宫内苯并(a)芘暴露对胎儿癌症相关基因表达的影响

目的 初步探讨宫内苯并(a)芘(BaP)暴露对胎儿癌症相关基因表达的影响.方法 用高效液相色谱法检测20份新生儿脐带血血清中BaP的浓度,并按照BaP浓度将样本分成不同暴露组,用实时荧光定量PCR检测脐带血RPL27A(ribosomal protein L27a)、NUDT2 (Nudix (nucleoside diphosphate linked moiety X)-type motif 2)和E2F1(E2F transcription factor 1)基因的表达,分析不同BaP暴露水平与癌症相关基因表达的关系.结果 20份脐带血血清BaP平均浓度为0.38±0.31 μg/L.按照血清BaP浓度,将20份样本分成5个不同水平的暴露组.随着BaP暴露水平的增高,RPL27A和NUDT2呈现表达上调的趋势,而E2F1呈现表达下调的趋势.结论 宫内BaP暴露可引起胎儿癌症相关基因表达的改变.

实时荧光定量-聚合酶链反应方法检测肺炎支原体

目的 建立一种快速、灵敏、特异的肺炎支原体实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR)检测方法,以期用于临床肺炎支原体感染检测.方法 通过测序分析和序列比对,选取肺炎支原体p1基因中保守区域设计特异性引物和荧光探针,建立和完善此real-time PCR检测方法,并进行扩增效率、灵敏度及特异度评价.与已报道的肺炎支原体常规聚合酶链反应(PCR)方法进行150份临床标本检测能力比较.结果 建立的real-time PCR方法对肺炎支原体的检测限约为10 cfu.使用该方法对9株肺炎支原体ATCC标准株和30株临床分离株核酸扩增均为阳性；对10种其他支原体、13种常见呼吸道病原菌染色体及人类染色体扩增结果均为阴性.同时,临床标本的检测结果显示该方法检测灵敏度优于常规PCR.结论 本研究建立的real-time PCR方法可快速、灵敏、特异地检测标本中肺炎支原体核酸,可适用于临床肺炎支原体诊断.

TaqMan MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应检测人粒细胞无形体Msp2基因方法的建立

目的 建立敏感、特异、实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative,FQ-PCR)方法,用于人粒细胞无形体病的检测.方法 根据无形体特异外膜蛋白Msp2基因为靶基因设计引物以及TaqMan MGB探针,建立FQ-PCR方法,并对湖北省随州和河北省张家口地区的蜱标本进行了检测.结果 本研究建立的TaqMan MGB探针具有良好的特异性,建立的FQ-PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.99),灵敏性评估发现每个20 μl PCR反应管中只要有35个拷贝的目的基因即可被检测到,即低检出浓度为2拷贝/μl,并且具有较好的重复性.共检测蜱标本426只,其中豪猪血蜱253只,共49组,阳性7份.结论 本研究建立的FQ-PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于人粒细胞无形体感染的快速检测.进一步证实了豪猪血蜱可能是粒细胞无形体的媒介宿主.

实时荧光定量聚合酶链反应检测血清2型猪链球菌的研究

目的 基于TaqMan-MGB探针实时荧光定量聚合酶链反应(Real.time PCR)技术,建立针对血清2型猪链球菌的快速检测方法.方法 针对血清2型猪链球菌的csp2J基因序列,应用Beacon Designer 7.0,设计了引物和TaqMan-MGB探针,建立Real-time PCR检测方法;把目的 片段克隆到pMD18-T载体制作标准曲线;以常见致病菌及条件致病菌验证引物探针的特异性;制备血液模拟标本评价本方法在临床标本中的应用.结果 由标准曲线可知该方法可以检测到100拷贝/反应体系的目的 基因,特异性检测显示只有血清2型猪链球菌有荧光信号,其他常见致病菌及条件致病菌均无荧光信号,血液模拟标本中3.9×10<'2>cfu/ml的细菌含量可被检出.结论 以csp2J为目的 基因建立的血清2型猪链球菌Real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性好、快速,可用于临床感染患者标本的初步筛查.

TnC基因在小鼠正常腭突发育和腭裂形成中的作用

目的 观察TnC基因在正常小鼠腭突发育和全反式视黄酸诱导的小鼠腭裂形成过程中的表达变化,探讨TnC基因的表达在腭裂发生中的作用.方法 利用real-time PCR和原位杂交方法动态检测TnC基因在正常腭突组织和全反式视黄酸诱导的腭裂组织中的表达情况.结果 real-time PCR结果表明,TnC在GD11～16正常腭突和腭裂组织中均有表达,在正常腭中第16天TnC表达丰度高,与其他胚龄相比较差异有统计学意义.在腭裂组中的表达丰度明显低于正常腭,差异有统计学意义;而在腭裂组织中各胚龄TnC的表达丰度差异无统计学意义.原位杂交结果显示,TnC在GD13、GD14天正常腭组织的腭板前部上皮细胞和间充质细胞中均有表达,而在GD14天腭板后部上皮细胞和间充质中虽有表达,量较少;TnC在GD13天腭裂前部间充质细胞中的表达量明显下降,在GD14天的腭裂腭板前部和后部的间充质细胞和上皮细胞中均未检测到TnC的表达.结论 TnC基因在维持小鼠腭突组织的生长发育中起重要作用,而在腭突组织中的抑制表达与腭裂的发生有关.

Mbd2基因在子宫内膜异位症中的表达

目的：探讨Mbd2在EMs患者发病过程中的可能作用。方法：Trizol法提取病变组织的总RNA，反转录生成cDNA，Blast-primer设计Mbd2 mRNA引物，Real-time PCR方法检测各组间Mbd2 mRNA表达变化。结果：EMs患者异位内膜、在位内膜中Mbd2 mRNA表达显著高于子宫肌瘤患者在位内膜(P＜0.01)；且EMs患者异位内膜中Mbd2 mRNA的表达显著高于在位内膜(P＜0.01)。结论：Mbd2基因参与子宫内膜异位症的发生，还可能为子宫内膜异位症的早期发现做出贡献。

Real-time PCR技术检测乳腺癌患者HER2和TOP2A基因的表达及相关性研究

目的:分析乳腺癌患者中HER2基因和DNA拓扑异构酶Ⅱα(TOP2A)基因表达,探究HER2和TOP2A基因的相关性在乳腺癌诊断中的应用价值.方法:选取本院2006年4月-2008年3月经病理证实的乳腺癌患者93例,乳腺良性肿瘤患者30例,另选择体检健康女性30例.应用Real-time PCR技术对乳腺癌组织HER2和TOP2A基因进行了定量分析.结果:乳腺癌患者HER2和TOP2A基因的表达量显著高于良性肿瘤患者及健康者,且乳腺癌患者中HER2和TOP2A基因的表达具有显著相关性.结论:乳腺癌患者中HER2和TOP2A基因的共同扩增可能在乳腺癌发生发展中起重要作用,联合检测HER2和TOP2A基因对于乳腺癌的靶向治疗具有重要意义.

溶血及宫颈黏液对人乳头状瘤病毒DNA检测结果的影响

目的 探讨溶血及宫颈黏液对人乳头状瘤病DNA检测结果的影响.方法 对含不同浓度血红蛋白(Hb)或宫颈黏液的宫颈脱落细胞样本,用Real-time PCR法进行HPV DNA检测.结果 Hb浓度为5、10 g/L的溶血样本组与未溶血样本相比HPV DNA Ct值结果差异无统计学意义(P＞0.05);但冻融解黏组、NaOH解黏组与黏液未处理组相比HPV DNA Ct值结果减小,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 HPV DNA扩增检测结果未受样本溶血影响,而样本中含黏液对HPV DNA检测结果有影响,但经冻融或NaOH解黏处理后可降低复检率.

荧光定量PCR检测急性呼吸道感染患者常见呼吸道病毒的研究

目的 分析2011年8月至2012年8月期间惠州市急性呼吸道感染病毒性病原谱的构成及流行特征,为临床诊断、治疗和呼吸道传染病的预防控制提供病原学依据.方法 应用荧光定量PCR方法,对485例鼻咽拭子样本同时进行甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、博卡病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、人冠状病毒的检测,并进行统计学分析.结果 485份样本中检出228份呼吸道病毒阳性的样本,阳性率为47.01％,其中混合感染20份,占阳性样本的8.77％.病毒病原谱构成前三位为乙型流感病毒、鼻病毒和甲型流感病毒.病毒检出阳性率的时间分布有一定规律性:1月至次年2月阳性率较高,不同月份检出的优势病毒不同.各年龄组病毒阳性率差异有统计学意义(x2=19.414,P＜0.05),不同年龄组病毒感染的病原谱构成也不同:0～5岁年龄组以鼻病毒为主；5岁以上各年龄组均以流感病毒为主.不同性别患者之间病毒核酸检出率差异无统计学意义(x2=0.522,P＞0.05).结论 乙型流感病毒、鼻病毒和甲型流感病毒是惠州市急性呼吸道感染主要病原体.部分病原体的感染与年龄和季节有一定的关联；ARTI患者中部分合并感染其他呼吸道病毒,应长期监测呼吸道病毒的活动水平.

致病性钩端螺旋体TaqMan Real-timePCR检测技术的建立及其应用

目的 建立致病性钩端螺旋体(钩体)TaqMan Real-time PCR检测技术.方法 以钩体16S rRNA基因的部分片段rrs基因作为靶基因,设计引物、TaqMan探针,PCR产物克隆到pMD 19-T载体,制作标准曲线,建立定量分析质控标准.利用中国15群15型致病性钩体参考菌株、16群21型非致病性钩体参考菌株、50株不同血清群致病性分离株及伯氏疏螺旋体、嗜肺军团菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌等27株其他常见致病菌检验引物、探针的灵敏性、特异性.将Real-timePCR、普通PCR同时应用于倍比稀释致病性钩体染色体DNA及25份现场鼠肾标本的检测.结果 建立、优化致病性钩体Real-time PCR技术,致病性钩体扩增荧光信号阳性,非致病性钩体及其他非钩体菌均无扩增.对于倍比稀释的质粒标准品,Real-time PCR和普通PCR的低检测下限分别是10 copy/μl和104copy/μl.对于倍比稀释的钩体染色体DNA,两者的低检测下限分别为:100 f/μl 和1 ng/μl.25份现场鼠肾标本检测显示,两种方法的检测结果一致.结论 以rrs为靶基因建立的Real-time PCR技术,具有较高的灵敏度和特异度,可用于致病性钩体的病原学检测.

臭牡丹总黄酮抑制小鼠 Lewis 肺癌实体瘤及其与 p53、bcl-2、bax 表达相关性研究

目的：探讨臭牡丹总黄酮对 Lewis 肺癌小鼠的抑瘤作用及其与 p53、bcl-2、bax 基因表达的相关性。方法：取近交系雄性 C57BL／6小鼠50只，造模，将造模成功的 Lewis 肺癌小鼠40只随机分成模型组，顺铂组，臭牡丹总黄酮高、低剂量组；另取10只无瘤小鼠作为空白对照组。腹腔注射给药，模型组给予生理盐水0.01 mL／g，连续14 d；顺铂组给予顺铂0.4 mg／kg 连续5 d；臭牡丹高、低剂量组分别予臭牡丹总黄酮提取物0.6 g／kg、0.3 g／（kg·d），连续14 d。给药结束后次日处死小鼠，称取瘤重，计算肿瘤抑制率，采用 Real-time PCR 法检测 p53、bcl-2及 bax mRNA 的表达水平。结果：1）对瘤重影响：4组瘤重结果如下（珋x ±s）：模型组（4.70＋1.29）g、顺铂组（2.24＋0.68）g、总黄酮高剂量组（3.26±1.06）g、总黄酮低剂量组（3.99±1.31）g；其中顺铂组、总黄酮高剂量组瘤重低于模型组（P ＜0.05），并且该2组瘤重无统计学意义（P ＞0.05）。2）肿瘤抑制率：顺铂组：53.4％；臭牡丹总黄酮高剂量组：30.6％，臭牡丹总黄酮低剂量组：15.1％。3）对基因表达影响：臭牡丹总黄酮高、低剂量组皆能上调 p53和 bax mRNA 表达（高剂量组 P ＜0.01，低剂量组 P ＜0.05）；顺铂组能下调bcl-2（P ＜0.05）及上调 bax mRNA 表达（P ＜0.01）。结论：臭牡丹总黄酮能够改善 Lewis 肺癌小鼠生存状况，能有效抑制肿瘤生长；并且其抑制肿瘤生长的分子机制可能与上调 p53和 bax mRNA 的表达以诱导肿瘤细胞凋亡有关。

ObjectiveThis study is aimed to develop a two-tube melting curve-based multiplex real time PCR assay (MCMRT-PCR) for the simultaneous detection of six common foodborne pathogenic bacteria (diarrhoeagenic Escherichia coli, Salmonella,andShigellain tube 1, Staphylococcus aureus,Vibrio parahaemolyticus, and Listeria monocytogenesin tube 2). MethodsA two-tube MCMRT-PCR assaywas performed on 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). Amplification by PCR was optimized to obtain high efficiency. The sensitivity and specificity of assays were investigated. ResultsThe detection limit of optimized MCMRT-PCR assay was 3.9×102 CFU/mLforS. aureus, 4.4×102 CFU/mL for L. monocytogenes, 3.0×102 CFU/mL forSalmonella, 2.5×102 CFU/mL forShigella, 2.1×102 CFU/mL forV. parahaemolyticus, and 1.2×102 CFU/mL forE.coli. The feasibility of MCMRT-PCR was further evaluated using artificially contaminated milk, the sensitivity was at the level of 105 CFU/mL. ConclusionA two-tube MCMRT-PCR assay using six primer sets was developed for detection of multiple pathogens. Our findings demonstrates that the proposed two-tube assay is reliable, useful and rapid for simultaneous detection of six foodborne pathogenic bacteria with an intended application in provincial Centers for Diseases Control and Prevention (CDC).

两种人乳头状瘤病毒检测方法的比较

目的 评价导流杂交和实时荧光定量(real-time)PCR对宫颈癌患者HPV感染检测的临床意义.方法 采用导流杂交和real-time PCR分别对190例患者进行HPV感染检测,并对检测结果进行分析.结果 在190例检测标本中,导流杂交法检测出113例HPV阳性,阳性检出率为59.5％,筛查宫颈癌的敏感度为58.1％,特异度为39.2％,阳性预测值为47.8％,阴性预测值为49.4％.real-time PCR检测出106例阳性,阳性检出率为55.8％,筛查宫颈癌的敏感度为54.8％,特异度为43.3％,阳性预测值为48.1％,阴性预测值为50.0％.导流杂交和real-time PCR检出的HPV阳性率差异无统计学意义,而且一致性检验显示两种方法具有较高的一致性(符合率为87.9％).结论 本研究结果表明,导流杂交和real-time PCR方法检测HPV未表现出较大的差异,在宫颈癌筛查中可以将两种方法结合使用,以提高检测的准确性,降低漏诊率.

RT-PCR技术在肺炎克雷伯菌耐药性方面的研究进展

肺炎克雷伯菌是一种能够引起一系列严重疾病的条件致病菌,近年来随着耐药肺炎克雷伯菌的广泛传播,real-time PCR技术在疾病早期检测其耐药基因显得尤为重要.本文就real-time PCR技术在诊断肺炎克雷伯菌耐药性方面的应用进行总结.

人肺癌组织中MCPH1基因过表达后协同化疗药物抑制肺癌A549细胞的增殖

目的 检测人肺癌组织中MCPH1基因表达,并用MCPH1真核过表达载体,检测其协同化疗药物对人肺癌细胞A549的影响.方法 用real-time PCR法检测肺癌标本中MCPH1基因相对表达量.用前期已构建的真核表达质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1及对照空白质粒pcDNA3.1(-)转染A549细胞,实验分为3组:实验组(OVER)、空白对照组(W/O)、未处理组(NC).然后分别用real-time PCR和Westen blot检测转染后细胞基因转录和蛋白表达.结果 肺癌组织中MCPH1基因表达低于正常组织(P＜0.05).在肺癌A549细胞中分别加入阿霉素1.0 μmol/mL、紫杉醇20 μg/mL、顺铂0.1μg/mL,48 h后转染MCPH1组抑瘤率明显高于对照组及未处理组(P＜0.05).结论 肺癌组织中MCPH1基因表达下调.MCPH1基因过表达后协同化疗药物抑瘤率明显升高.

实时荧光PCR检测病原真菌方法的建立及其临床应用

近年来条件致病性真菌感染日益增多,其发病率和死亡率都呈明显上升趋势,由于深部真菌感染初期症状不明显,临床表现缺乏特征性,致使早期明确诊断十分困难,患者生前确诊率相当低,是影响患者预后的重要因素.传统真菌感染的临床鉴定主要依赖于镜检和培养,但这些方法存在周期长、阳性率低的缺点.

埃博拉病毒检测与分型Real-time PCR方法的建立

目的 建立一种致死性埃博拉病毒(EBOV)的快速检测与分型方法. 方法 根据苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因的保守区序列,设计一对通用引物及特异性TaqMan探针.通过条件优化,以10倍系列稀释质粒pblue-SG,pblue-ZG为标准品,进行Real-time PCR扩增,制作标准曲线,并进行重复性、准确性检验及特异性检测. 结果 Real-time PCR检测苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒标准曲线相关系数均大于0.99,灵敏度可达1.0×101拷贝,高于常规PCR方法的106～107；7种其他对照烈性病病原体检测均呈阴性. 结论 用建立的Real time PCR方法检测埃博拉病毒快速、灵敏、特异,重复性好,为埃博拉出血热的快速确诊奠定了基础.

环介导等温扩增与实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌的比较

目的 为快速、特异、灵敏的检测和鉴定布鲁氏菌,本研究依据环介导等温扩增技术与实时荧光定量PCR技术原理设计引物,建立两种检测布鲁氏菌的方法并进行评价. 方法 根据布鲁氏菌OMP31基因序列设计6条LAMP引物和2条Real-time PCR引物,对新疆医科大学第一附属医院院确诊的10例布鲁氏菌病患者全血标本进行DNA检测.LAMP反应前加入羟基萘芬蓝(HNB)作为扩增指示剂,根据指示剂的颜色变化判定结果,并比较两种方法的特异性及灵敏度差异. 结果 LAMP反应只需30～60 min完成,在检测特异性和灵敏度方面两者结果相同,均能检出100个拷贝数的质粒DNA,且均无假阳性. 结论 LAMP方法快速、简便,经济,无需专用仪器设备,更适用于基层医院对布鲁氏菌的快速检测.

基因Ⅲ型乙型脑炎病毒Real-time PCR检测方法的建立及应用

目的 建立针对云南地区流行的基因Ⅲ型乙型脑炎病毒株Real-time PCR检测方法. 方法 根据云南地区分离株乙型脑炎病毒株(Yunnan0901)基因组核苷酸序列设计特异性引物,构建pMD18-T-JEV-E质粒,以此为模板进行SYBR Green Ⅰ Real-time PCR扩增并制作标准曲线,摸索佳反应体系条件,建立乙型脑炎病毒荧光定量PCR检测方法,并与普通RT-PCR方法相比较. 结果 建立的SYBR Green Ⅰ Real-time PCR标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系.与RT-PCR方法相比,SYBR Green Ⅰ Real-time PCR的灵敏度高10倍,而且不与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒核酸发生非特异性扩增,具有良好的特异性.用该方法检测云南部分地区的蚊虫样品,其中库蚊、按蚊乙型脑炎病毒阳性率分别为17.4％和30.7％,且主要为基因型Ⅲ型. 结论 本实验建立的检测基因Ⅲ型乙型脑炎病毒的SYBR Green Ⅰ Real-time PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等特点,可应用于乙型脑炎疫情的监测.

蓝氏贾第鞭毛虫基因型及其检测方法概述

蓝氏贾第鞭毛虫致病性与其基因型密切相关.近发展的一项分子技术real-time PCR以其实时定量、灵敏度高、特异性强等优势,被广泛应用于病毒、细菌和寄生虫的临床检测.本文就蓝氏贾第鞭毛虫基因型及检测方法的研究进行了综述.