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苯并(a)芘对HELF细胞S期细胞周期相关蛋白的作用
目的 观察由于苯并(a)芘(BaP)作用阻滞于S期的人胚肺成纤维细胞(HELF)的细胞周期蛋白和关卡蛋白表达水平的改变,探讨BaP影响细胞周期的作用机制.方法 5μmol/L BaP处理4h,于处理后24 h收获细胞,利用流式细胞术对BaP作用后的G0/G1期和S期细胞进行分选,Western blot方法分析相关蛋白表达水平的变化.结果 BaP作用HELF后,在总细胞群中和分选获得的S期细胞中均发现Chk1磷酸化水平升高,Cde25A的表达水平降低;只在分选获得的S期细胞中,发现CyclinE表达水平降低,CDK2和p53的表达水平升高.结论 BaP通过启动Chk1-Cdc25A和p53两条信号转导通路共同作用于CyclinE/CDK2,从而引发HELF细胞发生S期阻滞.
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苯并芘处理HELF阻滞于S期细胞的蛋白质差异表达谱
目的 观察由于苯并芘(BaP)作用而阻滞于细胞周期特定时相的人胚肺成纤维细胞的蛋白表达改变,探讨苯并芘引起的细胞应激和致癌机制.方法 利用流式细胞术对苯并芘作用后的细胞进行分析和分选,采用双向凝胶电泳与相应软件分析苯并芘处理后细胞内蛋白质的表达谱,MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight)质谱结合数据库检索鉴定差异表达的蛋白斑点.结果 细胞经5 μmol/L苯并芘处理后明显阻滞于S期,该时相细胞蛋白质表达的改变,主要包括热休克蛋白HSP70、HSP27,超氧化物歧化酶SOD[Mn],不均一核糖核蛋白H,翻译调控肿瘤蛋白,类肌钙蛋白,α-肌球蛋白,肌动蛋白结合蛋白和纽蛋白等参与氧化应激和肿瘤发生有关的蛋白.结论 这些表达改变的蛋白与苯并芘引发的细胞应激和细胞S周期阻滞有关,进一步研究可有助于阐明苯并芘的致癌机理.
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流式细胞仪细胞分选参数调校方法的研究
目的：探讨 BD FACSAria Ⅲ流式细胞仪进行细胞分选实验快速调校佳仪器运行参数的方法。方法以稀释的 CS&T 质控微球和 Accudrop 液滴延迟测定微球为实验材料，依次使用4种不同大小型号的喷嘴，在相应的鞘液压力下调校主液流和侧液流，测定液滴延迟时间。结果确定了仪器佳分选调校参数，使用70μm，85μm，100μm，130μm 喷嘴测定出的液滴延迟参数分别为47.00、30.00、27.00、16.00。结论按照佳分选调校参数参考值设定仪器，而后根据主侧液流形态和液滴延迟左框进框亮度进行微调，是实现 BD FACSAria Ⅲ流式细胞仪分选条件快速优化的关键。
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免疫磁性分选系统大量分选CD34+细胞的实验研究
CD34+细胞的分离纯化在自体外周血干细胞、异基因骨髓移植/外周血干细胞移植及干细胞研究中具有重要的应用价值.为了摸索大量分选CD34+细胞的方法,本研究应用Isolex300i磁性分选系统富集CD34+细胞,采用流式细胞术监测分选前后细胞表面标志,经CD34+细胞体外增殖实验及克隆形成实验验证分选获得的CD34+细胞生物学活性.结果显示,所完成的5例次自体外周血富集CD34+细胞时,先收获单个核细胞约(3.5-6.0)×1010,CD34+细胞占单个核细胞百分率为(0.55-1.2)%;收获的CD34+阳性细胞总数为(2-3)×108,纯度为(75-85)%,回收率为(40-65)%.体外实验表明,在SCF+IL-3+FL+TPO+EPO存在下,经过3-4天培养,可扩增2-3倍;经CFU-GM、BFU-E集落形成实验显示具有形成集落的能力,证实分选后细胞具有造血祖细胞生物活性.结论:应用Isolex300iCD34+细胞分选仪可以高效大量富集CD34+细胞,适于临床应用.
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应用组合抗体结合磁珠个体化分选调节性T细胞
调节性T细胞的分选和体外扩增是制约其临床治疗的瓶颈问题.目前广泛使用的商品化调节性T细胞分选试剂盒价格昂贵,无法针对不同生物品系进行个体化的调整,造成分选效果不稳定;本研究建立的个体化分选方法 基于相同原理,调整抗体用量和实验步骤,大大地节约了实验成本,并且可以针对不同生物品系,选配不同的抗体和调整抗体用量,以达到佳的分选效果.采用鸡尾酒分步分选方法 :先用不同抗体组合磁珠去除非目的 细胞来预富集CD4+T细胞,然后从富集的CD4+T细胞中阳性分选出CD25+细胞.
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自体外周血干细胞移植纠正选择性IgA缺乏症
选择性IgA缺乏症(SIgAD)是原发性免疫缺陷病中常见的类型,约占60%以上,其患者分泌性IgA减少,血清中的IgA浓度低于0.05g/L,同时其他类型的免疫球蛋白的含量通常是在正常范围.2001年6月我们对1例难治性系统性红斑狼疮合并选择性IgA缺乏症患者行自体外周血干细胞移植(APBSCT)并进行CD34+细胞分选治疗,现已随访24个月,患者除SLE的相关症状获得满意缓解、实验室检查指标恢复正常外,意外的发现其血清IgA水平也逐渐恢复至接近正常的水平(见表1).
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固定的人白细胞分化抗原45单克隆抗体在人白细胞捕获效率研究中的佳试验因素分析
固定化抗体与相应细胞表面抗原结合常用于造血干细胞分选,白血病免疫分型,及磁性微球在血液病中的应用等.但均不能满足高通量分析与研究的要求.我们已用蛋白质微阵列技术研究多克隆抗体检测RBC的价值[1],但鲜见固定单克隆抗体检测WBC的研究报道.人白细胞分化抗原(CD)45为WBC表面共同抗原,我们通过观察固定CD45单克隆抗体与WBC结合效果,找出佳试验条件,为WBC检测及分型的蛋白质微阵列芯片研制和应用奠定基础.
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胚胎成纤维细胞和Ⅳ型胶原黏附分选表皮干细胞的比较研究
目的 比较以Ⅳ型胶原和胚胎成纤维细胞黏附分选表皮干细胞的效率,探索从皮肤中快速表皮干细胞分选的有效方法.方法 使用DispaseⅡ和CollagenaseⅠ混合酶、胰酶分步消化皮肤得到的细胞悬液,实验组用胚胎成纤维细胞,对照组使用Ⅳ型胶原,分别作为黏附基质,在细胞培养板中对表皮干细胞进行黏附筛选,培养5 d后统计各组表皮干细胞克隆形成数量,评价筛选效率.结果 经抗β-整合素单抗和抗角蛋白K19单抗免疫细胞染色确证形成克隆的细胞是表皮干细胞,在两个细胞密度水平,实验组和对照组培养出的表皮干细胞克隆数量差异无统计学意义(P>0.05).结论 使用成纤维细胞分选表皮干细胞与使用Ⅳ型胶原方法分选效率相当,成纤维细胞条件培养液对黏附效率没有影响,但能促进表皮干细胞生长.
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表面黏附分子 CD133在子宫内膜癌干细胞研究中的进展
1994年,Lapidot等[1]首次提出了肿瘤干细胞理论,开创了肿瘤干细胞研究的先河.研究表明,肿瘤干细胞可以来自于发生突变的成体干细胞、高度受限的祖细胞、甚至已经发生分化的细胞[2].肿瘤干细胞是一种广泛存在于肿瘤组织中,含量极少,具有自我更新、多向分化、体内致瘤能力,并且与肿瘤的转移、复发及治疗耐受有着密切关系的细胞群[3-6].随着肿瘤干细胞研究的逐渐深入,肿瘤干细胞表面标志物的确立成为实现肿瘤干细胞分选和鉴定的首要任务.
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流式细胞术在药物滥用研究中的应用
流式细胞术(flow cytometer,FCM)是70年代发展起来的一种对细胞、细胞器和生物大分子进行快速多参量分析的细胞定量分析技术.商品化的流式细胞仪从80年代初引进国内.其工作原理是:经荧光色素染色的细胞或其他生物微粒包裹在鞘液里,从内径50-100μm的喷嘴(本中心的FACS为美国BD公司产品,喷嘴为70 μm)逐个高速喷出,通过一个光源,进而通过各种光敏元件测量这些细胞或微粒所发射的散射光及荧光,经计算机分析和处理可得到多种信息参数.由于该仪器的多参数性、准确性、快速性和高纯度的分选性等特点,及近年多种单抗和荧光探针的开发,为流式细胞术的应用提供了更为有利的条件.特别是以荧光素标记的细胞标志分子(包括细胞表面CD分子,受体及其配基,离子及细胞内成分)经荧光探测器测定荧光后进行的定量分析,在免疫学、血液学、肿瘤学、临床检验学和基础科学如细胞凋亡、细胞抗药性、癌和抗癌基因、钙离子测量、细胞分选等及防治AIDS病研究方面都有成熟的应用.
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外周血T淋巴细胞纯化方法的研究
目的 建立健康成人外周血T淋巴细胞分选纯化的方法,并对分选结果进行纯度鉴定.方法 对10例健康成人外周血T淋巴细胞进行荧光抗体标记,采用流式细胞仪进行分选及纯度鉴定.结果 流式细胞仪分选T淋巴细胞纯度为(94.40±3.3)%,高纯度达98%,回收率约为95%.结论 应用流式细胞术,可从外周血中快速分选出高纯度的CD3+T淋巴细胞.
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组合多峰标准品在空气激发型流式细胞仪信号校准中的应用
目的 为提高流式检测信号的精确程度,研究快速、准确手动校准库尔特MofloTMXDP分选仪多激光信号的方法 .方法 分别采用单峰标准微球分步校准方法和组合多峰微球同步校准方法,进行仪器校准,比较两种不同的校准策略下得到的小鼠骨髓侧群细胞检测结果 .结果 组合多峰微球校准后检测结果优于单峰微球校准后结果.结论 为了准确的检测和分选,需要同时校准仪器的各项参数,复杂标准品的校准精确度优于简单标准品.
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原代SD大鼠CD4+T细胞的分离纯化及鉴定
目的:建立一种获得高质量、数量多的原代CD4+T细胞的有效可靠的方法.方法:依次采用密度梯度离心(procell density Centrifugation)和免疫磁珠分选法从SD大鼠新鲜脾脏中分选出CD4+T细胞,CD4+T细胞生长状况及特点采用倒置相差显微镜观察、提取细胞的纯度以流式细胞术鉴定.结果:流式细胞术鉴别CD4+T细胞纯度为96％,其中(CD4+T+CD62 L双标)初始CD4+T细胞纯度为60.7％,与密度梯度离心收集的单核细胞(CD4+T细胞纯度为0.2％)比较,差异均有统计学意义(P<0.01).通过形态学观察从原代SD大鼠脾脏中分离的CD4+T细胞,表现为透明圆颗粒状悬浮生长,48h内活性高.结论:采用密度梯度离心分离,免疫磁珠分选纯化原代大鼠初始CD4+T细胞具有数量多、活性好、纯度高、生物学特性稳定的优点,可用于相关研究.
关键词： 原代初始CD4+T细胞 CD4+T细胞 细胞分选 密度梯度离心 免疫磁珠分选纯化 -
以α6-integrin和c-kit为特异性表面标志分离筛选小鼠精原干细胞的可行性
背景:从目前文献报道来看,精原干细胞分离效率较高且较为公认的方法是通过隐睾模型结合表面标志进行多参数筛选.目的:探讨06-integrin和c-kil作为分离筛选精原干细胞特异性表面标志的可行性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-05/12在武汉大学人民医院完成.材料:6周龄雄性昆明白小鼠40只,随机分为隐睾组、正常对照组,20只/组.方法:隐睾组小鼠建立隐睾模型,麻醉后腹部正中切口,将两侧睾丸拉入腹腔,将脂肪垫靠近附睾处各缝一针,分别固定在侧腹壁.正常对照组小鼠不进行任何干预.造模后两三个月,采用传统的两步消化法获取生精上皮单细胞悬液,加入FITC标记的抗α6-integrin抗体和PE标记的抗c-kit抗体,利用流式细胞仪进行α6-integrin+和c-kit双重筛选,锥虫蓝染色监测细胞活性.主要观察指标:隐睾的形态学变化,精原干细胞分选结果.结果:隐睾小鼠的生精小管内细胞排列紊乱,层次及管腔消失,小管中央可见分裂相细胞,细胞数明显减少.与正常对照组比较,隐睾组side scatter(low)、Forward scatter(hi)区的睾丸细胞增多,图形向左上移位.α6-integrin+和c-kit-细胞分布存在明显的相互偏离,即α6-integrin+细胞绝大多数不是精原干细胞,c-kit-细胞绝大多数也不是精原干细胞.从隐睾组筛选出具有sidescatter(low)、α6-integrin+、c-kit-特征的细胞数占睾丸细胞总数的2.8%,此即为精原干细胞,锥虫蓝监测结果显示细胞活性达95%以上.结论:采用α6-integrin和c-kit这两种表面标志进行精原干细胞的筛选,尽管可以提高细胞悬液中的精原干细胞纯度,但均缺乏特异性.
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自然沉降速度法分选骨髓间充质干细胞
背景:在前期研究低渗结合自然沉降分选兔骨髓间充质干细胞的基础上,以工程学关于颗粒流体力学为指导,求出兔骨髓间充质干细胞在培养液中的沉降速度.通过自然沉降速度法分选及鉴定细胞,建立一个简单易行的分离、纯化、增殖间充质干细胞的方法.目的:探讨自然沉降法分选骨髓间充质干细胞的可行性.方法:梯度密度离心法确定兔骨髓间充质干细胞的密度区间(ρ1),扫描电镜测量出兔骨髓间充质干细胞的直径(d),液体密度计测算出培养液的密度(ρ2),黏度计测算出培养液的黏度(μ),选择合适的公式计算出骨髓间充质干细胞的沉降速度(Vt).以此沉降速度从兔的骨髓细胞中分选兔骨髓间充质干细胞,体外培养并观察其增殖能力、细胞纯度、细胞分化潜能,同时测定兔骨髓间充质干细胞克隆集落形成率,记录原代培养时间.结果与结论:①通过电镜测量得出兔骨髓间充质干细胞的直径为(20.37±4.58)μm,进一步确定兔骨髓间充质干细胞在培养液中的沉降速度为50-55 mm/h.②通过自然速度沉降法可成功从兔骨髓组织中分选出骨髓间充质干细胞,分选出的骨髓间充质干细胞原代培养呈成纤维样集落生长,经诱导后具有成骨、成脂分化潜能.③与梯度密度离心法比较,自然速度沉降法分离出的间充质干细胞具有原代培养时间短,细胞集落形成率高的特点.④自然速度沉降法在间充质干细胞分选过程中不采取任何干预措施,也不添加任何分离介质,仅通过物理原理自然沉降,可能对细胞损伤小,使细胞原有的生物学特性得到保留.
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CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞活性与多药耐药的相关性
背景：肿瘤干细胞与肿瘤的复发、转移以及耐药等之间存在十分密切的联系。
目的：探讨CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞活性与多药耐药的相关性。
方法：运用免疫磁珠法从多药耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中分选出CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞。流式细胞仪测定分选后CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞亚群比例和细胞膜P-gp荧光强度，RT-PCR法检测多药耐药基因MDR mRNA表达水平。
结果与结论：①获得的CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞比例在90%以上；②CD44+CD24-/low细胞亚群成球比例明显强于 non-CD44+CD24-/low细胞亚群；③CD44+CD24-/low细胞亚群的细胞膜 P-gp 荧光强度显著高于MFC-7/ADR细胞株(P <0.05)；④CD44+CD24-/low细胞亚群的MDR mRNA表达水平显著高于MFC-7/ADR细胞株(P <0.05)；⑤结果表明，分选得到的CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞具有很强的体外成球能力，高表达P-gp蛋白和MDR mRNA可能是导致多药耐药的原因之一。 -
血清和糖皮质激素调节蛋白激酶3在乳腺癌干细胞中的表达
背景：新研究显示，血清和糖皮质激素调节蛋白激酶3可能与某些肿瘤的发生有着密切关系，且对白细胞介素3撤退所诱导的乳腺癌细胞凋亡具有保护作用。另据相关报道显示，血清和糖皮质激素调节蛋白激酶3可能参与调节细胞内Wnt信号通路。
目的：观察乳腺癌干细胞中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶3及β-Catenin蛋白的表达。
方法：采用双波段流式细胞分选仪从71例人乳腺癌组织中分选乳腺癌干细胞，并进行鉴定及传代培养，以30例正常乳腺组织作为对照。应用SP免疫法检测乳腺癌干细胞和正常乳腺组织中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶3、β-Catenin蛋白的表达。
结果与结论：乳腺癌干细胞中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶3、β-Catenin的表达均显著高于正常乳腺组织(P<0.01)。二者在乳腺癌干细胞中的表达呈正相关(r=0.318，P<0.05)。说明血清和糖皮质激素调节蛋白激酶3可能通过调控Wnt/β-Catenin信号通路，参与乳腺癌的发生发展过程。 -
免疫磁珠富集技术进展
免疫磁珠富集技术,是以磁性微球作为固相表面,结合免疫学方法建立起的一门具有重要应用前景的样品富集手段.具有磁性的微颗粒通过结合特定抗体,在液相中能特异性地与相应抗原结合,依靠磁场的作用力快速地使所需样品量得到大大的浓缩.由于免疫磁珠富集法具有快速及特异性强的特点,在三十余年的发展中,已广泛应用于分离及浓缩特定细胞、微生物、蛋白质和核酸片段等肉眼难以观察或样品中含量不高的物质.其应用也随着各个科学领域的发展而日趋全面和深入[1].随着抗体技术的发展,免疫磁珠富集技术已成为细胞分选和蛋白质组学研究的重要技术支持.除此,鉴于免疫磁珠富集法有助于降低原有检测手段的检测限,其应用于食品致病微生物和环境、食品中小分子毒害物的检测将大有发展前景.
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CD204阴性人脂肪来源细胞体外成软骨潜能的初步研究
目的 比较CD204+和CD204-两种人脂肪来源细胞的干细胞特性和体外诱导成软骨的能力.方法 分离培养人脂肪来源细胞并进行流式细胞分选,分别获得CD204+和CD204-两种细胞.将这两种细胞培养扩增至第2代,观察其形态学特点；成脂、成骨定向诱导分化,油红O染色、茜素红染色定性；同时将两种细胞进行pellet成软骨诱导分化,比较体外诱导成软骨的能力,并以HE、Safranin O和Ⅱ型胶原免疫组化染色等进行鉴定.结果 经流式细胞分选,脂肪来源细胞中CD204表达阳性率约为10％.分选后的CD204+和CD204-细胞均呈成纤维细胞样贴壁生长,但CD204-细胞具有更强的增殖能力.成脂诱导10d后,两组细胞油红O染色均可见胞浆内有大量红染脂滴,但 CD204+细胞具有更强的成脂潜能.成骨诱导2周后,两组细胞茜素红染色均可见钙结节红染,而CD204-细胞具有更强的成骨潜能.同时,细胞pellet成软骨诱导4周后,大体观可见CD204-细胞组pellet形成白色透明样软骨成分,而CD204+细胞组pellet外观微黄.HE和Ⅱ型胶原免疫组化染色均显示CD204-组pellet可见成熟软骨陷窝形成,SafraninO染色显示CD204-组软骨特异性细胞外基质沉积；而CD204+细胞组pellet则呈纤维化改变.结论 脂肪组织来源的CD204-细胞具有干细胞的生物学特点,且有良好的成软骨潜能,可以成为软骨组织工程良好的种子细胞来源.
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人真皮来源淋巴管内皮细胞的流式细胞仪分选和生物学特点
目的 用流式细胞仪分选培养人真皮来源淋巴管内皮细胞,研究其生物学特点.方法 采用中性蛋白酶及胶原酶消化包皮组织获得真皮细胞悬液,应用流式细胞仪检测和分选 Podoplanin+和 Podoplanin-/CD34+细胞,所获细胞进行体外培养.传代细胞进行免疫荧光及RT-PCR方法 检测LECs特异标志的表达,低密度脂蛋白吞噬、鼠尾胶原三维培养检测功能特点,MTT法及氚标记法测定细胞增殖周期和低氧条件对其增殖的影响.结果 人真皮细胞中CD31+,CD34+和 Podoplanin+细胞所占比例分别是6.0%,4.4%和1.4%.Podoplanin+和CD34+细胞在单层培养时形成内皮细胞典型的铺路石样外观,表达内皮细胞特异性标志CD31及吞噬Dil-Ac-LDL和三维培养微管形成功能.Podoplanin+细胞表达淋巴管内皮细胞特异性标志Prox-1,Ang2和VEGFR-3,和CD34+细胞间具有显著性差异.两组细胞生长曲线相似均于接种至培养板后的3～5d逐渐进入对数生长期,接种后的6～8d均进入停滞期.在缺氧环境下,氯化钴浓度为50μM和100 μM时刺激细胞增殖,当浓度大于200 μM细胞增殖明显受到抑制.结论 应用流式细胞仪可以富集人真皮来源淋巴管内皮细胞和血管内皮细胞,尽管两者表达特异性分子标志不同,其在三维培养和缺氧条件下生长特点相似.
