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三种精子质膜完整性检测方法的比较
目的 对6-羧基二乙酸荧光素/碘化丙啶(6-CFDA/PI)双荧光标记方法进行改良并应用于人精子质膜完整性的检测,并与单用伊红Y染色、低渗肿胀试验(HOS)两种检测方法进行比较. 方法 随机选择30例本所人类精子库志愿者精液标本(密度≥20×106/ml、活力(a+b)≥50%),分别采用单用伊红Y染色、HOS和6-CFDA/PI双荧光标记试验检测精子质膜完整性. 结果 30例精液标本伊红Y染色活精子比率、HOS肿胀精子数比率、6-CFDA/PI双荧光标记结果分别为(68.8±7.6)%、(68.7±7.8)%和(67.9±7.8)%,两两比较,无显著性差异(P均＞0.05),但双荧光标记能显示死活精子的过渡状态.相关性分析结果显示,三种方法检测的活精子比率均与前向运动(a+b)精子呈显著正相关. 结论 6-CFDA/PI双荧光标记检测方法与单用伊红染色、HOS两种常用检测精子质膜完整性方法具有一致性,同时能鉴定出精子过渡的中间状态.
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荧光金纳米团簇及其在生命分析中的应用
金纳米团簇（gold nanoclusters，AuNCs），一种新型的荧光纳米材料，是指在一定的分子层保护下，由几个到几百个金原子组成的相对稳定的分子级聚集体。由于其直径一般小于2 nm，接近于电子的费米波长，产生了类似分子的性质，如离散的电子态、尺寸依赖的荧光发光等。荧光金纳米团簇具有尺寸小、生物相容性好、光学稳定性好、Stokes位移大、发射光谱可调谐以及无毒等优点，弥补了传统的有机荧光染料、荧光蛋白、荧光量子点等荧光探针的一些缺点，近年来已经成为国际上的研究热点。本文结合当前的研究现状，重点阐述金纳米团簇的性质、制备方法及其在生物活性小分子检测和细胞标记成像中的应用。
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基于三色荧光探针的红花肾保护活性物质筛选研究
该研究采用3种荧光探针FDA,MTR,Hoechst 33342对盐酸阿霉素损伤的HK-2细胞进行标记,通过细胞荧光显微成像平台进行荧光图像采集及分析,建立了一种潜在的肾保护活性物质筛选方法.应用该方法对红花的53个化学组分进行筛选,发现C17,C18,C19 3个组分对盐酸阿霉素损伤的HK-2细胞具有较好的保护作用,运用液相色谱质谱联用(LC-MS)技术对其进行定性分析,初步推测出8个化合物,羟基红花黄色素A,6-羟基山柰酚-3-O-芸香糖-6-O-葡萄糖苷,6-羟基山柰酚-3,6-二-O-葡萄糖苷或6-羟基山柰酚-6,7-二-O-葡萄糖苷,6-羟基山柰酚-3-O-芸香糖苷,6-羟基山柰酚-3-O-葡萄糖苷或6-羟基山柰酚-7-O-葡萄糖苷,芦丁,异槲皮素和山柰酚-3-O-芸香糖苷.与对照品比对后确认其中4个化合物为异槲皮素、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷及羟基红花黄色素A,并对这4个化合物的肾细胞保护作用进行了验证,发现均具有一定的肾细胞保护作用,其中异槲皮素的保护作用强,且具有良好的量效关系.实验结果提示,异槲皮素、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷及羟基红花黄色素A可能是红花发挥肾保护作用的活性成分.
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一种基于荧光探针和HK-2细胞的中药肾毒性物质筛查方法及其应用
本研究采用荧光探针FDA标记HK-2细胞,创建了一种快速筛查肾毒性物质方法.方法学考察结果表明,所建的肾毒性体外评价模型线性度、稳定性和准确性均满足应用要求.将其用于《中国药典》收载的32种有毒中药的352个组分进行规模化普筛,发现巴豆等14种中药材的31个组分对HK-2细胞具有明显毒性,可能会引起肾毒性.其他18种中药的各组分对HK-2细胞未见明显毒性.
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快速膜乳化法制备荧光探针PLGA纳米粒及体内外研究
采用快速膜乳化法制备了粒径均一的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒,对其载药特性和体内分布进行研究.以平均粒径和PDI为指标,通过单因素实验考察了膜孔径、过膜次数、过膜压力、油水比和聚乙烯醇(PVA)浓度对快速膜乳化法制备纳米粒的影响,空白纳米粒的优化条件为膜孔径1μm,过膜压力1 150 kPa,油水比1∶5,PVA质量浓度20 g·L-1,过膜3次,得到空白纳米粒的平均粒径为332.6 nm,PDI为0.010.采用激光共聚焦技术对其结构特点进行模拟研究,在此基础之上,将荧光探针包载于纳米粒中,采用小动物活体成像技术研究纳米粒的体内靶向性.体外模拟研究表明,荧光物质均匀分布于微球内,体内研究表明该粒子具有较好的肝、脾靶向性.
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基于荧光探针的消渴安中DPP4抑制剂的筛选与鉴定
基于小分子荧光探针的中药活性成分筛选研究方兴未艾.该研究应用具有聚集诱导发光现象(AIE)的新型小分子荧光探针,对中成药消渴安中二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂进行筛选.采用系统分离法,从消渴安中分离和制备了43个化学组分;以抑二肽素A为阳性对照药,对消渴安的43个组分进行筛选,发现13个化学组分对DPP-4的活性具有抑制作用;采用LC-MS技术对这13个组分进行定性分析,鉴定推断出16个化合物.进一步对其中14个化合物进行验证,发现5个化合物对DPP-4具有较高的抑制作用,其中丹酚酸C、人参皂苷Rg5、知母皂苷AI在5～50 μmol·L-1呈良好的量效抑制关系.该研究为运用小分子荧光探针技术筛选发现中药药效物质提供了成功实例.
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激光扫描共聚焦显微技术在中医药研究中的应用
激光扫描共聚焦显微镜(Laster Scanning Confocal Microscopy, LSCM)是上世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品,是当今世界上先进的分子细胞生物学分析仪器之一.它是在普遍荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,并利用计算机的图象处理技术,使用紫外或可见激光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部细微结构的荧光图象.它采用了能达到高分辨率及重复性的无色差扫描技术,克服了普通偏轴镜扫描因色差造成的低分辨率的弱点,改进了定量采样时重复性差等缺点,从而不仅提高了光学成像的分辨率,而且能产生真正具有三维清晰度的图象,同时可在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值和膜电位等生理信号及细胞形态的实时动态变化,成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具(1).近几年来,激光扫描共聚焦显微技术这一先进的检测手段被引入中医药研究领域,并取得了有价值的研究成果,为中医药研究的现代化创造了条件.现将激光共聚焦显微镜技术在中医药研究中的应用情况汇总如下.
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稀土配合物荧光探针的合成
目的 研制可用于时间分辨荧光免疫分析中的稀土配合物荧光探针.方法 以6,6’-二溴二甲基-2,2’-联吡啶-4-甲酸甲酯和1,4,10,13-四氧-7,16-二氮环十八烷为反应原料,合成了Na+-6,6-(二氮杂-18-冠醚-6)-二胺甲基-2,2’-联吡啶-4-甲酸甲酯,并通过核磁氢谱、质谱等分析手段确认了化合物的结构.结果 对该化合物与Eu3+连接形成的稀土配合物荧光探针的荧光性质进行研究,结果表明其激发光谱波长范围较宽,大激发波长为363 nm,特征发射波长为583 nm与621 nm,归属于5D0-7Fj=1,2跃迁,Stokes位移为258 nm,荧光寿命为1456 μs.结论 该稀土配合物荧光探针符合时间分辨荧光分析技术所需要求,具有广泛的应用前景.
关键词： 时间分辨荧光免疫分析 稀土配合物 荧光探针 -
高温诱导ECV-304细胞凋亡及对其线粒体膜电位的影响
有文献报道高温诱导细胞凋亡有两个独特的模型: 慢死亡和快死亡.慢死亡是指细胞受热后,在失去再生能力之前能够维持生理活动几天.快死亡是指细胞受热后几天内发生的死亡,其特征是细胞脱离其培养表面.关于快死亡的机制可能与热诱导细胞凋亡有关[1].目前随着对凋亡机制研究的深入,已从细胞质膜转向线粒体.线粒体是促进能量转换、参与细胞凋亡的重要细胞器.由于细胞膜上各种生物泵的作用,使细胞膜内外维持着不同梯度的离子浓度,产生了线粒体膜电位.几乎所有诱导剂引起的各种类型的细胞凋亡均出现线粒体膜电位下降,提示线粒体膜电位下降为早期凋亡[2] .本文建立一种高温诱导ECV-304细胞凋亡的方法,并应用流式细胞仪采用AV-FITC/ PI 双染法和荧光探针JC-1 法,对高温诱导ECV-304细胞凋亡及对其线粒体膜电位的影响进行分析.
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高同型半胱氨酸诱导人成骨肉瘤MG63细胞损伤的机制
目的 探讨高同型半胱氨酸(HHcy)诱导人成骨肉瘤MG63细胞损伤的分子机制.方法 体外培养的人成骨肉瘤MG63细胞经不同浓度(0.001mol/L、0.003mol/L和0.005mol/L)的Hcy处理不同时间后,采用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸盐(H2DCFDA)探针在荧光分光光度计下检测细胞内活性氧(ROS)变化水平;通过Hoechst 33342/碘化丙啶(PI)核双染法在荧光显微镜下观察计数凋亡和坏死细胞;采用Western blotting法检测促凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的表达变化.结果在高浓度的Hcy刺激下,以剂量和时间依赖的方式上调MG63细胞内 ROS 含量(P<0.05);同时,凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的表达明显增加,从而诱导MG63细胞的死亡.结论 高浓度Hcy可通过增加MG63细胞内ROS的含量,上调凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的表达,导致MG63细胞的氧化损伤.
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17β-雌二醇对高同型半胱氨酸诱导人成骨肉瘤MG63细胞损伤的保护作用及机制
目的 探讨17β-雌二醇(17β-E2)对高同型半胱氨酸(HHcy)诱导人成骨肉瘤MG63细胞损伤的保护作用及其分子机制.方法 体外培养的人成骨肉瘤MG63细胞经17β-E2干预后,再以不同浓度和(或)不同时间的HHcy处理后,采用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸盐(H2DCFDA)探针检测细胞内活性氧(ROS)水平变化;通过Hoechst 33342/碘化丙啶(PI)核双染法观察计数凋亡和坏死细胞;采用免疫印迹法检测促凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的表达变化.结果 1.17β-E2可明显抑制HHcy诱导的MG63细胞内ROS的增加,抑制效果随剂量和时间而增强; 2.17β-E2可明显下调促凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的表达,对抗HHcy诱导的MG63细胞的凋亡和(或)坏死.结论 17β-E2可通过抑制ROS的产生,下调凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的表达而增强MG63细胞抗HHcy所诱导的氧化损伤作用.
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自然流产患者绒毛组织弓形虫感染的检测
自然流产(Spontaneous abortion)是妇产科的常见疾病,其发病机理与解剖、遗传、内分泌及感染因素有关,其中弓形虫感染是导致自然流产的重要原因[1].以往研究多通过对母亲的血清学检查来推断胚胎可能感染弓形虫而引起流产.该研究采用PCR结合荧光探针的体外DNA扩增和检测技术,检测流产患者绒毛组织中是否存在弓形虫,直接了解胚胎弓形虫感染情况.
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共聚焦激光扫描显微镜技术及相关荧光探针在细胞器研究中的应用
共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)是上世纪80年代发展起来的先进的分子细胞生物学分析仪器.它在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,把光学成像的分辨率提高了30%～40%,是光学显微镜发展史上的重大突破.它通过其独特的成像原理和技术[1],使用紫外线或可见光激发荧光探针,不仅可观察固定的细胞、组织切片,还可以对活细胞的结构、分子、离子等进行实时动态观察和检测,在亚细胞水平上观察诸如Ca2+,pH值,膜电位等生理信号及细胞形态的变化,成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具[2].
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HER2-CdTe/ZnSe核壳量子点荧光探针的制备及其识别性能
近年来量子点(QDs)荧光免疫组织化学(QDs-IHC)技术引起了人们的关注[1-5].有学者利用QDs-IHC技术检测乳腺癌组织中的HER2状态,发现其检测灵敏度高于免疫组织化学,尤其能准确判断2+的样本,这对乳腺癌患者的治疗非常有意义[6-7].QDs是一种由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素组成的大小在1～100 nm之间稳定的微小晶粒,其电子和空穴被量子限域,连续能带变成具有分子特性的分立能级结构,受激后可发射荧光[8].
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鼻咽癌转移机制与LMP-1关联性的光学表征
中国的东南部是全球鼻咽癌高发区域之一,对鼻咽癌转移机制的研究存在强烈的需求.凭借可视化光子技术研究鼻咽癌转移机制与LMP-1癌蛋白的关联性,探索早期预测癌转移的潜在可能并进行调控干预,提高患者的生存率,具有医学理论意义和临床应用价值.本文综述了近年来相关研究的发展趋势,特别是高分辨光学成像技术与荧光相关光谱技术的新进展.展望了以鼻咽癌细胞调控的LMP-1为特异性靶标,结合高灵敏度分子荧光探针技术,获取癌细胞脂筏微区的高分辨光学成像和LMP-1动态聚集特性的光学表征,达到可视化且半定量地预测鼻咽癌转移的倾向,为有效地提高鼻咽癌患者治愈率提供新思路和理论支持.
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量子点荧光探针在生物医学研究中的应用进展
20世纪末,随着纳米科技的进步,诞生了一类新型荧光探针-量子点.与传统有机荧光探针相比表现出独特而优良的发光特性,在不到10 a的时间里,这类探针在科学研究中得到了迅速的应用.本文对量子点荧光探针在生物医学中的应用及进展进行简要的综述.
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实时荧光PCR研究新进展
实时荧光PCR技术自问世以来,以其高特异性,高灵敏性,可定量,无污染,而得到了广泛的应用.该技术是根据荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理,设计相应的荧光标记核酸探针,通过PCR反应对相应靶DNA进行均相定性定量测定的技术.根据检测中所使用的荧光探针分类,目前已经开发出TaqMan,Molecular Beacon,Scorpion,LightCycler,Single-labeled probe,ResonSense,Angler以及双链探针等相关技术.本文对该技术的研究进展作一综述.
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荧光探针法研究阳离子多聚物基因载体Polybrene与DNA的相互作用
目的:用荧光探针法研究海美溴铵(PB)和DNA之间的相互作用.方法:将一定量的PB溶液逐渐加入到DNA/溴化乙锭(EB)复合物的水溶液中,在535 nm处激发,测定595 nm的荧光强度,观察体系荧光强度随PB浓度变化而发生的改变.用同样的方法观察PB对Hoe-DNA和4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)-DNA体系荧光强度的影响,Hoe的激发和发射波长分别设置为350 nm和460 nm,DAPI为340 nm和450 nm.通过荧光Scatchard分析法获得PB对DNA的结合常数.结果:随着PB浓度的增加,EB与DNA的结合减弱.通过对PB存在下EB-DNA体系的荧光分析,获得了PB与DNA之间的结合常数为1.8×10./mol.PB的加入大大提高了Hoe-DNA体系的荧光强度,同时Hoe的大发射波长由初的490 nm蓝移至460 nm.Hoe-DNA体系和DAPI-DNA体系的荧光强度均随着聚合物单体的浓度与DNA磷酸基团的浓度比值(N:P比值)的增加而增加,并且在N:P比值等于或接近1.0时达到大.结论:DNA与PB之间复合物的形成减弱了DNA与嵌入剂的结合,但却能增强DNA和沟区结合探针之间的相互作用.提示PB与DNA的结合可能特异性地影响了DNA的二级结构.
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如何平衡环磷酰胺治疗特发性膜性肾病的疗效与癌症风险
1950年 Coons 和 Kaplan 首次报道应用荧光探针标记抗体技术来检测组织中的抗原。使用这种技术，可以根据免疫荧光染色的表现进行肾小球疾病分类。原发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）的特征为 IgG（并常常伴有补体C3），沿肾小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）呈颗粒状沉积。IMN 用烷化剂治疗后，5年肾脏存活率为86％～92％，缓解率为64％～85％，而 5年后的复发率为25％。
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量子点荧光标记在生物医学领域的应用
量子点(quantum dots,QDs)又称为半导体纳米晶体(semiconductor nanocrystal),是一种由Ⅱ-Ⅷ、Ⅲ-Ⅴ或Ⅳ-Ⅵ族元素组成的纳米颗粒,直径约为1～10 nm,它能在特定激发光的诱导下产生荧光.
