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来自腹泻合并急性肾衰病人疫区的99株E.coliO157:H7的鉴定结果分析
目的调查研究河南省2000年3月17日-7月6日发生的腹泻合并急性肾衰病人的致病菌.方法采集病人、外环境、家畜和家禽标本620份,采用免疫磁珠集菌法、CHROMAGAR-O157:H7显色培养基分离及营养肉汤增菌、rfbO157、rfbO111引物多重PCR扩增等方法进行病原菌的检测.结果分离出99份E.coli O157:H7菌株,其中rfbO157、志贺氏样毒素2(stx2)、溶血素(hlyA)、肠上皮细胞纤毛消除素(eaeA)基因和vero细胞毒性试验均阳性的有56株,其它基因组合7株,36株无毒力基因.结论99株E.coli O157:H7在CHROMAGAR-O157:H7显色培养基生长形态、颜色,生化反应及毒力基因表现等方面出现多样化,对于今后在制定对该菌的诊断标准、传染源的控制及细菌毒力学等方面的研究提供了依据.
关键词： E.coli O157:H7 免疫磁珠 多重PCR 毒力基因 -
应用免疫磁珠富集法江西省首次检出肠出血性大肠杆菌O157:H7
肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种新型的致病性大肠杆菌,能引起人类出血性腹泻和溶血性尿毒综合征,也是一种人畜共患病,国际上比较一致的观点是认为牛、猪等动物是出血性大肠杆菌O157:H7的主要传染源,为了解江西省肠出血性大肠杆菌O157:H7的分布及流行情况,我们进行了初步调查,现将结果报告如下.
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应用免疫磁珠富集法河北省首次从食品中检出O157:H7大肠杆菌
继我市用常规法在牛粪及腹泻病人粪便中检出O157:H7出血性大肠杆菌后,今年我们又应用免疫磁珠富集技术,在河北省首次从食品中检出肠出血性大肠杆菌O157:H7.从353份样品中分离出2株O157:H7大肠杆菌,检出率为0.57%,提示我市甚至我省存在着O157:H7出血性大肠杆菌腹泻流行或暴发流行的危险.
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免疫磁珠富集在食品中黄曲霉毒素B1的应用
本文介绍了黄曲霉素、超顺磁性磁珠以及对食品中黄曲霉素B1的主要提取方法,并对近年来利用免疫磁珠富集法联合其他方法进行食品中黄曲霉素B1检测的进展进行了综述.
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M-FASTTM(磁在快)沙门氏菌测试盒在沙门氏菌检验中的应用研究
据美国农业部农业经济研究部门新数据统计显示,沙门氏菌每年在美国导致的医疗花费达到37亿美元,这个数据将沙门氏菌排在了美国食源性疾病花费高的15大致病菌之首.另外,一系列沙门氏菌引起的食物中毒事件也表明,沙门氏菌早已成为全球常见的食源性致病菌之一.传统沙门氏菌检测技术存在耗时、繁琐、低效等缺点,故快速、灵敏、可靠的新型快速检测技术成为研究热点.将免疫学和生物化学技术有机结合,利用微生物特异性免疫磁珠和微生物测试片实现待检致病菌的双重筛选,大大提高了沙门氏菌检测的特异性,灵敏度明显高于同类产品,并大幅度缩短检测时间.
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基于多色量子点和免疫磁珠技术检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌
目的 建立基于量子点和免疫磁珠技术检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的方法.方法 利用水相法合成多色的CdSe量子点,通过共价交联法将三色量子点与抗沙门菌、抗志贺菌和抗金黄色葡萄球菌的特异性抗体偶联,利用紫外吸收光谱和SDS-PAGE电泳证明偶联是否成功.利用免疫磁珠富集,量子点标记,通过荧光显微成像法对沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌进行检测.结果 多色量子点与3种菌的特异性抗体偶联成功,通过选用3种不同颜色不同发射波长的量子点作标记,利用免疫磁珠富集3种菌,在同一反应体系中同时检测3种菌,检测时间在2h之内.对模拟感染目标菌的样品直接检测,检测限为103 CFU/ml.结论 该方法能够快速、特异性地检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌.
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不同磁珠对致病菌吸附性能的比较研究
目的 通过对裸磁珠、单一抗体和混合抗体包被的免疫磁珠的吸附性能的比较,建立一种快速、同时富集多种致病菌的方法.方法 通过沉淀法制备Fe3O4磁珠,对其进行表面修饰,用抗体进行偶联制备成免疫磁珠,比较不同磁珠对致病菌的吸附性能.结果 通过化学合成和修饰的方法制备出裸磁珠和Fe3Oj/SiO2的免疫磁珠.免疫磁珠对细菌的吸附率与裸磁珠比较差异显著(t=7.55,P＜0.05),平均吸附率分别为96.62％和80.89％.通过洗涤优化,免疫磁珠对目标菌的吸附率从97.03％降到93.67％,对非目标菌的吸附率从53.33％降到16.67％;裸磁珠对目标菌和非目标菌的吸附率从81％降到13.33％;免疫磁珠对单一菌和混合菌的吸附性能无显著差异(P =0.427).结论 单一抗体和混合抗体包被的免疫磁珠能特异性富集目标菌,通过富集程序优化可以达到良好的吸附效果.
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A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体及其免疫磁珠制备技术
目的 制备用于隐蔽态A型单端孢霉烯族毒素富集净化的免疫磁珠.方法 采用A型单端孢霉烯族(简称A型单族)毒素人工抗原3-乙酰-新茄腐镰刀菌烯醇-酸酐-牛血清蛋白(3-Ac-NEOS-HS-BSA)免疫新西兰长耳白兔,分离血清制备A型单族毒素多克隆抗体,测定效价并纯化.然后优化高效价抗体与免疫磁珠的偶联条件并应用.结果 免疫5次后的兔血清中A型单族毒素抗体效价高为1∶64 000.抗体和磁珠的优偶联条件为:24℃、pH 7.4、0.02 mol/L含10％甲醇的PBS缓冲液中旋转捕获24 h.结论 A型单族毒素多克隆抗体及其免疫磁珠的制备为同步富集净化复杂基质中A型单族毒素、提高方法的检测限奠定基础.
关键词： 多克隆抗体 免疫磁珠 A型单端孢霉烯族毒素 -
一种磁珠纯化分选系统的结构与原理
本文介绍了一种磁珠纯化分选系统内部的结构设计.该系统不仅可以用于细菌的分选,还能够用于基因、蛋白、细胞等物质的纯化分选,应用范围极广.该系统满足了自动化、通量高、工作体积范围大的研究和实验要求.
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免疫磁珠-环介导等温扩增联用技术快速检测副溶血性弧菌方法的建立
目的 建立一种快速且质优价廉的检测副溶血性弧菌的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法.方法 制备副溶血性弧菌跨膜转录调控蛋白toxR多克隆抗体,鉴定纯化后,进行磁珠包被制成免疫磁珠.利用免疫磁珠分离法和环介导等温扩增联用完成对副溶血性弧菌的检测,扩增产物经SYBR Green I染色肉眼观察和电泳鉴定.将副溶血性弧菌菌液作一系列稀释后,运用LAMP法进行敏感性检测,利用副溶血性弧菌和非副溶血性弧菌来验证LAMP方法的特异性.结果 LAMP检测副溶血性弧菌的检测下限为105 CFU/ml.副溶血性弧菌出现LAMP特征性扩增反应,非副溶血性弧菌未出现LAMP扩增.结论 LAMP检测方法为快速诊断试剂盒打下实验基础,适合日常监测,可满足快速检测的需要.
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郑州市腹泻患者、宿主动物及食品中肠出血性大肠埃希菌O157:H7监测
为了解郑州市腹泻患者、宿主动物及食品感染或污染O157:H7状况,建立全市流行病学监测网,在辖区内采集动物(牛、羊、猪、鸡、狗等)、门诊腹泻患者粪便及市售食品进行监测.1.材料与方法:mEC增菌培养基、SMAC培养基、抗-E.coli O157:H7免疫磁珠、磁铁架、O157抗血清、H7抗血清等均由河南省疾病预防控制中心提供,有效期内使用.检测方法按照<2005年重点肠道传染病国家级监测点工作会议>的方法进行.
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2株不同产志贺毒素大肠埃希菌O157感染症一例
患儿,男,2001年2月20日出生,发育正常,于12月6日开始出现灰白色水样腹泻(6～8次/24 h,未见血性腹泻)、肠鸣、呕吐、厌食等症状,无溶血性尿毒综合征,体温正常,病前有食用牛奶和水果史.采用血清学和生物化学方法,12月8日采集患儿粪便标本(1 ml)增菌培养.增菌培养物经大肠埃希菌(E.coli)O157免疫色层技术(E.coli O157快检金卡,郑州博赛生物技术研究所和美国BINAX公司产品)检测,中国和美国的两种检测卡均显强阳性,增菌培养液浸至检测线区域即呈现出比照线粗且颜色更深的阳性线,随后取增菌培养物和免疫磁珠集菌物分别划线接种于Chromagar O157平板上并于37℃培养24 h,得到许多直径为2 mm、外周透明而中央区呈兰绿色(1号菌)和直径为1 mm外周透明而中央区呈兰红色(2号菌)的两种圆形光滑菌落,其他形态的菌落很少甚至不出现(免疫磁珠集菌物).
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特异性免疫磁珠联合毛细管电泳技术检测蛋白质的方法探讨
目的 尿液蛋白的检测在疾病的诊断、监测和疗效评估中发挥着重要作用.目前常用的蛋白检测方法无法检测尿液低浓度蛋白.为了实现对尿液低浓度蛋白的检测,使其应用到临床诊断等方面,本实验室尝试应用特异性免疫磁珠联合毛细管电泳方法检测尿液低浓度蛋白.本实选择β-actin单克隆抗体来制备特异性免疫磁珠对该方法进行可行性探讨和方法学研究.方法 将β-actin单克隆抗体以共价偶联的方式包被到羧基磁珠表面,用含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液封闭磁珠,获得特异性β-actin免疫磁珠.使用pH 10.0的0.02mol/L硼砂溶液对β-actin免疫磁珠进行洗脱,将洗脱液进行毛细管电泳,验证免疫磁珠是否制备成功.结果 β-actin免疫磁珠洗脱液的毛细管电泳图中可见到β-actin抗体峰和BSA峰,结果表明β-actin抗体与羧基磁珠偶联成功以及BSA封闭羧基磁珠成功.结论 本实验成功的制备了特异性β-actin免疫磁珠,并应用毛细管电泳方法进行相关验证,此实验为特异性免疫磁珠联合毛细管电泳方法检测尿液低浓度蛋白奠定了基础.
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人循环内皮细胞的分离和鉴定
目的建立从外周血中获取循环内皮细胞(CECs)的免疫磁珠分离技术.方法取1 mL全血按1:2稀释,加入20 μL抗CD146磁珠抗体,4℃孵育,再加入等体积缓冲液,置于磁架上,吸弃液体,用100 μL缓冲液重悬磁珠.用吖啶橙或Giemsa染色在荧光倒置相差显微镜下计数与磁珠结合的细胞,并用抗-vWF及CD31进行免疫细胞化学鉴定.结果经抗-vWF及CD31鉴定所分选的CECs是内皮细胞.正常健康体检者的CECs数量为10.5(6～16.5)个/mL.使用此法对正常人脐静脉内皮细胞(HUVECs)混合于正常人全血中的高回收率为91%.结论用CD146免疫磁珠技术分离CECs,具有客观、准确、省时、特异性强及回收率高、取血量少和对内皮细胞损伤小的特点,本方法可用于不同疾病患者血液中CECs的定量检测及其功能状态分析.
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人胎儿脑室区神经前体细胞的分离纯化、培养及鉴定
目的建立有效的人胎儿神经前体细胞分离及纯化系统.方法取人自然流产胎儿脑室区(VZ)并制备单细胞悬液,采用免疫磁珠法分离CD133阳性及CD133阴性细胞群,体外培养并比较两者增殖能力.用免疫荧光化学方法检测CD133阳性细胞群中神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达及诱导分化后的多向分化潜能.结果纯化后CD133阳性细胞群体外扩增能力强,在无血清培养体系中能形成神经球并可连续传代,免疫荧光化学法检测表明其nestin抗原阳性,诱导分化后可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.而CD133阴性细胞在培养体系中多呈单个分散状态,神经球形成数目与CD133阳性细胞有显著性差异(P＜0.05).结论免疫磁珠法可有效分离人胎儿脑内CD133阳性细胞,且该细胞在体外培养体系中具有神经前体细胞的特征.
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免疫磁珠捕获法分离抗酸杆菌的实验研究
目的:建立免疫磁珠捕获法,用于分离抗酸杆菌,以提高痰菌阴性肺结核的诊断率.方法:选取浸润型肺结核患者19例作为实验组,对照组6例,为肺部普通细菌感染者.受检者留取痰液,分别做直接涂片抗酸染色检查及免疫磁珠分选后抗酸染色检查.结果:19例浸润型肺结核患者中,7例痰涂片抗酸染色检查阳性.免疫磁珠分选后抗酸染色仍阳性;在12例痰涂片阴性肺结核患者中,经免疫磁珠分选后6例抗酸染色阳性.6例普通细菌性肺炎患者经免疫磁珠分选后抗酸染色均为阴性.结论:用免疫磁珠捕获法分离抗酸杆菌能显著提高痰菌阴性肺结核的诊断效率.
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免疫磁珠正负筛选在分离外周血CD8+和 CD4+T细胞亚群中的应用
为了探讨免疫磁珠分离技术及其正、负筛选策略在人外周血T淋巴细胞亚群分离提纯中的应用,应用补体细胞毒法和正负筛选策略相结合的免疫磁珠法分离健康人外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞;用流式细胞术法比较两种分离方法分离的靶细胞纯度;台盼蓝染色染色法和细胞培养后平板计数法检测免疫磁珠法分离的CD4+T细胞、CD8+T细胞的活力和生长情况.结果表明:补体细胞毒法分离后CD4+T细胞纯度、CD8+T细胞纯度分别为(76.0±2.8)%和(77.0±3.0)%,明显高于分离前的(34.6±3.7)%和(32.0±3.7)%(P＜0.05);免疫磁珠法分离后CD4+T细胞和CD8+T细胞纯度为(94.2±1.4)%和(93.8±3.0)%,显著高于补体细胞毒法(P＜0.05).磁珠分离法获得的CD4+T细胞、CD8+T细胞细胞活力分别为(96.0±2.4)%和(95.0±3.6)%;细胞计数法表明磁珠分离法获得的CD4+T细胞、CD8+T细胞对植物血凝素(PHA)的刺激保持了良好的增殖能力.结论:免疫磁珠法较补体细胞毒法分离效率高,不影响细胞的活力和增殖能力;正负筛选策略相结合的免疫磁珠法在同时获取高纯度的CD4+T细胞、CD8+T细胞时可获得满意效果,尤其适应于只有较少量血标本的情况,为进一步研究CD4+T细胞、CD8+T细胞的生物学特性创造了条件.
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大鼠肾小球内皮细胞分离培养和鉴定
一、材料和方法1.材料和试剂:(1)材料:SD大鼠1～2月龄,体重50～100 g,雌雄各半,由东南大学医学院实验动物中心提供.Mini MACS免疫磁珠细胞分选仪、磁性分离柱LS 购自Miltenyi Biotec公司.(2)试剂:Ⅳ型胶原酶、内皮细胞生长因子、胰蛋白酶及转铁蛋白均购自Sigma公司,DMEM培养基购自Gibco公司,异硫氰酸荧光素标记的抗CD34-FITC、抗波形蛋白及抗角蛋白均购自Santa Cruz公司,抗FITC免疫磁珠购自Miltenyi Biotec公司.
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金黄色葡萄球菌及SPA快速分离检验新技术的研究
免疫磁珠是一项免疫学技术,一般由载体磁珠和免疫配基结合而成.迄今,我国尚没有批量生产成为商品的高质量免疫磁珠.金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)是致病性金黄色葡萄球菌细胞表面一种特有的蛋白质,它具有与人IgG的Fc片段特异性结合的能力,每个SPA分子可以同时结合2个人IgG分子,因此,可用来建立一种致病性金黄色葡萄球菌快速分离检验的体系.
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免疫磁珠富集与免疫层析一体化检测甲型流感病毒的研究
目的：以偶联甲型流感病毒单克隆抗体的免疫磁珠作为示踪标记物，利用免疫磁珠的分离、富集特性，建立免疫磁珠富集与免疫层析一体化的甲型流感病毒检测方法。方法以 EDC/NHS方法制备了免疫磁珠，采用双抗体夹心法和免疫层析技术，建立甲型流感病毒的磁珠免疫层析直接检测方法，并进一步将磁珠免疫层析直接检测法与免疫磁珠分离技术相结合建立一种新型的免疫磁珠富集与免疫层析一体化检测技术。通过检测甲型流感病毒感染的患者和正常人的临床咽拭子样本，与常规的胶体金免疫层析法进行比较来评价一体化检测方法的特异性、灵敏度及阳性符合率等指标。结果磁珠免疫层析直接检测方法与胶体金免疫层析法在特异性、灵敏度上大致相同，一般可以检出荧光定量PCR检测Ct值≤22的甲型流感病毒阳性样本，而一体化检测方法可以检出Ct值≤28的阳性样本，灵敏度得到明显提升。结论建立了检测甲型流感病毒抗原的免疫磁珠富集与免疫层析一体化检测技术，适用于临床现场快速检测。
