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骨形态发生蛋白2基因治疗在修复骨缺损中对血管化影响的实验研究
目的观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因治疗在修复骨缺损中对血管化的影响.方法分离培养兔骨髓基质干细胞(MSCs),经BMP-2腺病毒载体转染后复合异种骨支架移植修复1.5cm桡骨缺损.分为5组:①BMP-2基因转染细胞+去抗原牛松质骨支架(BCB);②未转染细胞+重组BMP-2+BCB;③对照基因转染细胞+BCB;④未转染细胞+BCB;⑤BCB.术后4、8、12周行微血管墨汁灌注、血管内皮生长因子(VEGF)免疫组化染色、组织学等检测.结果术后4周,基因治疗组骨间血管的密度在周边区域较高,通常每一个骨小梁孔隙中都有一支新形成的小血管;透射电镜见成骨细胞总是毗邻血管内皮细胞而存在,并随着微血管的增生而逐渐向骨细胞发展;间质细胞VEGF表达明显增强.结论BMP-2基因治疗可通过上调VEGF表达,间接诱导移植骨血管化,对骨不连、骨缺损的治疗具有重要意义.
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自体骨髓基质干细胞复合珊瑚修复犬下颌骨节段缺损的初步研究
目的 应用自体骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)复合珊瑚构建组织工程化骨,修复犬下颌骨节段性缺损.方法 体外扩增培养、成骨诱导犬BMSCs.将第二代细胞复合珊瑚后修复犬自体右侧3cm的下颌骨节段缺损(n=6);以单纯珊瑚植入缺损处为对照(n=6),术后12、32周分别通过影像学,大体形态观察,组织学和生物力学的方法检测骨缺损的修复效果.结果 成骨诱导的BMSCs在珊瑚支架上生长良好.X线片显示12周时实验组骨痂较多,对照组材料明显吸收;32周时CT、X线片和大体观察显示术后实验组骨愈合良好,对照组为骨不连;骨密度检测示实验组显著高于对照组(P＜0.05);组织学示实验组有较多成熟骨呈骨性愈合,对照组为纤维性愈合;生物力学测试实验组与正常下颌骨力学强度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 自体成骨诱导BMSCs复合珊瑚形成的组织工程化骨可修复犬下颌骨节段缺损.
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基于骨髓基质干细胞的组织工程化软骨在非软骨形成部位的构建稳定性
骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)因其来源广泛、增殖能力强大、大规模扩增后不易丧失分化潜能等突出优势,成为软骨组织工程种子细胞的佳选择.
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组织工程化软骨分泌的可溶性因子对骨髓基质干细胞诱导作用的实验研究
目的 探讨组织工程化软骨分泌的可溶性因子是否能够单独诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromai cells,BMSCs)软骨分化.方法 体外培养扩增猪BMSCs、猪关节软骨细胞以及皮肤成纤维细胞,以5.0×107/ml的细胞终浓度分别接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,应用隔离池进行隔离共培养.以软骨细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为实验组,以皮肤成纤维细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为对照组1,以单纯BMSCs-材料复合物为对照组2.各组标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察,组织学,以及免疫组织化学,RT-PCR等方法对新生组织进行评价.结果 隔离共培养8周后,实验组软骨细胞材料-复合物诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织略有缩小,外观类似软骨组织,组织学检测见软骨陷窝样结构,SafraninO染色可见软骨特异性基质分泌,免疫组化显示有大量Ⅱ型胶原沉积,RT-PCR检测组织表达Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、COMP、Sox9等软骨特异性基因,提示形成了较成熟软骨样组织;而对照组成纤维细胞材料复合物诱导的BMSCs-材料复合物和未经任何诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织淡黄色,明显缩小、变薄、质地较软,组织学检测均未形成软骨陷窝样结构,主要为纤维性成分,各种软骨特异性相关检测均为阴性.结论 软骨细胞分泌的可溶性因子能够单独诱导BMSCs软骨分化,可能是软骨细胞形成的微环境中发挥诱导作用的主要因素.
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以骨髓基质干细胞构建带内支撑的组织工程化软骨
目的 探讨构建特定形态带内支撑组织工程化软骨的医用假体的可能性.方法 以直径3 mm、长5 mm的圆柱状多孔高密度聚乙烯(Medpor)外裹厚1 mm的聚羟基乙酸为支架,将体外培养的骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs).按10×107/ml的细胞浓度均匀接种于支架,常规培养液培养5 d后,用含诱导因子的培养液立体诱导4周,同时以相同浓度的软骨细胞和BMSCs分别接种,常规体外培养4周作为阳性对照组和阴性对照组,分别种植于裸鼠皮下,4、8周后取材,行大体观察、组织学、组织化学、免疫组化及糖氨聚糖(GAG)定量等检测.结果 各组细胞均与材料粘附良好.实验组和阳性对照组均形成了大体形态良好的Medper-软骨复合体,内部的Medper与外层软骨结合紧密.组织学可见成熟软骨陷窝并渗入Medper孔隙内部、异染基质及Ⅱ型胶原表达,实验组GAG含量4、8周时分别为(5.13 ±0.32)mg/g、(5.37±0.12)mg/g.结论 以BMSCs作为种子细胞可于体内构建特定形态、组织学良好的Medpor-软骨复合体.
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利用人骨髓基质干细胞异位构建组织工程化骨的实验研究
目的 探讨以人骨髓基质干细胞为种子细胞、以部分脱钙骨为支架材料在体内构建组织工程化骨的可行性及其成骨机制.方法 培养、扩增人骨髓基质干细胞,将第4代hBMSCs接种于部分脱钙骨支架上,通过扫描电镜观察其生长和粘附情况,并测量粘附率.于裸鼠皮下植入人骨髓基质干细胞和部分脱钙骨复合物,以无细胞部分脱钙骨作对照.8及12周取材观察.结果 8及12周复合物植入组均见新骨形成,多数骨小梁表面衬有一层成骨细胞样细胞,提示可能存在膜内成骨.单纯部分脱钙骨植入组未见新骨形成.结论 人骨髓基质干细胞与部分脱钙骨复合可以在体内构建组织工程化骨;其成骨机制可能为膜内成骨.
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血清浓度影响骨髓基质干细胞体外软骨分化的实验研究
目的 探讨含有不同浓度胎牛血清的成软骨分化诱导液对骨髓基质干细胞(BMSCs)体外分化的影响,明确体外培养用血清在细胞分化中的作用,为软骨的体外组织构建提供技术参数.取第2代猪BMSCs,以5×107个细胞/cm3的密度接种到聚羟基乙酸(PGA)制成的圆盘状支架上(直径5 mm,厚度2 mm),7 d后分别应用含0%、5%、10%血清浓度的诱导液(诱导因子包括TGF-1、IGF-Ⅰ及地塞米松)进行体外持续性诱导培养.8周取材行组织湿重测量、GAG含量定量分析、大体观察、组织学、组织化学及免疫组织化学检测.结果 10%血清组复合物外观瓷白色,坚硬细腻,体积和外形均无明显变化.组织学及免疫组织化学检测结果显示有典型的软骨陷窝,大量的软骨特异性细胞外基质成分,组织湿重和GAG定量亦明显高于其它两组;3%血清组复合物体积缩小,有少量陷窝样结构及软骨特异性胞外基质聚集;而无血清组复合物缩小,松软易碎,未见典型的软骨陷窝和软骨特异性基质成分.结论 体外诱导培养BMSCs构建组织工程软骨过程中,10%浓度的血清成分有利于BMSCs成软骨分化.
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基因修饰的组织工程骨联合带血管蒂骨膜移植修复长段骨缺损的研究
目的 评价骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)基因修饰的组织工程骨联合带血管蒂骨膜移植修复长段骨缺损的效果.方法 分离培养兔骨髓基质干细胞,经BMP-2基因转染后复合异种骨支架体外构建基因修饰的组织工程骨(gene modified tissue engineering bone,GMB).建立兔双侧桡骨缺损(长2.5 cm)模型,采用5种方法修复.A组:GMB+带血管蒂骨膜移植;B组:GMB+血管束植入;C组:GMB+游离骨膜移植;D组:GMB;E组:单纯支架.于术后第4、8、12周行X线、组织学、生物力学测定和微血管墨汁灌注等观察血管形成及成骨情况.结果 ①A组血运建立快,第8周时即可修复骨缺损,其修复机制包括膜内成骨和软骨成骨两种机制;②B组血管束发出分支向移植骨内长入,但中心区成骨缓慢,第12周时骨缺损得到完全修复;③C组第4周时游离骨膜成活并发出微小血管,第8周时形成薄层外骨痂,第12周时骨缺损基本修复;④D组在BMP-2基因诱导下成骨速度和质量优于E组,可在第12周时使骨缺损部分修复,但中心区呈"空心"现象;而E组第12周时形成骨不连,缺损区内被纤维组织填充.结论 带血管蒂骨膜与BMP-2基因修饰的组织工程骨联合移植,既提供了血运又提供了骨膜成骨细胞,同时具有良好的骨生成、骨诱导和骨引导作用,是治疗节段性骨缺损较为理想的方法.
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自体骨髓基质干细胞在齿槽裂骨缺损修复中的应用
目的 探讨人自体骨髓基质干细胞(human bone marrow stromal cells,hBMSCs)在治疗齿槽裂骨缺损中的可行性.方法 2002至2005年,选择齿槽裂骨缺损患者7例(单侧6例,双侧1例),以患者自体骨髓基质干细胞为种子细胞,部分脱钙骨(partly demineralized bone matrix,pDBM)为支架材料构建组织工程骨,治疗齿槽裂骨缺损.从患者髂前上棘穿刺取骨髓,密度梯度离心法分离hBMSCs,经体外成骨诱导和扩增至第3代.将诱导的hBMSCs,复合部分脱钙骨体外培养1周后,手术回植骨缺损区.分别于术后1、3、6、12、24、36个月进行临床外形和三维CT检查随访.结果 6例患者头部三维CT检查,结果示术后3个月能形成组织工程化骨,并修复骨组织缺损.术后1～3年的随访表明组织工程骨稳定存在,无明显骨吸收现象,临床治疗效果稳定.1例患者(双侧齿槽裂)植入物外露感染.结论 以自体hBMSCs为种子细胞,部分脱钙骨为支架材料,利用组织工程技术可在人体内形成稳定的组织工程化骨组织,并临床修复齿槽裂骨缺损.
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VEGF促进BMSCS结合PLGA/HA支架治疗兔桡骨缺损的实验研究
目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)促进骨髓基质干细胞(BMSCs)结合聚乳酸乙醇酸羟基磷灰石(PLGA/HA)支架治疗兔桡骨大段骨缺损的效果.方法 选取健康3月龄新西兰大白兔48只,雌雄不限,体重2～2.5kg,制备双侧桡骨1.5cm缺损模型.制备PLGA/HA复合多孔支架,常规培养和传代新西兰大白兔BMSCs,采用仙台病毒(SeV)将VEGF基因导入BMSCs,转染后的BMSCs作为种子细胞与支架材料复合.采用随机数表法分为VEGF基因转染BMSCs组(A组)、无VEGF基因转染组(B组)、单纯支架组(C组)和空白对照组(D组),每组12只.分别于植入兔体内1周、4周和8周取材,X线片比较四组大兔骨痂生长和骨连接情况,MicroCT扫描比较缺损部位新骨形成数量、结构及材料降解情况,免疫组化染色比较血管断面数目、新生骨组织面积和残存材料面积比.结果 四组组织矿含量(TMC)和骨小梁连接密度(Conn.D.)均随时间延长而增加,且各时间点A组高于B组,C组次之,D组小,差异均有统计学意义(均P ＜0.05).说明A组材料降解明显快于B组,C组次之,D组慢.各组血管断面数和新生骨组织面积比均随时间延长而增多,且各时间点A组高于B组,C组次之,D组少,差异均有统计学意义(均P ＜0.05).各组残存材料面积百分比随时间延长而减少,且各时间点A组小于B组,C组次之,D组大,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 VEGF可进一步促进BMSCs结合PLGA/HA支架修复兔桡骨大段骨缺损,促进新生骨形成和血管新生.
关键词： 血管内皮生长因子 骨髓基质干细胞 聚乳酸乙醇酸羟基磷灰石 桡骨缺损模型 -
血管生成素-1促进骨髓基质干细胞结合聚乳酸乙醇酸羟基磷灰石支架治疗兔桡骨缺损的实验研究
目的 探讨血管生成素(Ang)-1促进骨髓基质干细胞(BMSCs)结合聚乳酸乙醇酸羟基磷灰石(PLGA/HA)支架治疗兔桡骨缺损的效果.方法 选取健康3月龄新西兰大白兔48只,随机分为Ang-1基因转染BMSCs-PLGA/HA复合多孔支架组(A组)、无Ang-1基因转染组(B组)、单纯支架组(C组)和空白对照组(D组),每组12只.分别于支架植入兔体内1、4和8周取材,采用Micro CT检测缺损部位新生骨量,免疫组化法比较血管断面数目,记录比较碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原(Col I)、骨钙素(OC)和骨桥素(OPN)阳性表达.结果 各组实验兔骨矿物质含量(BMC)均随时间延长而增加,且各时间点A组高于B组,C组次之,D组小,差异均有统计学意义(均P＜0.05).各组实验兔血管断面数目和ALP、Col I、OC及OPN阳性率均随时间延长而增多,且各时间点A组高于B组,C组次之,D组少,差异均有统计学意义(均P ＜0.05).结论 Ang-1可促进BMSCs结合PLGA/HA支架修复兔桡骨缺损,促进新生骨形成和血管新生.
关键词： 血管生成素-1 骨髓基质干细胞 聚乳酸乙醇酸羟基磷灰石支架 桡骨骨缺损 -
静脉注射骨髓基质干细胞对放射性脑损伤模型大鼠认知障碍的影响
目的 观察静脉注射骨髓基质干细胞(MSCs)对放射性脑损伤模型大鼠认知功能的影响.方法 离体分离、培养、增殖成年大鼠MSCs.采用6 MV X线对8～10周龄雌性SD大鼠做全脑照射,照射剂量20 Gy.照后1周采用尾静脉注射Hoeehst33342荧光标记的MSCs(4×106),注射后4、8周观察大鼠认知功能变化,应用免疫荧光技术检测大鼠脑内Hoechst33342标记细胞及分化的功能细胞.结果 与正常对照组相比,模型组大鼠的学习记忆能力明显受损(P＜0.01),静脉注射后4、8周,照射组大鼠认知功能明显改善(P＜0.05).结论 静脉注射MSCs可显著改善全脑照射大鼠认知功能,MSCs可在放射性脑损伤大鼠脑组织中存活和分化.
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骨髓基质干细胞靶向胶质瘤迁徙的MRI示踪研究
颅内移植或静脉注射骨髓基质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)至脑胶质瘤模型后,MSCs自注射部位向瘤床迁徙[1].然而,这些研究需在移植后一定时间内处死实验动物,对神经组织切片才能观察移植细胞的存活和迁徙情况.
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骨髓基质干细胞对腺样囊性癌细胞培养液趋化性的实验研究
目的 初步探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)作为人涎腺腺样囊性癌(SACC)微环境靶向治疗载体的可能性.方法 常规培养SACC及T293细胞(阴性对照)至对数生长期,无血清培养48h后收集上清,过滤后置于Transwell小室的下室(即24孔板底部,每孔600-800ul),中间隔以Transwell膜,在上室中加入100～150 μl对数生长期的BMSCs无血清悬液,续培24h后取出Transwell 膜,固定、染色,观察并计数迁移至Transwell膜表面上的BMSCs细胞,采用t检验进行统计学处理.结果 显微镜下随机取5个高倍镜视野,计数各组Transwell膜上迁移的BMSCs细胞,结果显示SACC-LM组为64.3±7.6,SACC-83组为52.3±6.1,均高于阴性对照组(T293)的31.8±6.3,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 BMSCs对人涎腺腺样囊性癌细胞培养上清液具有明显趋化性.BMSCs细胞具有作为腺样囊性癌微环境靶向治疗载体的可能性.
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骨髓基质细胞及诱导后成骨细胞在钛合金表面粘附率的研究
目的研究小型猪的骨髓基质细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)及其诱导后的成骨细胞在种植体钛合金(Ti-6Al-4V)表面的粘附情况.方法分离培养小型猪的骨髓基质细胞,并将其诱导为成骨细胞.分别将不同浓度的骨髓基质细胞及诱导后的成骨细胞悬液接种于种植材料表面,利用扫描电镜观察其粘附情况,计算不同接种浓度下两种细胞与种植材料的粘附率及粘附的细胞数.结果两种细胞在种植体表面粘附良好,接种浓度为3×105/100μl组两种细胞在种植材料表面的粘附细胞数量分别为17.6×106和18.6×106;粘附率分别84.2%和85.5%.两种细胞在钛合金表面的粘附率和粘附的细胞数与其余三组(1×105/100 μl;2×105/100μl;4×105/100μl)相比差异均有显著性.结论小型猪BMSC在体外可经条件培养液诱导为成骨细胞,接种浓度为3×105/100μl组骨髓基质细胞及成骨细胞在种植材料表面有良好的粘附能力.
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续断皂苷Ⅵ对小鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响
目的:探讨续断皂苷Ⅵ(ASA Ⅵ)对小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用机制及对小鼠骨质疏松的防治作用.方法:采用MTT法、钙浓度检测及RT-qPCR方法评价ASA Ⅵ对BMSCs细胞活力、成骨分化及Wnt通路相关基因表达的作用;通过Micro-CT定量分析ASA Ⅵ对去卵巢(OVX)小鼠骨形态计量参数的影响.结果:适宜浓度下的ASA Ⅵ能提高BMSCs的细胞活力,促进细胞基质矿化,升高BMP-2、Runx2、β-catenin、OCN的基因表达,Wnt信号阻断剂(DKK-1)能降低这些成骨基因表达.ASA Ⅵ能增加OVX小鼠的股骨骨量,改善骨小梁微结构.结论:ASA Ⅵ促进BMSCs成骨分化,Wnt信号可参与了ASA Ⅵ诱导的成骨分化过程.
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骨髓基质干细胞的研究进展及在口腔临床的应用
骨髓基质干细胞具有多种潜能,在一定条件下能分化成多种类型的细胞,包括骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞等,同时其易于分离和培养扩增,有望成为治疗人类多种疾病的新型工具.本文就基质干细胞的生物学特性,体外分化及在口腔临床方面的应用作一简要综述.
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不同浓度葡萄糖对大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨分化的影响
目的:体外观察不同葡萄糖浓度对大鼠颌骨骨髓基质细胞(BMSCs)向成骨细胞分化能力的影响.方法:无菌条件下从4周龄SD大鼠下颌骨获取BMSCs,采用全骨髓贴壁培养法对细胞进行纯化及培养,流式细胞仪检测干细胞表型及进行成骨分化检测,随后选取第4代细胞在不同糖浓度(5.5,16.5,25,35mM)干预下向成骨细胞定向诱导分化,其后对各组进行茜素红染色,碱性磷酸酶染色和活性测定,培养基钙、磷含量测定,并采用Western blot测定骨形成蛋白2(BMP-2)水平以及real-time PCR测定Runx2基因表达变化.组间比较采用单因素方差分析法(SPSS 11.0).结果:随着葡萄糖浓度的升高,茜素红染色钙结节形成逐渐减少,碱性磷酸酶(ALP)活性下降,细胞钙、磷分泌显著降低,差异有统计学意(P＜0.05);BMP-2水平以及Runx2 mRNA表达也明显降低(P＜0.05).结论:在高糖条件下,大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨分化能力减弱,而BMP信号通路可能参与其中.
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BMSC-HA/CP修复牙槽骨缺损后牙齿移动的实验研究
目的:探讨小型猪牙齿在牙槽骨缺损修复区的移动情况.方法:选用6只实验用小型猪(8-10个月龄),在一侧前磨牙近中造成直径为15mm,高为10mm圆柱状的骨缺损区.获取小型猪的自体骨髓基质细胞,分离培养并诱导为成骨样细胞.将小型猪自体骨髓基质干细胞与生物复合体(60%羟基磷灰石+40%磷酸三钙)复合后,种植到骨缺损区.另一侧作为对照侧.术后14W用60g力牵引双侧第一前磨牙近中移动.于12W后测量双侧前磨牙的移动距离.进行配对t检验比较.结果:6只小型猪两侧第一前磨牙近中移动平均距离的差异无统计学意义(P＞0.05).结论:应用细胞支架构建方式,可修复小型猪的上颌骨缺损,修复后不会对牙齿移动产生不良影响.
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骨髓基质干细胞与微粒皮组织促进皮肤缺损创面愈合的实验研究
目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)与微粒皮组织移植对皮肤缺损创面愈合的影响.方法 分离、培养、鉴定雄性F344大鼠骨髓基质干细胞;在大鼠背部形成4cm×4cm皮肤全层缺损创面;48只雌性F344大鼠随机均分为4组,A组行骨髓基质干细胞注射+微粒皮组织创面移植,B组仪行微粒皮组织创面移植,C组仅注射骨髓基质干细胞,D组仅行生理盐水(0.5ml)创面注射.移植的微粒皮组织占1/4创面面积,注射5×106个BMSCs细胞.雌性Wistar大鼠异体皮覆盖创面.观察术后14d创面愈合率、创面愈合时间、创面收缩率,并行Y染色体检测,以观察骨髓基质干细胞在创面的成活增殖情况.结果 A、B两组创面愈合率(分别为85.8%±3.5%、62.2%±4.4%)远高于C、D组(分别为30.4%±1.7%、30.0%6±1.3%),且A组显著高于B组(P<0.01),但C、D两组间比较没有显著性差异(P=0.898).A、B两组愈合时间(分别为17.2±1.6、20.3±2.4d)明显短于C、D组(分别为23.1±1.3、25.2±1.5d),且A组明显短于B组,C组明显短于D组(P<0.01).A、B两组收缩率(分别为36.9%±1.9%、39.6%±2.9%)明显小于C、D组(分别为92.5%±1.4%、92.4%±1.9%),且A组明显小于B组,而C、D两组的创面收缩率比较没有显著性差异.在A组、C组组织标本中可检测到数量不等的Y染色体阳性细胞.结论 BMSCs可在移植创面成活,能够与微粒皮组织相互作用,促进创面愈合.
