCR技术检测副溶血性弧菌的毒力基因TDH.临床副溶血性弧菌菌株血清型分布于7个O抗原群,以O3为主,占临床菌株数的71.81%; O4血清型与往年相比有所上升,占到了16.60%.海产品菌株的血清型分布于8个O抗原群,以O5为主,占所有海产品菌株的47.30%.临床菌株的TDH检出率为95.65%,海产品菌株的TDH检出率为6.06%.血清型相同但来源不同的菌株的TDH检出率不同.浙江省从海产品中分离出的副溶血性弧菌菌株与分离自食源性疾病患者的副溶血性弧菌菌株的主要血清型、毒力基因TDH都存在差别.该工作为预防副溶血性弧菌引起的食品中毒提供了科学依据.
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不同来源的副溶血性弧菌定性定量分析及毒素基因检测
目的 研究受污染海产品、海产品养殖水及食物中毒临床分离的副溶血性弧菌的生化特性、种特异性基因片段检测方法的应用和毒素基因携带情况.方法 66株副溶血性弧菌采用全自动微生物鉴定、MPN值定量、氯化物含量(离子色谱法)、R72H基因片段和tdh、trh毒素基因PCR检测等方法进行研究.结果 定性定量分析方面,98.5%的菌株不发酵阿拉伯糖;牡蛎样本MPN值均为≥24 000/100 g,并检出2株携带trh毒素基因;23/30份养殖水检出副溶血性弧菌,其中海丰监测点6份阳性水样的氯化物含量均值仅为3 160 mg/L,显著低于实验室培养的30g/L的含量.基因检测方面,VITEK鉴定R72H基因片段结果与检测相符;13株食物中毒临床分离株均携带tdh毒素基因;6.7%的海产品分离株、15.4%食物中毒临床来源株同时携带两种毒素基因.结论 通过从海产品和养殖水的检出情况以及分离株的生化特性、毒素基因资料,为副溶血性弧菌食物中毒溯源提供重要的数据源.
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2007年江苏省食源性致病菌监测分析
目的 监测江苏省主要食源性致病菌污染状况,确定本地区高危食品.为预防控制食源性疾病提供科学依据.方法 依据GB/T 4789-2003食品卫生微生物学检验方法,对样品分别进行沙门菌、单核细胞增生性李斯特菌、大肠杆菌O157:H7、空肠弯曲菌和副溶血性弧菌进行分离,生化及血清学鉴定.结果 共监测生畜禽肉、熟内制品、生食蔬菜、水产品8类样品共804件,检出致病菌113株,总检出率14.1%(113/804).其中沙门菌检出33株,检出率为4.1%(33,804),单核细胞增生性李斯特菌检出41株,检出率5.6%(41/738);副溶血性弧菌检出13株,检出率为11.2%(13/116);金黄色葡萄球菌检出率15.9%(24/151);大肠杆菌O157:H7检出2株,检出率0.41%(2/493);空肠弯曲菌和阪崎肠杆菌未检出.33株沙门菌经血清型鉴定.分离出9种血清型,主要是德尔卑沙门菌,其次为罗米他沙门菌和鸭沙门菌.结论 江苏省地区食品存在食源性致病菌污染,其中水产品和生肉是主要污染食品品种,而熟肉和生食水产品导致食源性疾病的风险较高.
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应用双重Real-time PCR同步定量检测食品中的副溶血性弧菌及金黄色葡萄球菌
为同时测定食品中的副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌,建立了基于TaqMan探针的双重Real-time PCR方法.针对副溶血性弧菌的gyrB基因序列和金黄色葡萄球菌coa基因序列分别设计引物和TaqMan探针,建立双重Real-time PCR 检测体系,制作校正曲线,同步定量检测副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌.建立的双重Real-time PCR方法对2种细菌菌液的检测敏感度均低于10 CFU/PCR反应体系,相关系数均为1.00,整个试验可在2 h内完成.建立的方法可用于食品中副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌的快速、同步、定量检测.
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2006-2008年广东省水产品和食物中毒患者副溶血性弧菌分离株血清分型研究
目的 研究2006-2008年广东地区副溶血性弧菌食物中毒患者分离株和水产品分离株的血清型分布.方法 采用血清玻片凝集试验对2006-2008年我中心收集的279株副溶血性弧菌进行血清分型,这些菌株均由广东省食品污染物监测网和省食源性致病菌监测网分离获得,分离地区覆盖广东的粤西、粤北、粤东和珠三角地区,其中食物中毒患者分离株176株,水产品分离株103株.结果 2006-2008年收集的279株副溶血性弧菌中,在176株食物中毒患者分离株中完全分型168株,分型率为95.45%,共分出15个血清型,以O3:K6为主,占73.30%(129/176);在103株水产品分离株中完全分型57株,分型率为55.34%,其血清型别分布较分散,未见优势菌型,共分出40个血清型,主要集中在O1,O2,O3,O4,O5,O10,O11等7个菌群.结论 2006-2008年广东各地区上送的副溶血性弧菌食物中毒患者分离株以O3:K6为主,血清型地区差异不明显;水产品分离株血清型呈多样性,且与食物中毒患者分离株的血清型不一致.
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2种弧菌的实时荧光PCR快速检测
目的 为快速、特异、灵敏的检测致病性弧菌,建立致病性弧菌的实时荧光PCR方法.方法 针对霍乱弧菌的种特异性基因omp W、毒力基因tcp A、ctx A和副溶血性弧菌的种特异性基因tl、毒力基因tdh计引物和Taqman荧光探针,建立实时荧光PCR检测方法.结果 该方法能够特异性地检出副溶血性弧茼或霍乱弧菌,并进一步确定其是否携带tdh、tcp A或ctx A毒力基因,检测的灵敏度可达到10 CFU/ml或0.171 6 μg/ml(pg/μl)DNA模板浓度.结论 该方法特异性强、灵敏度高,适用于食品中致病性弧菌的快速检验.
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丹东口岸2003-2005年进口海产品中3种致病菌的检验
目的 掌握丹东口岸进口海产品中单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和副溶血性弧菌污染情况. 方法 对丹东口岸2003-2005年进口的海产品3种致病菌的检验结果进行了分析. 结果 1 965批进口海产品中检出不合格产品44批(2.24%).其中32批(1.63%)检出单核细胞增生李斯特菌、6批(0.31%)检出沙门菌和6批(0.31%)检出副溶血性弧菌.不合格产品主要为冻章鱼、冻海螺、冻紫石房蛤、活河螺、冻河螺肉等. 结论 从丹东口岸进口的海产品3种致病菌的污染比较严重,特别是被单核细胞增生李斯特菌的污染严重,海产品中冻章鱼和冻海螺被这3种致病菌的污染比较普遍.
