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抗骨质疏松药物作用靶位分子水平研究进展
1 成骨细胞上的药物作用靶位多功能骨髓基质干细胞或多功能骨髓间充质干细胞(p luripotent mesenchymal stem cell,M SC)分化形成纤维样系统细胞,包括前成骨细胞、成骨细胞、成软骨细胞、成纤维细胞和网织细胞.来源于M SC的骨髓基质成纤维样系统细胞的前体细胞,在成年的哺乳动物体内分为2种:定向成骨前体细胞和可诱导成骨前体细胞.
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自体骨髓基质干细胞治疗骨缺损的初步实验研究
目的探讨自体骨髓基质干细胞修复兔桡骨远端骨缺损的可行性.方法取兔髂骨骨髓,体外分离培养扩增骨髓基质干细胞,与生物材料混合后植入体内修复兔桡骨远端骨缺损.结果12周后X片、大体标本、组织切片均显示缺损处有新骨形成.结论自体骨髓基质干细胞移植是修复兔桡骨远端骨缺损的理想方法.
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兔BBMSCs体外培养及其与水凝胶复合体的制备
目的 探讨贴壁筛选法分离培养兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的条件,制备了可注射的PLGA-PEG水凝胶并检测其生物相溶性,为组织工程选择合适的基质干细胞奠定基础.方法 采用贴壁筛选法将兔BMSCs自少量骨髓中分离、纯化并培养,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线.制备凝胶,倒置显微镜下观察细胞的生长形态,并MTT法检测其生物相溶性.结果 兔BMSCs性状稳定,生长曲线相似,一周时细胞数目多；传代后3～4 h即可贴壁.水凝胶30℃的成胶时间为10 min,培养7d后水凝胶表面的BMSCs贴壁生长并显示出良好的细胞活性.结论 水凝胶具有良好的细胞相容性,可作为BMSCs生长增殖的良好载体,为组织工程提供支架材料.
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同种异体骨髓基质干细胞治疗骨缺损的实验研究
目的 通过移植大鼠同种异体骨髓基质干细胞,配合免疫抑制剂治疗大鼠颅骨缺损,与对照组进行比较,探索一种治疗骨缺损的新方法.方法 选取SD大鼠40只,随机分为四组:同种异体骨髓基质干细胞移植组,同时给以免疫抑制剂治疗;自体骨髓基质干细胞移植组;单纯同种异体骨髓基质干细胞移植组,单纯支架组.四组分别在脑颅骨上造成骨缺损模型后取供体组和自体组骨髓,移植到同步预制骨缺损大鼠模型缺损处,分别于术后8、10、12、13周对骨缺损处进行大体观察,X线摄片,病理取材.结果 同种异体骨髓基质干细胞移植组,术后8周观察,骨样组织铺满支架,骨缺损治愈率85%;自体骨髓基质干细胞移植组,术后10周观察,骨样组织铺满支架,骨缺损治愈率82%;未用免疫抑制剂同种异体骨髓基质干细胞移植组,术后12周,只有少量骨样组织形成,骨缺损治愈率0%;单纯支架组骨样组织生长缓慢,术后13周仍未铺满支架.骨缺损治愈率10%.骨缺损治愈率85%.结论 应用免疫抑制剂防止移植排斥反应的同种异体骨髓基质干细胞移植效果与自体骨髓基质干细胞移植效果差别很小,具有实用价值.
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加味桃红四物汤对骨髓基质干细胞体外诱导的实验研究
目的 研究加味桃红四物汤对骨髓基质干细胞早期促缺氧诱导因子(HIF-1)与血管内皮生长因子(VEGF)分泌的影响.方法 骨髓基质干细胞取材,设置中药组及生理盐水组,观察HIF-1、VEGF表达.结果 中药组对骨髓干细胞培养第2 d HIF-1α表达量开始出现,第5、7天后中药组HIF-1α mRNA的表达量显著低于生理盐水组.而第3、5、7、14天 VEGF表达中药组表达较生理盐水组强,在第5、7天VEGF表达达到峰值.结论 加味桃红四物汤可以诱导骨髓基质干细胞向血管祖细胞分化,并促相关生长因子表达.
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超选动脉骨髓基质干细胞灌注治疗非创伤性股骨头坏死中长期疗效分析
目的:研究骨髓基质干细胞经超选动脉灌注治疗非创伤性股骨头坏死的中长期疗效.方法:回顾性分析2000年1月至2004年12月接受超选动脉骨髓基质干细胞灌注治疗且随访资料完整的62例78髋非创伤性股骨头坏死患者,男35例43髋,女27例35髋;年龄22～54岁,平均36.3岁.根据术前影像学资料示ARCO Ⅰ期16髋,Ⅱ期52髋,Ⅲa期10髋;术前Harris评分为(64.94±8.12)分.分析患者末次随访的Harris评分,影像学变化,DSA血管变化.结果:患者术后随访9～13年,平均11年.共18髋接受人工关节置换,术前ARCO Ⅰ、Ⅱ期共10髋行人工关节置换,Ⅲa期8髋行人工关节置换.末次随访Harris评分为(71.21±10.19)分,较术前有明显提高.DSA可见供应股骨头的血管有增粗、增多.结论:超选动脉骨髓基质干细胞灌注能有效治疗ARCO Ⅰ、Ⅱ期非创伤性股骨头坏死,可使旋股内动脉及其分支有增粗、增多表现.
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间歇性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响
目的:研究间歇性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞(MSC)增殖的影响,探讨假体置换术后活动所需的适宜压力.方法:以新西兰兔的骨髓基质干细胞为实验材料,通过噻唑盐(MTT)比色试验,观察间歇性压力对骨髓基质干细胞增殖的影响.结果:MSC在60、100 kPa间歇性压力培养环境下MTT反应的OD值小于对照组,压力值越大,OD值越小(P＜0.05).而20 KPa间歇性压力情况可显著促进MSC增殖,并随时间增加而增强.在实验第7天时,实验组OD值高于对照组(P＜0.05),差异有显著性意义.结论:关节置换术后早期下地活动产生的较大应力,会明显抑制骨髓腔内MSC的增殖,不利于骨的重建愈合,临床应当避免.然而,较小的间歇性压力对MSC增殖有明显的促进作用,提示关节置换患者可在较小压力范围(＜20 kPa)内进行早期关节被动活动训练,有利于关节术后骨的重建愈合.
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骨髓基质干细胞-80 ℃保存的初步研究
目的:探索适合于人骨髓基质干细胞-80℃冷冻保存的条件和方法.方法:体外分离培养人骨髓基质干细胞,以含不同浓度二甲亚砜的冻存液和不同细胞浓度-80℃深低温保存.3个月后复苏接种培养,观察细胞形态、存活率和贴壁率;通过3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入实验比较细胞分裂增殖能力;3H-脯氨酸(3H-Proline)掺入实验检测胶原合成能力;RT-PCR法检测Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达.结果:不同二甲亚砜浓度保存骨髓基质干细胞复苏后的细胞形态和功能有所不同,其中含5%二甲亚砜冻存液组保存效果差,15%组佳.15%二甲亚砜冻存液组复苏后骨髓基质干细胞的形态与未冻存组相似,存活率为(85%±3%),贴壁率为(81%±5%).骨髓基质干细胞保持较强的分裂增殖和胶原合成能力,Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达与5%或10%二甲亚砜冻存液组比较有统计学差异(P《0.05).冻存骨髓基质干细胞浓度为(5-10)×106个/ml组复苏后细胞存活率明显优于(1～2.5)×106个/ml组.结论:含15%二甲亚砜的冻存液适合于骨髓基质干细胞长期保存,高浓度组骨髓基质干细胞冻存效果优于低浓度组.
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rhBMP-2体外诱导骨质疏松大鼠BMSCs成骨及VEGF表达的研究
目的：观察骨形态发生蛋白-2对骨质疏松时骨髓基质干细胞（BMSCs）体外成骨及成骨因子VEGF表达的影响，为骨质疏松证的防治提供新的方法。方法：将20只6月龄，体重（300±20）g雌性SD大鼠双侧卵巢切除，术后3个月利用双能X线骨密度仪测量大鼠全身骨密度并与术前比较，确保造模成功，并运用全骨髓贴壁法培养骨质疏松大鼠BMSCs，倒置相差显微镜下观察BMSCs形态。随机把骨质疏松大鼠BMSCs第2代（p2）细胞分成实验组和对照组，分别加入完全培养基（含rhBMP-2）、成骨诱导液进行成骨诱导。2周后茜素红染色法检测各组细胞钙结节的形成，酶标仪测定碱性磷酸酶活性及RT-PCR法检测VEGF的表达量。结果：（1）大鼠全身骨密度：手术前后大鼠全身骨密度分别为（0.179±0.007），（0.158±0.006）g/cm2，差异有统计学意义（t=4.180，P<0.05）。（2）茜素红染色：BMSCs（P2）成骨诱导2周后实验组染色效果明显强与对照组。（3）碱性磷酸酶活性：BMSCs（P2）成骨诱导2周后碱性磷酸酶活性实验组明显高于对照组，分别为（15.62±1.27），（8.62±0.93）μg/prot，差异有统计学意义（t=7.709，P<0.01）。（4）BMSCs（P2）成骨诱导2周后VEGF表达：实验组明显高于对照组，分别为3.723±0.143，0.950±0.072，差异有统计学意义（t=29.462，P<0.01）。结论：rhBMP-2能提高去卵巢骨质疏松大鼠BMSCs的体外成骨能力，可促进成骨因子VEGF的表达，调控VEGF的表达可能是骨形态发生蛋白-2参与骨代谢的机制之一。
关键词： 重组人骨形态发生蛋白-2 骨质疏松 血管内皮因子 骨髓基质干细胞 -
骨组织工程中种子细胞的选择
组织工程学是把材料学和生命学科有机结合的一门现代学科,材料学和细胞学的协同发展有效的促进了组织工程学的发展,材料载体学已取得了相当的发展,学者们面临着如何在骨组织工程中选取高效、便捷的种子,使工程化骨有效修复治疗骨缺损等骨骼疾病.细胞本文仅就组织工程学中种子细胞的发展一简要综述,以供读者参考.
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重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨
目的:构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,hBMP-2)真核表达载体PcDNA3.1-hBMP-2,转染兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),种植去抗原牛松质骨(bovine canoellous bone,BCB)支架体外构建组织工程骨.方法:蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达,碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响.然后将转染后细胞接种到BCB支架上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况.结果:转染后,BMSCs表达BMP-2,ALP活性明显增高.扫描电镜见转染细胞分布均匀,伸展良好.结论:在脂质体介导下,BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化,转染后细胞在支架材料上贴附生长良好,为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础.
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补肾填精法促进骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究
目的:探讨补肾填精方右归丸含药血清体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的作用.方法:用DMEM/F-12培养液培养Wistar大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs).用右归丸含药血清诱导BMSCs分化后,倒置显微镜观察细胞形态变化；用尼氏染色法观察神经细胞特征性结构；用免疫细胞化学染色法鉴定神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及神经细胞特异性标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE),微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达.结果:诱导6h后,骨髓基质干细胞胞体收缩,有突起伸出；诱导24 h后突起增多形成网络结构；尼氏染色法显示诱导后的细胞胞体中有尼氏体.免疫细胞化学染色示NSE及MAP-2阳性表达,GFAP无表达.结论:右归丸含药血清可以体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞.
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壮骨颗粒含药血清对兔骨髓基质干细胞体外增殖及分化的影响
研究壮骨颗粒含药血清对骨髓基质干细胞体外成骨活性的影响.方法:采用体外细胞培养技术,采用壮骨颗粒对细胞进行体外诱导培养,并设置空白血清对照组,进行MTT、免疫组织化学染色及ALP测定,观察壮骨颗粒对骨髓基质细胞的诱导作用.结果:在促细胞增殖方面:实验组作用显著(P＜0.01),在第3d开始增殖,第6d达到平台期;而对照组对数增殖期明显延长(P＜0.01);在促细胞分化方面:壮骨颗粒血清组在2d、3d、5d ALP恬性水平高于对照组(P＜0.01).常规形态学观察,壮骨颗粒组诱导的细胞在形态上类似于成骨细胞,免疫组化染色提示诱导细胞具有骨细胞表型.结论:壮骨颗粒组应用可促进细胞增殖,并诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化.
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祛痰逐瘀法对激素性股骨头坏死兔骨髓基质干细胞生物活性的影响
目的:探讨祛痰逐瘀法对激素性股骨头坏死(ONFH)兔骨髓基质干细胞(BMSCs)生物活性的影响.方法:50只健康普通级新西兰家兔随机分成正常组,模型组,中药低、中、高剂量组,每组10只.连续干预8周,麻醉后取左股骨头行HE染色,无菌下取骨髓培养BMSCs,MTT检测细胞增殖,ALP活性检测成骨能力,茜素红染色观察成骨能力.结果:干预8周后,与正常组比较,模型组空骨陷窝率明显增高,中药高剂量组空骨陷窝率明显低于模型组,中药低、中剂量组(P＜0.05).中药高剂量组BMSCs第72h增殖能力和ALP活性明显高于其它4组(P＜0.05).成骨诱导14d,中药高剂量组茜素红S定量明显高于模型组、中药低剂量组和中药中剂量组(p＜0.05),与正常组无显著差异.结论:模型组BMSCs增殖和成骨分化能力下降,中药高剂量组BMSCs增殖与成骨能力明显增强.说明祛痰逐瘀法预防激素性ONFH可能与调控BMSCs成骨分化有关.
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异补骨脂素对体外培养骨髓间充质干细胞增殖与成骨性分化的研究
目的:研究异补骨脂素对体外培养大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)增殖与成骨性分化的影响.方法:取大鼠股骨及胫骨全骨髓,利用全骨髓贴壁培养法培养单核层细胞,培养于含10% FBS的DMEM-F12培养液中,3d后首次换液,9d后成骨性诱导培养并用药物干预.异补骨脂素在培养基中终浓度分别为1×10-4,1×10-5,1×10-6,1×10-7 mol·L-1.增殖分析采用MTT法,于成骨性诱导培养第4,8,12,16天测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量,第15天进行ALP和钙化结节组织化学染色及计数.成骨性诱导后不同时间点提取总RNA,Real-time RT-PCR法检测bFGF,IGF-1,Osterix与Runx-2等成骨性相关的基因表达情况.结果:异补骨脂素剂量依赖性抑制BMSCs增殖,但能促进其成骨性分化,表现为提高BMSCs的ALP活性、促进骨钙素分泌、钙盐沉积量、增加钙化结节数量、提高bFGF,IGF-1,Osterix,Runx-2 mRNA表达水平.结论:终浓度为1×10-5 mol·L-1异补骨脂素能显著促进BMSCs的成骨性分化,证明异补骨脂素是中药补骨脂中抗骨质疏松的有效成分.
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龟鹿二仙胶诱导大鼠骨髓基质干细胞成骨分化作用及对Wnt通路的影响
目的 观察龟鹿二仙胶合药血清对SD大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)成骨分化的作用及其对Wnt信号通路相关因子的影响.方法 100只3月龄雌性SD大鼠经腹腔入路切除双侧卵巢,按随机数字表法分为低剂量组、中剂量组、高剂量组和空白组,每组25只.按体表面积换算龟鹿二仙胶剂量并灌胃给药,连续7天后腹主动脉采血制备含药血清.1月龄SD大鼠全骨髓贴壁法分离BMMSCs,流式细胞法(flow cytometry,FCM)法检测F3代细胞CD45和CD90表达;不同浓度龟鹿二仙胶合药血清干预F3代BMMSCs 72 h后,FCM法检测细胞周期的影响并计算增殖指数,确定佳干预浓度.F3代细胞分为FBS组、空白组、龟鹿二仙胶组和经典诱导组,诱导培养21天后,茜素红(alizarin red staining,ARS)染色法观察BMMSCs成骨分化,RT-PCR检测成骨分化相关基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨钙素(osteocalcin,OC)mRNA的表达;RT-PCR和Westernblot检测Wnt5a、β-连环蛋白(β-catenin)、淋巴样增强因子-1(lymphoid enhancer factor-1,Lef-1)mRNA和蛋白的表达.结果 F3代细胞CD45阳性表达率为1.46％±0.23％,CD90阳性表达率为96.97％±3.21％;浓度为10％的龟鹿二仙胶中剂量组合药血清能显著促进BMMSCs增殖;龟鹿二仙胶组和经典诱导组ARS染色可见橘红色钙结节.与空白组及FBS组比较,龟鹿二仙胶组和经典诱导组OC和ALP mRNA表达上调(P＜0.05),Wnt5a、β-catenin mRNA和蛋白表达上调(P＜0.05);与空白组、FBS组和经典诱导组比较,龟鹿二仙胶组Lef-1 mRNA和蛋白表达均升高(P＜0.05);与FBS组和空白组比较,经典诱导组Lef-1蛋白表达上调(P＜0.05).结论 龟鹿二仙胶合药血清具有促进BMMSCs增殖,诱导BMMSCs向成骨细胞分化的作用,其机制可能与调控Wnt信号通路相关因子的表达有关.
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血府逐瘀汤含药血清体外诱导骨髓基质干细胞表达Desmin和α-actin的实验研究
目的 观察血府逐瘀汤含药血清能否诱导骨髓基质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞,以寻找安全有效诱导MSCs向心肌细胞分化的诱导剂.方法 采用血清药理学方法进行诱导,制备血府逐瘀汤大鼠含药血清,分离培养大鼠 MSCs,MTT法检测血清细胞毒性,选用生长良好的P3细胞进行实验,将实验细胞分为3组,即空白对照组、血府逐瘀汤大鼠含药血清诱导组、5-氮胞苷诱导组.免疫细胞化学染色法检测心肌结蛋白(Desmin),α型心肌肌动蛋白(α-actin)的表达情况.结果 诱导前各组MSCs细胞Desmin和α-actin表达阴性,个别弱阳性;其弱阳性表达率各组比较差异无统计学意义(P >0.05).诱导后空白对照组MSCs细胞Desmin和α-actin表达阴性,个别弱阳性;血府逐瘀汤含药血清组和5-氮胞苷体外培养诱导组,MSCs细胞Desmin和α-actin表达阳性,其阳性表达率与空白对照组比较差异均有统计学意义(P <0.05).结论 血府逐瘀汤含药血清具有体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为心肌样细胞的趋势,其作用可能参与了Desmin和α-actin的表达.
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浓集自体骨髓基质干细胞复合物成骨的实验研究
目的:研究自体浓集骨髓基质干细胞(MSCs)复合物的成骨作用,以寻求治疗股骨头缺血性坏死的新方法.方法:中国白兔24只,随机分成3组.小牛脱钙松质骨(DBCB)作为载体,将一定量的骨形态发生蛋白(BMPs)与不同浓度含有骨髓基质干细胞(MSCs)的单核细胞悬液复合,制成MSCs/BMP/DBCB复合物(MⅠ:1×106,MⅡ:1×105和MⅢ:1×104),分别回植在骶棘肌内.术后2、4、8、12周取材,对标本做放射影像学、大体观察、显微镜组织学观察.结果:MⅠ组新骨生成量多于其它组.结论:复合物具有治疗股骨头缺血性坏死的潜能,但有待进一步研究.
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放血增加自体骨髓基质干细胞浓度实验研究
目的:寻找提高骨髓基质干细胞浓度的方法.方法:随机取中国白兔5只,分别在干预前及干预后的第5、7、10天抽取耳缘静脉血进行网织红细胞检测;随机取中国白兔10只,于放血干预前后经股骨大转子抽取骨髓,分别进行离心前后的骨髓基质干细胞培养和计数.对结果进行分析,找出动员后骨髓基质干细胞增多明显时间.结果:兔骨髓基质干细胞(MSCs)经放血动员后,细胞附壁数目增多,第5天为明显,与应激前对比,有显著性差异(P＜0.05).结论:自体骨髓基质干细胞(MSCs)经放血动员和浓集后,干细胞数量明显增多.
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成年大鼠骨髓基质细胞转分化为胰岛样细胞的实验研究
目的 探讨二甲基亚枫(DMSO)对成年大鼠骨髓基质干细胞(MSC)定向诱导分化为胰岛样细胞团的作用.方法 用长骨骨髓腔冲洗的方法对Wistar大鼠MSC进行分离和培养,加入1%DMSO诱导3 d后,HDMEM培养7～10 d.通过形态学观察、双硫棕(DTZ)染色、免疫细胞化学染色、葡萄糖刺激实验和RT-PCR,对诱导细胞进行体外结构和功能鉴定.结果 1%DMSO诱导后第3 d有胰岛样结构出现;免疫细胞化学显示,诱导后第1 d MSC呈nestin免疫反应阳性,诱导后第10 d细胞团表达胰岛素、胰高血糖素,而未诱导组细胞不表达上述蛋白;RT-PCR结果表明,诱导后第10 d检测到胰岛素1(Ins1)、胰岛素2(Ins2)、胰高血糖素(glu)和生长抑素(SS)基因的表达.结论 体外经DMSO诱导,大鼠骨髓基质干细胞可定向分化为胰岛样细胞.
