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免疫磁珠分选和RT-PCR法检测胃癌患者外周血微转移
目的 分别建立免疫磁珠分离和RT-PCR技术检测胃癌患者外周血中微转移的情况,讨论两种检测方法的意义和差别以及微转移与临床病理的相关性.方法 首先采用密度梯度离心的方法分离出胃癌和慢性胃炎患者外周血中的单个核细胞,再分别采用RT-PCR和免疫磁珠技术检测其中的癌细胞.并行HE染色、免疫细胞化学和免疫荧光化学的方法对于获得的细胞进行检测分析.结果 60例胃癌患者有24例采用免疫磁珠分选技术分离到微转移的癌细胞,而RT-PCR法阳性者为32例.慢性胃炎患者的检测结果均为阴性.微转移的检出与胃癌组织的分化程度呈正相关.结论 胃癌患者的外周血中存在着微转移的癌细胞,采用免疫磁珠分离技术和RT-PCR的方法均可检测到微转移的癌细胞.RT-PCR法的敏感性高于免疫磁珠分离技术,更适合于临床应用.高分化的胃癌更易发生血行转移.
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流式细胞术纯化脐血嗜碱性粒细胞
目的 采用流式细胞术提纯脐血嗜碱性粒细胞,以期得到研究过敏性疾病发病机制的理想标本.方法 6份足月产妇新生儿脐血经沉淀红细胞及Ficoll-泛影葡胺处理后,采用流式细胞术分选CD203c-PE~+、CD45-PerCP~(int)的细胞.通过特异性识别嗜碱性粒细胞的阿利新蓝染色和细胞计数脐血嗜碱性粒细胞的纯度和回收率.结果 流式细胞术分选嗜碱性粒细胞所得的纯度为(95.02±2.94)V0,回收率为(61.42±5.95)%.结论 用流式细胞术分选脐血中CD203c-PE~+、CD45-PerCP~(int)的细胞可获得高纯度、高回收率的嗜碱性粒细胞.
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免疫磁珠分离脐血CD133阳性细胞的方法研究
目的探讨免疫磁珠分离脐血CD133阳性细胞的方法.方法6%羟乙基淀粉(HES)和Ficoll-Paque联合应用分离出脐血中单个核细胞,再用MACS CD133磁珠分离试剂盒分选其中的CD133+细胞.结果经MACS分离的脐血中CD133+细胞数平均为(6.3±2.9)×105/ml,占单个核细胞的(1.41±1.14)%,经流式细胞仪检测CD133+细胞纯度为75%～85%.结论免疫磁珠法是分离脐血CD133阳性细胞的较好的方法.
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联用密度梯度离心与免疫磁珠法分离纯化人表皮朗格汉斯细胞
目的:探讨获取较高纯度和活性的人表皮朗格汉斯细胞(LC)的实验方法.方法:联合采用密度梯度离心和免疫磁珠的方法分离纯化人表皮LC,将分选后的细胞用结合有异硫氰酸荧光素(FITC)的鼠抗人CD1a单抗标记,经流式细胞仪检测LC的纯化率,采用0.4%锥虫蓝染色检测细胞的活性.结果:分选所得LC纯化率为84.48%,锥虫蓝染色显示细胞活性＞95%.结论:联用密度梯度离心和免疫磁珠法,可获得较高纯度、有活性的LC细胞,且具有操作简单、易于无菌条件下分离纯化的优点.
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人牙周膜干细胞的成脂诱导实验研究
目的 体外分离培养成人的牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSC),并进行成脂诱导实验.方法 取新鲜拔除正畸牙的牙周膜为材料制成组织块,加入培养液分离培养,免疫磁珠法筛选人牙周膜干细胞,加入成脂诱导液诱导牙周膜干细胞向脂肪细胞转化.结果 成功筛选人牙周膜干细胞,成脂诱导成功.结论 免疫磁珠法是筛选人牙周膜干细胞的有效方法,人牙周膜干细胞可以向脂肪细胞分化.
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牛肉和牛奶中布氏杆菌免疫磁珠富集方法的建立
为建立牛肉和牛奶样品中布氏杆菌的免疫磁珠富集方法,采用布氏杆菌特异性抗体包被磁珠并优化包被条件,制备成免疫磁珠.对不同稀释梯度的布氏杆菌菌液用免疫磁珠富集,联合布氏杆菌选择性平板培养或荧光PCR,确定免疫磁珠的敏感性.同时,分别用免疫磁珠富集添加有其它细菌的布氏杆菌,富集后于选择性平板培养,统计目标菌落数并挑取可疑目标菌落用荧光PCR鉴定,确定免疫磁珠的特异性.此外,将该方法应用于人工模拟牛肉和牛奶样品中布氏杆菌的富集,进一步确定免疫磁珠的富集效果.结果表明:在lmL布氏杆菌菌液中,2 mg免疫磁珠富集联合选择性平板培养能检测≥2×103 CFU布氏杆菌,其敏感性高于免疫磁珠联合荧光PCR法.在其它细菌的高浓度背景下,免疫磁珠仍能够特异性地富集到布氏杆菌.此外,用该免疫磁珠富集方法可成功地富集到人工模拟牛肉和牛奶样品中的布氏杆菌.表明建立的免疫磁珠富集方法,可用于实际检测时牛肉和牛奶样品中布氏杆菌的富集,具有良好的应用前景.
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空肠弯曲菌免疫磁珠富集方法的建立
为建立空肠弯曲菌富集方法,研究利用空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体包被磁珠,制成免疫磁珠富集空肠弯曲菌.在不同稀释梯度的菌液中加入免疫磁珠,富集目标菌,铺于CFA显色平板培养,统计菌落个数,确定免疫磁珠的敏感性;在非空肠弯曲菌和弯曲菌中分别添加空肠弯曲菌,用免疫磁珠富集,确定免疫磁珠的特异性.结果表明2 mg免疫磁珠可以在1 mL空肠弯曲菌菌液(浓度为2.5×103/mL)中稳定富集到空肠弯曲菌,统计菌落数为100～300 CFU,具有较好的敏感性;在干扰菌中富集空肠弯曲菌,铺板培养后,荧光PCR鉴定为阳性,富集不受干扰菌影响.用建立的免疫磁珠富集方法富集采集样品中的空肠弯曲菌,结果显示该方法有较好的特异性,具有较好的应用前景.
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纳米免疫磁珠联合RT-nest-PCR法检测胰腺癌外周血微转移的敏感度及特异性
目的: 通过胰腺癌外周血微转移模型,探讨纳米免疫磁珠联合RT-nest-PCR检测微转移的敏感度及特异性.方法: 将胰腺癌细胞PANC-1稀释分别加入到正常人外周血单核细胞中,再按比例加入Fcλ非特异性受体阻断剂以及上皮细胞EP-CAM抗体,4 ℃下混匀孵育30 min,经分选柱阳性分选后提取RNA,RT-nest-PCR法检测肿瘤基因人端粒酶亚单位(h-TERT)和癌胚抗原(CEA).结果: 联合纳米免疫磁珠和RT-nest-PCR,平均1×107外周血单核细胞可以检测到1个肿瘤细胞.10例良性疾病对照组均未见表达.结论: 免疫磁珠联合RT-nest-PCR是敏感度及特异性都较高的检测微转移的方法,可显著提高肿瘤微转移的早期检测率.
关键词： 胰腺癌 微转移 免疫磁珠 逆转录巢式聚合酶链反应 -
白色念珠菌烯醇化酶免疫磁珠定量检测方法的建立
目的：侵袭性念珠菌病临床致死率较高，而白色念珠菌为常见致病菌。建立定量检测白色念珠菌烯醇化酶（enolase， Eno）的免疫磁珠方法，提高侵袭性念珠菌感染的实验室诊断水平。方法将白色念珠菌Eno单抗耦联至磁性微珠上，以辣根过氧化物酶标记羊抗Eno作为检测抗体，利用重组白色念珠菌Eno蛋白作为标准品评价该方法的精密度、特异性、线性范围、低检测下限等性能指标。用建立的免疫磁珠方法检测不同真菌培养上清中Eno水平。结果 Eno浓度为25 ng/mL和5 ng/mL时，批内和批间精密度分别为4．54％、5．87％和5．26％、8．82％。低检出下限为0．5 ng/mL，线性范围为0．5～50 ng/mL。白色念珠菌37℃培养24 h的上清中Eno含量为3．89 ng/mL，培养120 h的Eno水平上升至37．89 ng/mL，Eno水平与白色念珠菌菌丝含量呈正相关。该方法与近平滑念珠菌有微弱交叉反应，与热带念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新型隐球菌和酿酒酵母均无交叉反应。结论成功建立了定量检测白色念珠菌Eno的免疫磁珠法，与前期建立的定性ELISA相比，免疫磁珠法更为简便、准确、敏感，在侵袭性念珠菌感染研究中具有潜在的应用价值。
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联用免疫磁珠及定量RT-PCR检测胃癌外周血微转移
目的探讨联用免疫磁珠和定量RT-PCR检测胃癌患者外周血微转移的方法学及意义.方法首先将人胃癌MGC-803细胞以不同浓度加人到健康人外周血中,其次用淋巴细胞分离液收集单核细胞,然后等分成4份分别用4种方法处理--直接扩增(A方法)、阴性磁珠筛选(B方法)、阳性磁珠筛选(C方法)及联用阴性和阳性磁珠筛选(D方法),后用定量RT-PCR检测β2 微球蛋白mRNA和癌胚抗原(CEA)mRNA并计算出相对CEA.mRNA值.同法测定41例胃癌、10例良性胃病患者和5例健康人外周血CEA mRNA.结果参照模型中D方法测出的相对CEA mRNA值均小于A、B和C方法测出的,其检测灵敏度为每ml血含有1个癌细胞.41例胃癌患者中用A、B、C和D方法测出的阳性例数分别为19例(46.34%)、23例(56.10%)、22例(53.66%)和27例(65.85%);D方法与A方法比较,P＜0.05.D方法检测10例良性胃病均为阴性,而用其它3种方法检测有1例阳性;5例健康人均未见扩增.结论联合使用免疫磁珠阴性、阳性筛选和定量RT-PCR可提高胃癌患者外周血微转移的检出率.
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系统性红斑狼疮患者外周血B淋巴细胞中狼疮活动相关miRNA的筛选
目的:通过筛选系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血B淋巴细胞中与狼疮活动相关的microRNA(miRNA),探讨B淋巴细胞参与SLE发病的机制.方法:选取45例重度活动期SLE患者作为研究对象,另选20例稳定期SLE患者和10例健康体检者分别作为对照,采集外周静脉血,用磁珠阴性分选法分离B淋巴细胞并提取RNA,将每组单个样本RNA混成组总RNA,进行组间芯片分析.实时荧光定量PCR (Realtime PCR)验证miRNA芯片检测结果.结果:重度活动期SLE患者外周血B淋巴细胞中有16条差异表达的miRNA,其中下调10条,上调6条.Realtime PCR对其中2条(miR-181a、miR-103)miRNA的验证结果与芯片检测所示具有较好的一致性.结论:SLE患者病情活动性与B淋巴细胞中miRNA异常表达密切相关.
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免疫磁珠及尼龙毛分离纯化T淋巴细胞的比较研究
目的:探讨免疫磁珠及尼龙毛分离纯化外周血T淋巴细胞的方法及其特点.方法:用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,再分别以尼龙毛和免疫磁珠分离出T细胞,然后使用流式细胞仪鉴定细胞纯度、回收率,以台盼蓝检测细胞活力,MTT法检测细胞增殖性能.结果:免疫磁珠方法分离后T细胞的纯度显著高于尼龙毛分离方法(P＜0.05),而且回收率也大于尼龙毛分离方法(P＜0.001),但二种方法分离的T细胞在细胞活力和增殖性能方面比较差异无显著性(P＞0.05).结论:在细胞生物学研究中,免疫磁珠分离法是有效分纯T细胞的较佳方法.
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免疫磁珠分选法原代培养小鼠肺微血管内皮细胞
目的：探讨一种高效、稳定的小鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）原代培养方法。方法：选取45只1周龄Balb/c小鼠，随机分成3组，分别用酶消化法、组织贴块法、免疫磁珠分选法3种方法分离培养小鼠PMVECs，观察细胞形态学以及VIII因子相关抗原免疫荧光染色鉴定内皮细胞，计算各组原代培养成功率及从原代培养开始到首次传代所需时间，测定细胞纯度，MTT法绘制生长曲线。结果：3组原代培养的细胞在倒置显微镜下均能见到短梭形、多边形的微血管内皮细胞，血管内皮细胞特异性标志物VIII因子相关抗原表达阳性。免疫磁珠分选法组原代培养成功率及细胞活性显著高于其他2组，差异有统计学意义（P＜0.01），从原代培养至首次传代所需的时间短于组织贴块法组，差异有统计学意义（P＜0.05），细胞纯度显著高于酶消化法组，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：相比于酶消化法与组织贴块法，免疫磁珠分选法原代培养小鼠PMVECs具有重复性好，分离速度快，细胞纯度高及活性好的优点。
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免疫磁珠联合定量RT-PCR检测胃癌外周血微转移的临床意义
目的研究免疫磁珠联合定量RT-PCR检测胃癌患者外周血微转移的临床意义.方法提取41例胃癌患者外周血有核细胞RNA,先后加入抗人CD45免疫磁珠和抗人Ber-EP4免疫磁珠,再用定量RT-PCR检测癌胚抗原(CEA)mRNA和β 2微球蛋白(MG)mRNA,计算出相对CEA mRNA值(CEA mRNA/β2MG mR-NA).比较CEA mRNA的检出与患者性别、年龄、病变部位、组织学类型、pTNM分期、淋巴转移以及肝转移的关系.结果良性对照组与正常对照组均未见扩增;41例胃癌患者中有27例CEA mRNA阳性,其中贲门3例/6例,胃体10例/16例,胃窦14例/19例;腺癌19例/26例,粘液腺癌2例/7例,低分化癌6例/8例;Ⅰ期2例/7例,Ⅱ期5例/8例,Ⅲ期7例/10例,Ⅳ期13例/16例;淋巴转移19例/29例,肝转移8例/8例.结论正常人外周血中无CEA mRNA的表达;早期胃癌外周血可检测到CEA mRNA;CEA mRNA表达的差别在不同pTNM分期、组织学类型、有无肝转移时有显著性意义,与性别、年龄、肿瘤部位、淋巴转移的关系无显著性意义.
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免疫磁珠技术在结直肠癌腹腔内脱落癌细胞检测中的应用
目的 探讨免疫磁珠(IMB)检测方法用于结直肠癌腹腔内脱落癌细胞的检测价值.方法 收集80例结直肠癌患者术中的腹腔冲洗液,分别进行IMB及常规腹腔冲洗液细胞学检查(PLC),检测腹腔内脱落癌细胞,并以10例妇产科子宫肌瘤手术患者腹腔冲洗液标本作为对照组.结果 PLC检测阳性率为8.8％(7/80),IMB检测阳性率为28.8％(23/80),PLC检测阳性的病例,IMB均为阳性.IMB检出率明显高于PLC(x2=10.503,P=0.001).对照组两种方法检测均为阴性结果.结论 IMB对于结直肠癌腹腔脱落癌细胞检出率较PLC有较大提高,为腹腔癌细胞微转移的发现提供了一个切实可行的有效途径.
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河南豫东地区产志贺样毒素E.coli O157:H7感染病例的流行病学调查研究
[目的]探讨河南省局部地区腹泻病人感染及携带大肠杆菌O157:H7的情况,观察带菌时间及预后.[方法]采用流行病学监测方法发现病人,通过病人粪便mEC肉汤增菌14 h、胶体金免疫卡筛选、免疫磁珠法集菌、CHROMAGAR-O157:H7显色培养基分离、rfbO157、rfbO111、hlyA、stx1、stx2、eaeA引物PCR扩增方法进行毒力因子测定等方法,观察、研究感染病人的发病和预后.[结果]从1 303份腹泻病人中共分离出的38株O157:H7菌株,检出率2.9%,PCR rfbO157扩增均为阳性.其中2株具有stx2、hlyA和eaeA毒力基因,36株为O157:H7不产毒株.[结论]我省首次从病人中分离出O157:H7产毒株,病人发病后可于第3～8 d内检出病原体.
关键词： E.coli O157:H7 免疫磁珠 毒力基因 -
免疫磁珠荧光量子点技术检测结核分枝杆菌
目的 筛选结核分枝杆菌(MTB)免疫磁珠荧光量子点检测方法的佳配体组合.方法 将本室筛选获得的MTB结合肽H8和商业化抗MTB多克隆抗体(Pab)与纳米磁珠偶联,多肽H8、商业化抗MTB单克隆抗体(Mab)和抗热休克蛋白65单克隆抗体(Mabc)与荧光量子点偶联,分别获得2种免疫磁珠和三种功能化荧光量子点,两两组合用于MTB检测,通过显微镜下观察荧光信号以及激光诱导荧光仪测量荧光值,判断不同配体组合与MTB的亲和性及特异性,获得佳组合及其检测下限.结果 偶联Mabc的荧光量子点与免疫磁珠MNP-Pab组合检测MTB结果为阴性,其余5组均为阳性.测量荧光值,检测效果较好的两组组合分别是MNP-Pab+QD-H8和MNP-H8+QD-H8,阳性荧光值与阴性对照组比值分别是4.394和3.956,检测下限均是102条菌/mL.6组组合与12种非结核分枝杆菌(NTM)的亲和性各异,而与3种非分枝杆菌均不结合.结论 MNP-Pab+QD-H8和MNP-H8+QD-H8 两组检测效果较好,与MTB亲和性较高,特异性较好,可作为MTB免疫磁珠荧光量子点检测技术的佳配体组合.
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布氏杆菌表面特异性多表位抗原的串联表达与免疫磁珠的初步建立
目的 为获得布氏杆菌表面多表位抗原的特异性抗体,用于布氏杆菌免疫磁珠的构建.方法 从布氏杆菌3个表面蛋白中分析到特异性抗原表位,人工合成其串联基因片段并插入原核表达载体,转化至E.coli BL21(DE3),获得重组质粒pET-32a(+)-CJMEA-A,IPTG诱导后表达出30 kDa的重组蛋白,亲和层析纯化后将其进行Western blot分析、间接ELISA鉴定和兔免疫试验,制备的抗血清经亲和层析纯化后,包被成免疫磁珠并用于布氏杆菌富集.结果 表达的重组蛋白能与牛抗布氏杆菌血清反应,其抗血清与布氏杆菌发生良好反应,纯化抗体包被的免疫磁珠能特异性吸附布氏杆菌.结论 获得的布氏杆菌特异性抗体和免疫磁珠具有良好的应用前景.
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应用密度梯度离心结合免疫磁珠法富集孕妇外周血中胎儿NRBC的实验研究
目的 研究利用不连续密度梯度离心结合免疫磁珠方法,分选孕妇外周血中的胎儿有核红细胞(NRBC).方法 采集21名孕周在12-28周的孕妇外周血10ml,经不连续密度梯度离心后,再用免疫磁珠法分选和富集胎儿NRBC,同时对富集前后的孕妇外周血进行瑞氏染色和胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,HbF)特异性抗体标记、识别.结果 未经分选、富集,21名孕妇外周血有核细胞层涂片经瑞氏染色检查均未发现NRBC;梯度离心富集后21名孕妇中有11例外周血有核细胞涂片找到1～8个NRBC;再经免疫磁珠分离后有12例涂片发现1～7个NRBC,同时进行HbF特异性抗体标记,证实其NRBC阳性涂片中均存在胎源性NRBC.结论 本研究初步建立了分选、富集胎儿NRBC的实验方法,通过进一步的方法学改进,有望用于产前基因筛查的研究.
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人前列腺干细胞的分离培养
目的探讨人前列腺干细胞的分离方法并初步鉴定其特性.方法以器官捐献者的正常前列腺为研究对象,利用免疫磁珠细胞分离和胶原快速粘附方法,从前列腺基底细胞中分离前列腺干细胞,研究其克隆形成和分化特性.结果从正常人前列腺内分离得到的细胞,能快速粘附胶原,克隆形成率明显高于未粘附的前列腺基底细胞,而且形成的克隆维持时间较长.结论人前列腺基底细胞中存在极少量的具有高度增殖能力的一群细胞,它们具有干细胞的特征,但有待于进一步研究鉴定.
