HBV共价闭合环状DNA Real-time PCR检测方法比较

目的 比较HBV共价闭合环状DNA (Covalently closed circular DNA,cccDNA) Real-time PCR检测方法.方法 选择文献中常用的普通Taq-Man探针及Taq-Man MGB探针两种检测方法,合成引物及探针,制备质粒标准品,提取乙肝患者血清及肝组织标本HBV DNA,分别用质粒安全ATP依赖的DNA酶(Plasmid-safe ATP-dependent DNase,PSAD)酶切,进行敏感性、特异性及重复性检测验证.结果 两种检测方法扩增质粒标准品均有良好线性关系(R20.989和0.976),重复性良好(CV＜4％);检测PSAD酶切前后质粒、血清及肝组织HBV cccDNA均有良好特异性;检测相同浓度样品时普通Taq-Man探针Ct值较Taq-Man MGB探针略低.结论 两种方法均可用于HBV cccDNA检测,本实验所用的普通Taq-Man探针较Taq-Man MGB探针敏感性略高;MGB探针本底更低.实际工作中可根据需求选择适宜的探针.

siHybrids技术沉默铜绿假单胞菌外排泵 mexB基因体外效应的初步研究

目的 初步研究siHybrids技术对铜绿假单胞菌野生菌PAO1外排泵mexB基因体外沉默效应。方法 针对铜绿假单胞菌野生株PAO1外排泵mexB基因设计并合成3条特异性siHybrids分子和1条阴性对照siHybrids分子。在分子浓度为50 nmol/L下，分别以合成的siHybrids分子干扰铜绿假单胞菌野生菌PAO1，并设实验组为铜绿假单胞菌野生菌PAO1空白对照组，阴性对照组scamble(sc)-001，干预组siHybrids( si) -001、siHybrids( si) -002及siHybrids( si) -003，分别在干预12h及24h后采用real-time PCR法检测各实验组中靶基因mexB基因mRNA的表达水平。进一步采用Mueller-Hinton倍比稀释法检测50 nmol/L浓度下，siHy brids分子干预铜绿假单胞菌野生菌PAO1前后氯霉素(CP)、红霉素(EM)、左氧氟沙星(L-OrLX)、头孢他啶(CAZ)、美洛培南(MER)的小抑菌浓度(MIC)值。结果 不同siHybrids分子干预PAO1 12 h后，mexB基因mRNA表达量无明显差异性；但干预24 h后，mexB基因mRNA表达量：干预组（si-001，si-002，si-003）比空白对照组、阴性对照组（sc-001）有明显下降。对比干预12h、24h后mexB基因mRNA表达量，可以发现空白对照组、阴性对照组（sc-001）mRNA的表达量成上升趋势，而干预组（si-001，si-002，si-003）mexB基因mRNA表达量均呈下降趋势。siHybrids分子在干预铜绿假单胞菌野生菌24h前后的氯霉素(CP)、红霉素(EM)、左氧氟沙星( L-OFLX)、头孢他啶(CAZ)、美洛培南(MER) MIC无明显差异性。结论 在mRNA表达水平上，siHybrids分子能体外干预铜绿假单胞菌PAO1 mexB基因mRNA表达，此种沉默作用呈现时间依赖性，且在24h能有效地发挥干预作用。

北京市2007-2010年风疹病原学监测

目的 对北京地区风疹病原学进行监测.方法 收集风疹疑似病例血清标本和尿液和(或)咽拭子,用于血清学检测和病毒分离.病毒分离物和临床标本中的核酸利用real-time PCR方法进行检测.结果 2007-2010年,共收集99个风疹疑似病例血清标本和临床标本,血清学确诊55个病例(56%),病毒分离确诊51个病例(52%).回顾性检测疑似风疹病例及尿液和(或)咽拭子核酸,共确诊72个风疹病例(73%).分离的风疹病毒基因型主要为1E基因型.结论 北京地区主要流行的风疹病毒为1E基因型别.

环介导的等温扩增与实时荧光PCR检测问号钩端螺旋体的比较

目的 通过比较环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)与实时荧光PCR( real-time PCR)技术在检测问号钩端螺旋体的特异性及灵敏度方面的差异，寻找一种快速、灵敏且特异性强的问号钩端螺旋体检测方法。方法 根据问号钩端螺旋体lipL41基因序列设计LAMP及实时荧光PCR扩增所用的特异性引物，对我国15群15株问号钩端螺旋体参考菌株进行检测，比较二者在检测的特异性和灵敏度方面的差异。结果 LAMP反应大约可在30 min内完成，整个分析过程不超过1h。Real-time PCR的整个过程大约需要60 min。二者具有相同的检测灵敏度和特异性，低检出限度均为100个拷贝，整个检测过程没有出现假阳性。结论 在检测速度、灵敏度和特异性方面，LAMP技术与real-time PCR技术相当，但LAMP检测技术是在恒温条件下进行，不需要特别昂贵的仪器设备，检测方法简单，在基层实验室及现场检测方面具有明显的优势，是可应用于问号钩端螺旋体检测的一种有效技术。

定量实时 PCR 技术快速检测甲型 H1N1流感病毒

目的：：对采集来的疑似甲型 H1N1流感患者咽拭标本进行核酸检测，不断摸索快速检测流感的 PCR 方法。方法：实验方法按照 WHO 标准的实时 PCR(Real-time PCR)检测法操作，选取343份疑似甲型 H1N1流感咽拭子采用实时定量核酸检测和快速分型。结果：在343份咽拭子标本检测结果中，甲型 H1N1流感病毒核酸阳性为52份，阳性率15.16%，乙型流感病毒阳性11份，甲3型流感病毒阳性13份，甲1型流感病毒未检出。结论：实时 PCR 技术操作方法简便、耗时短、特异性强、灵敏度高，是一种适合应用于甲型 H1N1流感病毒可靠、快速诊断的检测方法。

辛伐他汀对大鼠骨量及骨髓基质干细胞增殖、分化过程中Smad1,2,7表达的影响

目的 观察辛伐他汀体内给药对大鼠骨量和骨髓基质干细胞增殖分化的影响.方法 16只6 w龄雌性DD大鼠按体重随机分成2组,每组8只:第一组(G1),实验组,辛伐他汀灌胃20 mg/kg·d(S20),持续6 w;第二组(G2),对照组,每天蒸馏水灌胃(N),持续6 w.于后一次灌胃的第二天处死所有大鼠,取左侧股骨行骨密度和骨组织形态计量学测定;取右侧股骨和胫骨骨髓细胞向成骨方向诱导培养,并作如下检测:采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测定向成骨分化中的骨髓基质干细胞的增殖能力;细胞培养第16 d和28 d分别检测碱性磷酸酶(ALP)比活性、ALP染色和von Kossa染色;细胞培养第21 d,提取总RNA,采用Real-time RT-PCR检测Smad1、2、7的mRNA的表达.结果 辛伐他汀体内给药干扰6 w后大鼠骨量和骨密度无显著变化,体外培养骨髓基质干细胞所有检测基因mRNA水平、细胞增殖能力、矿化能力(von Kossa染色)、ALP比活性、ALP染色两组间均无显著差别.结论 辛伐他汀体内给药6 w对大鼠骨及骨髓基质干细胞的增殖和分化无显著作用.

辛伐他汀对大鼠骨量及骨髓基质干细胞增殖、分化的影响

目的 观察辛伐他汀体内给药对大鼠骨量和骨髓基质干细胞增殖、分化的影响.方法 16只9周龄雌性SD大鼠按体重随机分成2组,每组8只:第1组(G1),对照组,每天蒸馏水灌胃(N);第2组(G2),实验组,辛伐他汀灌胃20 mg·kg-1·d-1(S20),持续3周,于后1次灌胃的第2天处死所有大鼠,取右侧股骨行骨密度和骨组织形态计量学测定;取左侧股骨和胫骨骨髓细胞分别向成骨、成脂方向诱导培养,并作如下检测:(1)成骨组:采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测定向成骨分化中的骨髓基质干细胞的增殖能力;细胞培养第16 d和28 d分别检测碱性磷酸酶(ALP)比活性、ALP染色和von Kossa染色;细胞培养第16 d,提取总RNA,采用Real-time RT-PCR检测骨形态发生蛋白-2(bonemorohogenetic protein-2,BMP-2)、碱性磷酸酶(ALP)、破骨细胞分化因子(RANKL)mRNA的表达;(2)成脂组:采用CCK-8法检测定向成脂分化中的骨髓基质干细胞的增殖能力;细胞培养第18d,检测LPL比活性,并提取总RNA,采用Real-time RT-PCR检测脂蛋白脂酶(LPI)mRNA的表达.结果 辛伐他汀体内给药干扰21 d后大鼠骨量和骨密度无显著变化.体外培养骨髓基质干细胞所有检测基因mRNA水平、细胞增殖能力、矿化能力(von Kossa染色)、ALP比活性、ALP染色、LPL比活性两组间差异均无显著性.结论 辛伐他汀体内给药3周对大鼠骨量及骨髓基质干细胞的增殖和分化无显著作用.

结直肠癌组织δ-catenin表达与临床病理因素及预后相关性分析

目的:探讨δ-catenin在结直肠癌组织中的表达与临床病理参数及预后关系.方法:应用免疫组织化学法检测2004 04-15-2010-04-15中国医科大学附属盛京医院病理结直肠癌标本110例及正常结直肠组织标本(外伤等非肿瘤原因肠切除标本)15例中δ-catenin蛋白的表达,其中70例有完整的术后随访资料,40例有配对的转移淋巴结标本.应用Real-time PCR和蛋白质印迹法定量比较30例结直肠癌与癌旁结直肠黏膜中δ-catenin的mRNA和蛋白表达差异.结果:免疫组织化学检测结果显示,在结直肠癌组织中δ-catenin呈阳性表达68.18％(75/110),而在正常结直肠黏膜上皮细胞中仅呈现较弱表达(5例)或不表达(10例).δ-catenin的阳性表达与结直肠癌患者的病灶所在部位(x2=0.163,P=0.686)、肿瘤大小(x2 =2.386,P=0.122)、年龄(x2=0.112,P=0.738)和性别(x2=0.082,P=0.775)均无关,而与分化程度(x2=2.393,P=0.012)、TNM分期(x2=6.320,P=0.012)和淋巴结转移(x2=5.771,P=0.016)密切相关.70例有完整随访资料的结直肠癌患者5年生存率为64.29％ (45/70),δ-catenin阳性表达的患者5年生存率为51.11％(23/45),显著低于阴性表达者的88.00％ (22/25),P=0.005.Cox模型多因素分析结果显示,δ-eatenin阳性表达很可能是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素,P=0.031.Real-time PCR检测结果显示,结直肠癌组织δ-cateninmRNA表达水平为22.61±2.57,显著高于正常肠黏膜组织的3.25±0.88,两者比较差异有统计学意义,t=7.137,P＜0.001.蛋白质印迹法检测结果显示,结直肠癌组织δ-catenin蛋白表达量为0.95±0.11,显著高于正常肠黏膜组织的0.32±0.07,两者比较差异有统计学意义,t=7.772,P＜0.001.结论:结直肠癌组织中δ-catenin过度表达,与低分化、晚分期、淋巴结转移和不良预后密切相关,提示δ-catenin可能参与了结直肠癌的恶性进展和转移.

早期放射性肺损伤小鼠中HMGB1表达及作用研究

目的 观察C57BL/6小鼠一次性大剂量(15 Gy)胸部照射后肺组织高迁移率族蛋白B1 (high mobility group protein,HMGB1)表达和支气管肺泡灌洗液(bron choalveolar lavage fiuid,BALF)中HMGB1水平的改变,探讨HMGB1在小鼠放射性肺损伤中的表达及作用.方法 42只C57BL/6小鼠随机分为对照组(6只)、照射12 h组(12只)、照射1周组(12只)和照射4周组(12只),ELEKTA直线加速器一次性15 Gy照射小鼠胸部,建立放射性肺损伤模型.在相应的时间点获取BALF并处死照射后及对照组小鼠,保存肺组织标本.采用实时qRT-PCR检测肺组织HMGB1 mRNA水平,采用蛋白质印迹法和免疫组化染色分析肺组织HMGB1蛋白水平.BALF中HMGB1、IL-17A、TNF-α和IL-6含量采用ELISA法检测,HE染色后光镜下观察肺组织病理形态变化.结果 HE染色显示,照射1周后肺泡腔内和细支气管壁可见成堆炎细胞浸润,毛细血管充血,肺间质水肿.照射4周后更为明显.HMGB1免疫组化染色显示,照射后肺组织细胞HMGB1表达明显增强.蛋白质印迹结果显示,对照组HMGB1蛋白表达量为0.42±0.10,照射12h组为0.78±0.13,照射1周组为1.23±0.21,照射4周组为1.56±0.22.照射后12 h肺组织HMGB1蛋白表达量较对照组明显增高,F=11.809,P=0.035;并随时间延长而进一步升高,P＜0.05.RT-PCR结果显示,对照组肺组织HMGB1 mRNA相对表达水平(△Ct)为9.69±1.40,照射12h组为7.58±1.01,照射1周组为5.45±1.06,照射4周组为3.55±0.73.照射12 h组△Ct显著性低于对照组,F=13.410,P=0.034;并随照射后时间延长肺组织HMGB1 mRNA的△Ct值进一步降低,P＜0.05.ELISA结果显示,小鼠肺照射后各时间点BALF中HMGB1、IL-17A、TNF-α和IL-6水平均明显升高,P＜0.01.结论 小鼠肺照射后HMGB1表达改变,且存在时间依赖性;HMGB1参与放射性肺损伤过程.

The apolipoprotein E geneε4 allele is considered a negative factor for neural regeneration in late-onset Alzheimer’s disease cases. The aim of this study was to establish a non-invasive, rapid method to genotype apolipoprotein E gene polymorphisms. Genomic DNA from mouth swab specimens was extracted using magnetic nanoparticles, and genotyping was performed by real-time PCR using TaqMan-BHQ probes. Genotyping accuracy was validated by DNA se-quencing. Our results demonstrate 100%correlation to DNA sequencing, indicating reliability of our protocol. Thus, the method we have developed for apolipoprotein E genotyping is accurate and reliable, and also suitable for genotyping large samples, which may help determine the role of the apolipoprotein Eε4 allele in neural regeneration in late-onset Alzheimer’s disease cases.

变形链球菌gtfs在不同蔗糖浓度下的差异性表达

目的 检测具有不同产细胞外多糖能力的变形链球菌株,在不同培养条件下产细胞外多糖的能力及与gtfA、B、C、D表达变化的关系.方法 选取变形链球菌高产糖与低产糖的临床分离菌株各10株及标准菌株UA159,用蒽酮法分别检测在1％、2％蔗糖培养下产细胞外多糖的能力;再用real-time PCR方法检测这些条件下与变链产糖能力密切相关的毒力因子葡萄糖基转移酶A、B、C、D的表达变化.结果 蔗糖能诱导各菌株产生细胞外多糖.不同蔗糖浓度,高产糖菌株葡萄糖基转移酶A、B、C、D的表达均高于低产糖菌株.1％蔗糖浓度下,高产糖株与低产糖株葡萄糖基转移酶A、B、C、D表达均有不同程度升高.2％蔗糖浓度下,低产糖株gtfB、C、D表达均不同程度降低,葡萄糖基转移酶A略有升高,而高产糖株葡萄糖基转移酶A、B、D表达升高,仅葡萄糖基转移酶C略有降低.结论 变形链球菌葡萄糖基转移酶的表达水平和产生细胞外多糖的能力受蔗糖浓度的影响.

正畸牙移动压力侧牙槽骨中cathepsin K、RANKL和OPG mRNA及蛋白的表达

目的 检测大鼠正畸牙移动压力侧cathepsin K、RANKL和OPG mRNA及蛋白表达变化及时间分布特点.方法 选用80只6周龄SD雄性大鼠建立正畸牙移动模型,分别在加力后2d、5d、7d、10d和14d各处死16只大鼠.HE染色观察牙周组织的形态学变化.TRAP染色计数压力侧牙槽骨中的破骨细胞数量.免疫组化方法定位及相对定量检测cathepsin K、RANKL和OPG蛋白表达变化及时间分布特点.Real-time PCR检测cathepsin K、RANKL和OPGmRNA表达变化及时间分布特点.结果 骨改建的活跃期为正畸加力后的第7d.压力侧牙槽骨中的TRAP染色阳性破骨细胞计数随加力时间的增加而增加,第7d达到高峰,而后逐渐降低.压力侧牙槽骨中的cathepsin K、RANKL和OPG mRNA及蛋白的表达水平均随加力时间的增加而增加,第7d达到高峰,而后均逐渐降低.结论 cathepsin K、RANKL和OPG mRNA及蛋白表达的变化规律不仅与骨改建过程一致,而且也与TRAP染色阳性破骨细胞数量的变化规律一致.cathepsin K、RANKL和OPG与正畸牙移动骨改建过程中破骨细胞的分化、形成和功能密切相关.

变形链球菌磷酸转移酶在不同蔗糖浓度下的差异性表达

目的 检测变形链球菌不同毒力株的致龋性与磷酸转移酶(pts)系统各编码基因表达变化的关系.方法 选取高毒力株临床分离株502与低毒力株标准株UA159,以real-time PCR方法检测在1%和2%蔗糖浓度下,变形链球菌磷酸转移酶系统各编码基因的表达变化.结果 1%蔗糖浓度,高毒力株和低毒力株的scrA、scrB、ptsH、ptsI的表达均明显升高,而ptsK的表达受到抑制;2%蔗糖浓度,各基因的调节方向与上述相反.结论 磷酸转移酶系统可能增加变形链球菌在低糖浓度环境下的致龋力.

Scn3b在遗传性糖尿病长爪沙鼠多种组织中的表达情况

目的 比较正常血糖长爪沙鼠和自发遗传性糖尿病长爪沙鼠肝脏、肾脏、骨骼肌和脑组织中钠通道β亚基(sodium channel beta subunit 3 gene,Scn3b)的表达差异.方法 选取正常血糖长爪沙鼠和自发遗传性糖尿病长爪沙鼠各6只,分别采集动物的肝脏、肾脏、骨骼肌和脑组织,利用Real-time PCR和Western blotting检测Scn3b在各组织中的mRNA和蛋白表达水平.结果 与正常血糖动物相比,在糖尿病长爪沙鼠肝脏和脑组织中,Scn3b mRNA和蛋白水平表达均下降,其中在肝脏具显著性差异.结论 Scn3b在糖尿病长爪沙鼠肝脏和脑组织中表达减少,提示在肝脏和脑组织中Scn3b的异常表达可能参与长爪沙鼠糖尿病的发生.

LKB1在甲状腺乳头状癌中表达及意义

目的 探讨LKB1在甲状腺乳头状癌中的表达特点及其生物学意义.方法 甲状腺乳头状癌和正常甲状腺组织标本各25例,采用免疫组织化学、Western blot和real-time PCR检测比较LKB1蛋白表达及mRNA情况.结果 人甲状腺乳头状癌组织中LKB1蛋白表达显著低于正常甲状腺组织(P＜0.05),其mRNA明显下调(P＜0.01),LKB1表达与甲状腺乳头状癌淋巴结转移呈负相关(P＜0.01).结论 LKB1基因和蛋白表达水平在甲状腺乳头状癌组织中普遍下调并与其淋巴结转移呈负相关,提示LKB1在甲状腺乳头状癌的形成及淋巴结转移中起负向调节作用.

外周血IL-8 mRNA表达与子宫内膜异位症关系

目的 探讨外周血IL-8 mRNA表达与子宫内膜异位症关系.方法 用达那唑进行治疗,以Real-time PCR动态检测子宫内膜异位症患者外周血IL-8 mRNA表达水平.结果 子宫内膜异位症患者外周血IL-8 mRNA水平为1.1339±0.1428,与对照相比,差异有显著性(P＜0.01).Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ期患者IL-8 mRNA水平分别为1.1023±0.1371和1.1866±0.1543,相互比较差异无显著性(P＞0.05).达那唑治疗6个月后,外周血IL-8 mRNA水平为1.0547±0.1299,与对照相比,差异无显著性(P＞0.05).结论 子宫内膜异位症患者外周血IL-8 mRNA表达增强,对子宫内膜异位症发生起促进作用.达那唑能抑制子宫内膜生长,降低由IL-8介导和参与的局部炎症反应.

血清E型沙眼衣原体的Real-time PCR定量分析

目的 沙眼衣原体感染是常见的性传播疾病,本文拟建立一种准确快速、标准化的感染动物组织衣原体载量检测体系.方法 体外扩增感染用沙眼衣原体血清E型,克隆衣原体特异基因OMP1基因片段作为标准品,用Real time PCR法测定衣原体基因组拷贝数进行衣原体定量.结果 Real time PCR在OMP1基因片段200至2×108拷贝检测结果成线性,在模板中加入小鼠基因组未出现非特异扩增,同时未影响扩增效率.结论 针对衣原体特异基因OMP1的实时定量PCR方法可以较为灵敏的特异的定量检测感染动物样本中的衣原体.

Real-Time PCR及其在立克次体定里检测中的应用

立克次体病是由立克次体(Rickettsia)引起的严重威胁人类健康的人兽共患自然疫源性疾病.

外源性双歧杆菌对肠外营养幼兔肠道益生菌的影响

目的:研究外源性双歧杆菌对肠外营养(PN)幼兔肠道益生菌的影响.方法:生后2w的新西兰种白兔24只,分成对照组(n=7)、PN组(n=9)和PN+双歧组(n=8).对照组为兔食喂养,PN组幼兔完全肠外营养,PN+双歧组幼兔口服青春双歧杆菌0.5×108/d,10d后自直肠取出新鲜粪便.应用SYBR Green I Real-time PCR法,定量检测粪便中双歧杆菌和乳杆菌含量.结果:Real-time PCR法的检测限低为102PFU,凝胶电泳证实合成探针具有属特异性.粪便细菌定量结果显示,PN组幼兔湿粪(0.05g)中双歧杆菌和乳杆菌含量(对数值)分别为4.62±0.24和4.29±0.49,显著低于对照组(分别为5.84±0.92、5.14±1.07 log)和双歧组(6.41±0.39,5.46±0.61 log).结论:SYBR Green I Real-time PCR法能够准确、迅速地对幼兔粪便双歧杆菌和乳杆菌进行定量检测.PN幼兔口服双歧杆菌后,其粪便中双歧杆菌和乳杆菌含量显著增加.