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重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨
目的:构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,hBMP-2)真核表达载体PcDNA3.1-hBMP-2,转染兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),种植去抗原牛松质骨(bovine canoellous bone,BCB)支架体外构建组织工程骨.方法:蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达,碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响.然后将转染后细胞接种到BCB支架上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况.结果:转染后,BMSCs表达BMP-2,ALP活性明显增高.扫描电镜见转染细胞分布均匀,伸展良好.结论:在脂质体介导下,BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化,转染后细胞在支架材料上贴附生长良好,为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础.
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益肾通络汤干预异体骨髓间充质干细胞治疗激素性股骨头坏死
目的:探讨益肾通络汤干预异体骨髓间充质干细胞移植对早期兔激素性股骨头坏死(SANFH)的治疗作用.方法:成年新西兰白兔50只,建立兔激素性股骨头坏死模型,随机分为5组:髓芯减压+干细胞复合同种异体脱钙骨移植+中药复方灌胃组(A组);髓芯减压+干细胞复合同种异体脱钙骨移植组(B组);髓芯减压+中药复方灌胃组(C组);单纯中药复方灌胃组(D组);单纯髓芯减压组(E组);各组于术后给予相应处理.分别于干预后2、4、8周处死动物,行X线、MRI检查;股骨头组织病理切片染色后,在光镜下观察新骨痂及新生骨组织的联结情况.结果:术后8周A组X线示骨移植区密度增高,MRI示坏死区低信号明显缩小,组织病理学切片光镜下显示成骨细胞较多,新骨形成,空骨陷窝率和血管计数与其余各组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:益肾通络汤干预自体骨髓间充质干细胞人工骨复合体移植能促进激素性兔股骨头坏的修复.
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-80℃保存组织工程骨异位成骨的实验研究
目的 探讨不同保存方法对组织工程骨异位成骨能力的影响.方法 以骨髓基质干细胞(maffow stromal cells,MSC)复合部分脱蛋白骨培养制备组织工程骨,分别用添加或不添加冻存保护剂的保存液于-80℃深低温冻存3个月,3个月后复温.选择40只新西兰白兔,将材料植入动物脊柱旁的肌肉内,根据植入不同的材料实验分为A组,植入添加冻存剂保存的组织工程骨;B组,植入未添加冻存剂保存的组织工程骨;C组,植入未行低温保存的组织工程骨;D组,植入部分脱蛋白骨.术后4、8周取材,行组织学观察和计算机图像分析.结果 术后4、8周,各组异位成骨组织学评估,A组与C组比较未见差异(P〉0.05),A组或C组分别与B组比较,A和C组异位成骨能力均好于B组(P〈0.001,P〈0.05);D组材料无异位成骨.结论 选择适宜的冻存保护剂对组织工程骨的生物活性有一定的保护作用.
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RGD多肽表面修饰对羟基磷灰石修复骨缺损微循环的影响
目的了解精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)多肽表面修饰的羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)修复骨缺损过程中,实验动物血液流变学和骨缺损修复区血流量的变化.方法选择20只新西兰白兔,制作15mm长的桡骨节段性骨缺损模型,根据植入不同移植材料分为实验组和对照组,实验组于动物左侧桡骨缺损区植入MSC复合RGD多肽表面修饰的HA培养制备的组织工程骨,对照组植入MSC复合HA培养制备的组织工程骨,观察各组动物术后7d、14d血液流变学和术后14d骨缺损修复区血流量的变化.结果实验组与对照组比较,血液流变学指标和骨缺损修复区血流差异显著,实验动物全身血液黏度和红细胞聚集指数降低,骨缺损修复区的局部血流量增加.结论 RGD多肽表面修饰对以HA为支架材料组织工程骨的修复有明显优化作用.
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骨髓间充质干细胞与复合I型胶原和骨形态发生蛋白2的聚乳酸乙醇酸构建组织工程骨
目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)体外分离培养后种植到复合Ⅰ型胶原和重组人类骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)的聚乳酸乙醇酸(PLGA)生物支架上,构建组织工程骨的可行性.方法密度梯度离心法提取分离BMSC,倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞分析法对细胞表面抗原进行鉴定.相分离法制备多孔三维PLGA生物支架,支架材料上复合Ⅰ型胶原和rhBMP-2,扫描电镜观察其超微结构.将第3代的BMSC接种于复合支架上,扫描电镜观察材料的细胞黏附性,将培养6 h 后的细胞-支架复合体植入SD大鼠肌袋内,于2个月后取材进行HE染色,观察其构建组织工程骨的情况.结果 BMSC可在体外分离扩增,表达CD29、CD44,不表达CD34和CD45.制备的PLGA支架孔隙率为90%,平均孔径为100 μm,与BMSC有较好的黏附性.2个月后动物体内细胞-支架复合体的大体观察和HE染色显示,BMSC种植到复合Ⅰ型胶原和rhBMP-2的PLGA生物支架上可构建骨组织.结论 BMSC可在体外长期、稳定培养,是理想的组织工程种子细胞.PLGA与干细胞有较好的黏附性,可用来做组织工程生物材料.BMSC种植到复合Ⅰ型胶原和rhBMP-2的PLGA生物支架上后,在动物体内可构建组织工程骨.
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骨髓间充质干细胞与不同基质修饰的纳米晶胶原基骨体外生物相容性研究
研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导培养后与不同基质修饰的纳米晶胶原基骨(nanoHydroxyapatite/collagen,nHAC)的生物相容性,为骨组织工程提供一种新型复合支架材料.SD大鼠MSCs经成骨诱导培养、扩增,进行成骨细胞表征后,种植与支架材料体外复合培养.实验分为4组:实验组A,纤维蛋白(FB)和纤维连接蛋白(FN)修饰的纳米晶胶原基骨((FB+FN)-nHAC);实验组B,纤维蛋白修饰的纳米晶胶原基骨(FB-nHAC);实验组C,纤维连接蛋白修饰的纳米晶胶原基骨(FN-nHAC);对照组D,单纯的纳米晶胶原基骨(nHAC).通过检测支架材料的细胞黏附率、不同时间点(3、7、10、14d)支架材料中细胞数、碱性磷酸酶活性以及扫描电镜观察细胞在材料上的生长状况,比较分析不同支架材料与细胞生物相容性差异.大鼠MSCs经诱导培养14d后,碱性磷酸酶细胞化学染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色及矿化沉积茜素红染色均为阳性;细胞与支架材料黏附率A组高为74.4%;支架材料中细胞数量均随培养时间延长而增长,且A组细胞数增加较快.与相同时相点其他各组材料中细胞数差异有显著性(P<0.05);各时相点细胞碱性磷酸酶活性表达A组高,差异亦有显著性(P<0.05).电镜观察发现4组材料上均有细胞生长,但A组的细胞生长状况明显好于其他组.大鼠MSCs经成骨诱导培养,可表达成骨细胞表型,(FB+FN)-nHAC在体外实验中表现出与细胞优良的生物相容性,可作为较理想的新型复合支架应用于骨组织工程.
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应用酶联免疫法检测组织工程骨牛血清白蛋白残余量的实验研究
目的 检测常规体外构建的组织工程骨中牛血清白蛋白残余量,并探讨减少其残留量的方法.方法 体外分离培养人骨髓基质干细胞,取第2代细胞(P2)接种于完全脱钙骨支架材料并成骨诱导培养2周,体外构建组织工程骨.成骨诱导液为含10％胎牛血清的条件培养液,并于检测前1天更换为无血清的条件培养液.待测组织工程骨先经1∶100 (v∶v)生理盐水浸洗3次,然后加入磷酸盐缓冲液(PBS),37℃振荡浸提24 h,获取浸提液.同法获取未接种细胞的单纯支架材料的浸提液作为对照组.采用酶联免疫法检测样品浸提液中牛血清白蛋白的残余量,比较两者牛血清白蛋白残余量的差异.结果 经生理盐水洗涤3次后,洗涤液中的牛血清白蛋白含量明显降低.酶联免疫法测定的组织工程骨与单纯支架材料的牛血清白蛋白残余量分别为(15.57±5.82)ng和(14.85±5.06)ng,单位重量的牛血清白蛋白残余量分别为(0.254±0.088)ng/mg和(0.306±0.079)ng/mg,两组相比均无显著性差异(P＞ 0.05,n=10).结论 酶联免疫法适用于组织工程骨中牛血清白蛋白残余量的检测.因为支架材料较细胞更易吸附牛血清白蛋白,现有条件下构建的组织工程骨牛血清白蛋白残余量仍然较高,需要继续探索降低其残余含量的新方法.
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种植骨髓干细胞的多孔人工骨在猴脊柱后外侧融合术中的应用
目的 使用种植有骨髓间充质干细胞的多孔人工骨应用于动物的脊柱后外侧融合手术,评估组织工程骨能否替代自体骨的使用.方法 6只食蟹猴行双侧L4-5脊柱融合手术.分为3组,分别移植种植细胞的β-磷酸三钙(β-TCP)、自体骨和单纯β-TCP.手术后12周处死.采用手法触压检查、微CT和外周定量CT(pQCT)以及组织学方法进行评估.结果 手触检查显示,4例中有3例移植组织工程骨和自体骨形成硬性融合,而移植单纯β-TCP组均无硬性融合形成.组织学分析显示,移植组织工程骨组存在大量骨形成.pQCT显示,组织工程骨新骨形成增加了骨密度.结论 组织工程骨可以用于替代自体骨的使用.
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组织工程骨的血管化研究进展
随着骨组织工程技术的日益发展及临床患者的迫切需要,骨缺损修复的研究已经逐步从基础研究向临床研究过渡.众所周知,天然骨的存活和生长在很大限度上取决于周围或是自身内部的血管为其提供氧及其他必须营养物质并及时排除机体代谢产物[1].
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人脐带间充质干细胞复合β-磷酸三钙支架修复兔桡骨骨缺损的实验研究
目的：通过检测人脐带间充质干细胞的体外多向分化及对兔桡骨骨缺损修复过程的影响，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可能性。方法体外培养人脐带间充质干细胞，并诱导其成骨、成软骨、成脂肪三系分化后进行染色鉴定，将人脐带间充质干细胞接种于β-磷酸三钙（β-TCP）支架后作为实验组，植入兔桡骨骨缺损模型中，仅植入β-磷酸三钙（β-TCP）作为对照组，于3个月后行X线检查并取材行HE染色，并分别于术后1、2、3个月进行CT值检测，检测其修复效果。结果人脐带间充质干细胞体外生长良好，呈长梭形，形态均一，使用成骨、成软骨和成脂培养基分别诱导培养后碱性磷酸酶染色、骨桥蛋白及骨钙素免疫细胞化学染色、茜素红染色、番红O染色、亚甲基蓝染色和油红O染色分别呈阳性，体内试验中X线检查对照组与实验组均可见材料与周围骨断端相连，HE染色见实验组有新生骨组织形成，对照组则为纤维结缔组织，CT值在1个月和2个月时实验组明显低于对照组（P<0.05），3个月时两组结果无明显差异（P>0.05）。结论人脐带间充质干细胞具有多向分化能力，并能够促进兔骨缺损的愈合过程，有望成为骨组织工程的种子细胞。
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BMP-2基因转染的人骨髓基质干细胞复合PLA/PCL支架体外构建组织工程骨
目的用人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染的人骨髓基质干细胞(hBMSC),复合PLA/PCL(聚乳酸/聚己内酯)生物降解支架体外构建组织工程骨.方法用Ad-BMP-2转染体外培养的成人BMSC,免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹方法检测细胞BMP-2的表达,并通过流式细胞仪和ALP活性检测分析其对细胞增殖、分化的影响.然后将转染后细胞接种到PLA/PCL支架上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况.结果转染后,hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达;S期细胞比例和ALP活性明显增高.扫描电镜见转染细胞分布均匀,伸展良好.结论 Ad-BMP-2可高效转染hBMSC,且促进细胞增殖及成骨转化.转染后细胞在PLA/PCL上生长良好,BMP-2基因治疗的组织工程骨构建成功.
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骨髓基质干细胞片层复合聚乳酸羟基乙酸支架构建组织工程骨
目的 制备骨髓基质干细胞片层,探讨其对组织工程骨成骨的作用.方法 培养骨髓基质干细胞(BMSCs)并向成骨方向诱导,利用温度反应性培养皿制备骨髓基质干细胞片层,光学及电子显微镜下观察其形态.将经过预处理的三维多孔聚乳酸羟基乙酸(PLGA)支架注射BMSCs悬液并复合干细胞片层后植入犬左侧下颌骨缺损,为实验侧；将未复合细胞片层的支架植入右侧,为对照侧.16周后,对新生骨行影像学及组织学观察分析.结果 片层中细胞排列紧密,生长活跃.实验侧吸光度值高于对照侧(P＜0.05),并可见较多哈弗系统及板层骨样结构.结论 经温度反应性培养皿制备的干细胞片层结合PLGA支架可形成具有板层状结构的组织工程骨.
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组织工程骨修复牙槽嵴裂的实验研究
目的 探讨骨髓来源的种子细胞复合胶原蛋白海绵构建组织工程骨修复牙槽嵴裂的可行性.方法 12条实验犬被分成4组.于双侧上颌第3切牙处去除长15 mm牙槽骨形成牙槽嵴裂动物模型;经股骨骨髓穿刺,分离骨髓基质干细胞,培养、传代扩增诱导后,与蛋白胶原海绵混合培养48 h,植入骨缺损处.饲养12周后处死动物,通过三维CT及组织学检查评价骨缺损修复的效果.结果 实验组牙槽骨断端间形成完整的骨连接,切片可见髓腔通畅,新形成的牙槽嵴宽度与松质骨组相似(P＞0.05),但高度不足(P＜0.05).结论 组织工程骨可以较好地修复牙槽嵴裂,有望成为修复牙槽嵴裂的治疗方法.
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应用骨髓基质细胞片层构建组织工程骨的实验研究
目的 应用犬骨髓基质细胞片层构建组织工程骨,为临床提供组织工程骨来源.方法 分离培养传代犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell,BMSC).将经成骨诱导的第3代BMSC接种于温度反应性培养皿中,制备BMSC细胞片层.制备犬同种异体脱钙骨基质(decalcification bone matrixes,DBM).实验用16只犬分为4组,每组4只,采用自身对照.将复合体BMSC片层-人重组骨形态生成蛋白2( rhBMP-2) -BMSC-DBM植入犬左侧背阔肌肌筋膜下为实验侧,同法右侧植入DBM-rhBMP-2-BMSC为对照侧.术后4、8、12、16周取材行组织学观察,评价体内异位成骨的情况.结果 实验侧成骨优于对照侧,成骨面积实验侧＞对照侧,两侧差异有统计学意义(P＜0.05).术后16周,实验侧板层骨连接成片,可见骨单位,骨髓腔内可见红骨髓.结论 BMSC细胞片层可促进功能性组织工程骨的形成.
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氯化镧对实验犬组织工程骨成骨的影响
目的 观察氯化镧对植入实验犬颌骨自体骨缺损区的组织工程骨成骨情况的影响.方法 选成年杂种犬9只,从股骨抽取骨髓、以密度梯度离心法获取骨髓基质细胞(BMSCs)并诱导培养为成骨细胞.以5.564 μg/ml的氯化镧(La3+)干预第三代BMSCs并将其与猪脱钙冻干骨(fdDBM)复合,体外培养7 d后植入实验犬颌骨人造骨缺损处(2 cm × 1 cm × 0.8 cm),另设BMSCs加fdDBM、fdDBM及空白对照组.3个月及6个月后处死实验犬获取颌骨标本并加工处理作形态学观察及X线骨密度分析.所得数据用SAS 6.12软件包进行方差分析.结果 BMSCs与fdDBM复合回植3个月后实验犬骨缺损能完全或大体为新生骨修复.La3+干预组回植区新生骨的密度值较高,但与对照组的密度值比较差异无统计学意义(P ＞ 0.05).回植6个月后 BMSCs加fdDBM与单纯fdDBM回植区新生骨的骨密度值比较差异无统计学意义(P ＞ 0.05),但该二组的骨密度值明显高于对照组(P ＜ 0.05).结论 5.564 μg/ml浓度的氯化镧对回植入实验犬人造颌骨缺损处的组织工程骨成骨作用无明显负面影响.
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"成血管化"对组织工程骨成骨的影响
本文重点关注在应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时,其中心的部分经常因缺血而发生坏死,所以在新生的骨组织形成之前构建血供系统是极其重要的一步.因此,"成血管化"成为组织工程骨修复骨缺损的关键.本文通过对血管生成过程,成血管细胞、因子、主要的成血管化方法,以及成血管化对成骨的作用介绍,阐述了成血管化是组织工程骨成骨的重要前提.
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组织工程技术修复下颌骨骨缺损的研究进展
随着组织工程技术的发展，构建组织工程骨修复下颌骨缺损是近年来国内外研究的热点，此方法仅需从自体获取少量种子细胞，通过体外扩增并与适当的支架材料整合后，移植入骨缺损区或经体外培养后再移植入受区，产生新的自体骨组织并与周围正常骨愈合，达到修复目的。本文拟就组织工程下颌骨支架材料、种子细胞、生长因子、临床前研究及临床应用等研究进展作一综述。
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关键词：
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应用富含血小板血浆构建组织工程骨的研究
目的 探究富含血小板血浆(PRP)是否能成为接种骨髓间充质干细胞(BMSCs)于3D支架中的有效媒介,是否具有促进骨组织再生、新生骨成熟及血管化的作用,为组织工程骨的构建策略及动物实验和临床应用提供理论依据.方法 体外培养新西兰兔BMSCs至第三代作为种子细胞,分别应用PRP组、乏血小板血浆(PPP组)重悬BMSCs,双相接种法构建细胞/支架复合体,另设对照组,通过检测支架内DNA含量、碱性磷酸酶(ALP)含量,对比细胞的接种效率、增殖和分化情况.结果 PRP组的成骨量较PPP组和对照组显著(P＜0.05).结论 用PRP介导的双相接种法可以促进BMSCs在细胞/支架复合物中增殖并向成骨分化；PRP双相接种法是一种可行的构建组织工程骨的方法,具有很大的潜力和广阔的应用前景.
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以带蒂筋膜瓣为引导骨再生膜包裹非细胞型组织工程骨修复超临界骨缺损研究进展
由创伤、肿瘤、感染、先天性畸形等造成的骨缺损临床治疗非常棘手，且由骨缺损导致的骨不愈合发生率很高。美国每年约600万骨折患者中，5％～10％因骨缺损导致骨折无法愈合[1]。骨缺损的治疗措施多种多样，自体骨移植是目前临床上治疗骨缺损的主要方法。但该方法存在缺陷，并可带来一些并发症，不利于其在临床中的广泛使用[2-3]。用带蒂筋膜瓣为膜材料应用引导性骨再生(guided bone regeneration，GBR)技术包裹非细胞型组织工程骨修复骨缺损是近年来研究的热点。现就应用带蒂筋膜瓣GBR技术包裹非细胞型组织工程骨修复超临界骨缺损的研究进展综述如下。
