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胡椒碱的抗抑郁及神经保护作用研究
目的:观察胡椒碱的抗抑郁及细胞保护作用.方法:利用小鼠强制游泳实验、悬尾实验考察胡椒碱抗抑郁作用;采用皮质酮损伤SH-SY5Y神经细胞和分离培养新生大鼠海马神经前体细胞两种体外模型,测定细胞存活率(MTT法),观察胡椒碱对神经细胞增殖的影响,并初步探讨其抗抑郁的作用机制.结果:胡椒碱(10,20 mg·kg~(-1))给药后,能明显缩短小鼠在行为学实验中的不动状态时间,并且该作用随剂量增大效应逐渐降低;胡椒碱(1.4,7,35μmol·L~(-1))可对抗皮质酮对SH-SY5Y的损伤作用,且对所培养具有神经前体细胞特性的细胞,具有促进神经前体细胞增殖的作用.结论:胡椒碱具有较好的抗抑郁作用,其作用可能是通过调控神经干细胞的增殖、迁移和分化及对功能性神经再生的保护和促进作用实现的.
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过氧化物酶体增殖物激活受体对大鼠脊髓损伤后神经干细胞分化为神经前体细胞影响的实验研究
目的：观察 PPARγ对大鼠脊髓损伤后神经干细胞分化为神经前体细胞影响，为脊髓损伤的防治提供理论基础。方法：使用清洁级SD大鼠108只，随机分成SCI组、RT组和GT治疗组。在不同时期内取材，行免疫荧光染色，观察PPARγ对大鼠脊髓损伤后神经干细胞分化为神经前体细胞的影响。结果：PPARγ激动剂罗格列酮治疗组巢蛋白的表达较脊髓损伤组的巢蛋白表达在1～4w时间点内表达增加（P<0.05），PPARγ拮抗剂GW9662组巢蛋白的表达较SCI组的巢蛋白表达在1～4w时间点内表达减少（P<0.05），单因素方差分析表明三组之间具有统计学差异。结论：PPARγ能够促进神经干细胞分化为神经前体细胞，起到神经保护作用。
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Desert Hedgehog诱导大鼠胚胎中脑神经前体细胞定向分化为多巴胺能神经元
目的 研究Desert Hedgehog(DHH)对胚胎中脑神经前体细胞(NPCs)向多巴胺能神经元分化的诱导作用.方法 大鼠DHH病毒上清感染COS7、NIH/3T3和9L细胞,用免疫荧光、实时定量PCR和Western blot方法 检测DHH表达.分离培养大鼠胚胎中脑神经前体细胞,免疫荧光鉴定神经前体细胞的增殖分化特性.条件细胞表达DHH成功后分别与上述NPCs共培养10 d,免疫荧光检测酪氨酸羟化酶(TH)的表达.结果 DHH在COS7、NIH/313和9L细胞中成功表达;同时,分离培养的大鼠胚胎中脑神经前体细胞具有良好的增殖分化特性,但两者共培养10 d后偶见TH阳性的细胞.结论 DHH编码的蛋白不能或不能单独诱导NPCs定向分化为多巴胺能神经元.
关键词： Desert Hedgehog 神经前体细胞 多巴胺能神经元 分化 大鼠 -
体外诱导成人成肌细胞转化为神经前体细胞
目的探讨成人成肌细胞在体外能否转化为神经前体细胞.方法从成人正常颞肌分离单细胞,体外培养及克隆纯化,培养至第三代时加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和白血病抑制因子的无血清培养液诱导分化,观察诱导后细胞的形态变化,并进行免疫细胞化学鉴定和RT-PCR分析.结果成肌细胞经诱导后聚集成球,悬浮生长.免疫细胞化学染色见细胞球表达巢蛋白,5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入试验阳性;细胞分化后表达神经丝蛋白68,胶质纤维酸性蛋白和半乳糖脑苷脂.RT-PCR分析结果与免疫细胞化学染色结果一致.结论成人成肌细胞在体外一定条件下诱导能够转化为神经前体细胞.
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人胚胎脑海马神经前体细胞的分离培养及形态学研究
目的:从人胚胎脑海马区分离、培养并鉴定神经前体细胞,观察其形态学变化.方法:取胎龄8～12周人胚胎脑海马区细胞,用含人表皮生长因子(h-EGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(h-bFGF)以及人白细胞抑制因子(h-LIF)的DMEM/F12培养液离体培养,以1%胎牛血清(FBS)和多聚赖氨酸诱导分化,倒置显微镜下测量形态指标,免疫细胞化学反应分析其神经化学性质.结果:原代培养中,可见许多悬浮生长并渐增大的细胞球,以及很少数贴壁生长的成簇或单个细胞.将球吹打传代后,又有许多新的细胞球生成.取细胞球诱导分化,则见细胞从球迁出、伸出突起并渐分支,细胞分别β-Ⅲtubulin、NF-200、GFAP、Galc等免疫细胞化学反应阳性.结论:人胚胎脑海马区有神经前体细胞存在,离体培养时能分裂增殖和自我更新,并能被诱导分化为神经元前体细胞、神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞.
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人骨髓间充质干细胞的生物学特性及向神经前体细胞分化的实验研究
目的 观察体外培养的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的生物学特性,并探讨使其转分化为神经前体细胞(NPCs)的方法.方法以密度梯度离心和贴壁法相结合分离成人骨髓间充质干细胞,并观察细胞形态、生长、表面标记以及成骨和成软骨及成脂肪能力的情况.选用第3代细胞进行诱导,先经胚胎干细胞培养液扩增,再用加有5-氮胞苷和曲古菌素A的神经诱导液诱导,7d后,一部分样本进行Nestin、Sox2免疫荧光染色和RT-PCR检测;另一部分样本在含有B27的神经培养液中继续培养7d,然后进行NF-L的免疫荧光检测.结果分离培养的hMSCs纯度较高,CD29、CD44的阳性率均在90%以上;具有明显的成骨、成软骨和成脂肪能力;经5-氮杂胞苷和曲古菌素A作用后能向神经前体细胞分化,免疫荧光染色及RT-PCR结果显示,诱导后的细胞能特异性表达神经前体细胞标志物Nestin和Sox2;在神经培养液中继续培养后检测神经细胞标记物NF-L,可见较多阳性细胞.结论 hMSCs可在体外进行分离培养扩增,经药物修饰后具有向神经前体细胞分化的潜能.
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大鼠Hes1基因真核表达载体的构建及瞬时表达在神经前体细胞分化中的作用
目的 探讨Hes1基因高表达对神经前体细胞分化的影响. 方法从大鼠脑组织中提取总BNA,用RT-PCR方法获得Hes1基因的全长cDNA,插入pGEM-T-Easy克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pCDNA3.1,用脂质体将重组质粒转染原代培养的神经前体细胞,经G418筛选获得抗性细胞克隆,用RT-PCR方法鉴定Hes1基因在神经前体细胞基因组中的存在,实时荧光定量PCR检测Hes1基因在转染细胞中的过表达情况. 结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定,证实目的 基因已插入重组质粒,RT-PCR证明,经G418筛选得到的转基因神经前体细胞克隆的基因组DNA中存在Hes1基因;实时荧光定量PCR进一步证明,转基因神经前体细胞Hes1基因的mRNA高表达. 结论 构建了大鼠Hes1基因的真核表达载体,获得了高表达Hes1基因的神经前体细胞克隆.Hes1基因高表达可抑制神经前体细胞Ngn1的表达,并促进神经前体细胞向神经胶质细胞的分化.
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增强型绿色荧光蛋白基因转染小鼠胚胎干细胞及其无血清神经细胞诱导
目的构建表达绿色荧光蛋白的小鼠胚胎干细胞(MES)克隆,观察基因转染对MES细胞增殖和无血清诱导为nestin阳性神经前体细胞(NPCs)的影响.方法原代分离小鼠胚胎成纤维细胞并经丝裂霉素-C处理作为饲养层细胞.质粒的转化、抽提、纯化.电穿孔法基因转染,MES细胞克隆的NBT/BClP染色,NPCs的nestin免疫组织化学染色.结果 EGFP基因转染后可得到表达绿色荧光蛋白的MES细胞克隆,采用N2或ITSF无血清条件培养基可将其定向诱导为nestin阳性的并能发绿色荧光的NPCs.基因转染后的MES细胞增殖、神经前体细胞诱导率和未转染组相比均无明显下降,但NPCs绿色荧光的表达较诱导前明显下降.结论基因转染对ES细胞的增殖和神经分化无明显影响.
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温度敏感型基因永生化神经前体细胞系的建立
目的建立温度敏感型永生化神经前体细胞系,鉴定其细胞生长特点及表达抗原的特性. 方法利用逆转录病毒感染原代培养的胚胎13d SD大鼠中脑神经前体细胞,建立温度敏感型永生化神经前体细胞系RMN,利用免疫细胞化学、Western blot和流式细胞分析方法测定RMN细胞的特征. 结果在33℃条件下,RMN细胞呈多边形,有较短突起;细胞增殖迅速,群体倍增时间为48 h,可连续传代和冷冻保存;细胞表达SV40大T抗原,nestin蛋白和Nurrl蛋白;RMN细胞中未发现染色体倍体的异常,裸鼠接种20周后未观察到肿瘤的形成.在39℃条件下,RMN细胞增殖速度减缓,细胞形成较长突起.在含1%胎牛血清的培养基中培养1周后,RMN细胞可表达β-Ⅲ-tubulin,GFAP和Gal C等抗原,但SV40抗原表达减弱.结论RMN细胞系是SV40/tsA58基因永生化的大鼠神经前体细胞系,是具有温度敏感性及多分化潜能的前体细胞系.
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无血清培养条件下诱导胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向分化的实验研究
目的寻求无血清、无饲养层细胞存在的情况下,胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向诱导分化的佳条件. 方法采用阶段诱导的方法,在不同阶段加入不同的生长因子,对新近分离的胚胎干细胞进行分化培养.首先向无血清培养液中分别加入bFGF和LIF,实现由胚胎干细胞向神经前体细胞的定向分化,通过巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色对神经前体细胞进行鉴定;在此基础上,撤除bFGF和LIF,加入B27无血清培养基、IL-1后继续培养,实现由神经前体细胞向多巴胺能神经元的定向诱导分化;通过酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色对多巴胺能神经元进行鉴定. 结果有85%的细胞团呈nestin免疫阳性着色,多巴胺能神经元的分化比率为13%,较多巴胺能神经元的自然分化比率(4%)有明显提高. 结论在无血清、无饲养细胞的情况下,我们采用阶段诱导的方法,在不同的阶段加入不同的生长因子,可有效诱导多巴胺能神经元的分化,使胚胎干细胞的诱导分化过程更易于操作.
关键词： 神经前体细胞 多巴胺能神经元 诱导分化 碱性成纤维细胞生长因子 胚胎干细胞 -
人胎儿脑室区神经前体细胞的分离纯化、培养及鉴定
目的建立有效的人胎儿神经前体细胞分离及纯化系统.方法取人自然流产胎儿脑室区(VZ)并制备单细胞悬液,采用免疫磁珠法分离CD133阳性及CD133阴性细胞群,体外培养并比较两者增殖能力.用免疫荧光化学方法检测CD133阳性细胞群中神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达及诱导分化后的多向分化潜能.结果纯化后CD133阳性细胞群体外扩增能力强,在无血清培养体系中能形成神经球并可连续传代,免疫荧光化学法检测表明其nestin抗原阳性,诱导分化后可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.而CD133阴性细胞在培养体系中多呈单个分散状态,神经球形成数目与CD133阳性细胞有显著性差异(P＜0.05).结论免疫磁珠法可有效分离人胎儿脑内CD133阳性细胞,且该细胞在体外培养体系中具有神经前体细胞的特征.
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六羟多巴胺对成年小鼠黑质-纹状体系统多巴胺能神经元及其行为学的影响
目的 评估中脑黑质损伤后内源性神经前体细胞(NPCs)的增殖情况及其对黑质-纹状体系统损伤后恢复的促进作用.方法 向成年小鼠的一侧黑质(SN)注射六羟多巴胺(6-OHDA),损伤后3～35 d运用免疫荧光染色等方法,研究小鼠来自侧脑室、第三脑室、中脑水管周围及中脑部分NPCs的增殖,探索黑质中新生细胞的增殖及其向成熟神经元、多巴胺能神经元分化的情况,后通过旷场和转棒实验检测小鼠行为学的变化(每组n=4～6).结果 黑质内注射6-OHDA引起的多巴胺能神经元损失可以明显增加第三脑室和中脑水管周围来自室管膜下区的NPCs的数目,以6-OHDA注射后的第7天为明显,且6-OHDA注射后第21天黑质内新生细胞和新生多巴胺能神经元的数目增加达到高峰,这些变化可能导致了受损的黑质-纹状体系统及小鼠行为学表现有部分恢复.结论 促进内源性NPCs的增殖和分化将成为治疗帕金森病的理想手段.
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从多潜能干细胞诱导成神经前体细胞及其分化探讨
目的 探讨诱导多潜能干细胞在体外分化为神经前体细胞.方法 采用N2B27作为选择培养基,多步法贴壁培养把诱导多潜能干细胞诱导为神经前体细胞.结果 免疫荧光染色发现,该细胞神经干细胞的标记物巢蛋白阳性,有极个别的β-微管蛋白Ⅲ(β-Tub-Ⅲ)阳性细胞.在分化培养基内培养7d后,β3-Tub-Ⅲ阳性细胞增多.结论 本实验初步表明,诱导多潜能干细胞在体外可以被诱导为有一定神经特征的神经前体细胞,该细胞有望用于细胞移植治疗缺血性脑损伤.
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施万细胞对植入半横断脊髓内的神经前体细胞存活及分化的影响
研究表明,神经前体细胞移植在修复中枢神经系统损伤及其退行性疾病方面具有潜在的应用价值.为了探讨施万细胞对神经前体细胞在损伤脊髓内存活及分化的影响,本实验将施万细胞与神经前体细胞联合植入大鼠脊髓损伤处,主要观察神经前体细胞的存活、迁移和分化情况.
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碱性成纤维细胞生长因子和环磷酸腺苷对神经前体细胞内源性端粒酶反转录酶基因转录水平的调控
目的 探讨人类神经前体细胞中内源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的转录活性及增殖与分化相关调控机制.方法 采用系列hTERT基因启动子的荧光素酶报告载体和β-半乳苷酶表达载体,瞬时共转染HeLa细胞和hNPCs-G3细胞,检测不同长度启动子的活性.分析碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)促进增殖过程中hTERT基因启动子活性,分析cAMP诱导分化过程中hTERT基因启动子活性.结果 hNPCs-G3神经前体细胞内源性hTERT基因的转录活性较低,主要依赖近端启动子区.bFGF上调hNPCs-G3神经前体细胞内源性hTERT基因的表达,其调控主要作用在-2 098～-1 099bp区域和-3 216bp～-2 098bp区域内;cAMP 抑制hNPCs-G3神经前体细胞hTERT基因的转录,其调控主要作用在近端启动子区.结论 神经前体细胞内源性hTERT基因的转录活性较低,bFGF可上调神经前体细胞内源性hTERT基因的表达,cAMP则可抑制hTERT基因的转录.
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神经前体细胞的迁移机制及其应用研究进展
神经前体细胞脑内移植后可在全脑迁移.在病变的中枢神经系统,神经前体细胞的迁移具有损伤区靶向性.神经前体细胞的迁移可能与中枢神经系统微环境中的神经导向分子以及神经损伤区释放的包括炎症因子在内的一些因子有关.神经前体细胞的靶向性迁移特性使其可作为运载治疗性分子的载体细胞,特异性治疗多发性中枢神经系统退行性病变和转移性脑肿瘤.同时,神经前体细胞还可以参与损伤区的神经修复和功能重建.
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bHLH因子对大脑神经前体细胞的增殖分化与命运决定的调节
神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)是具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,它的增殖和分化受到多种内源或者外源因子,以及邻近或远程细胞信号通路的调控.多项研究表明,碱性螺旋——环——螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)家族转录因子之间相互联系,相互竞争,广泛参与调控端脑的发育过程,在NPCs向神经元和神经胶质细胞分化过程中起着重要的调控作用.而bHLH家族分子的不同的表达状态,即持续表达或波动表达,又与NPCs增殖或者分化的终结局有着重要的关系.本文主要对在端脑发育中有重要代表性作用的bHLH转录因子,以及它们之间的表达调控关系的研究进展进行综述.
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人Muse细胞体外诱导为神经前体细胞的研究
探讨成人骨髓来源的Muse细胞体外诱导为神经前体细胞的技术方法.从健康成人骨髓中分离出骨髓基质细胞(hBMSCs),利用流式细胞分选技术从中筛选出Muse细胞,采取免疫荧光细胞化学染色和qPCR技术鉴定Muse细胞的多能干细胞特性;通过神经诱导培养基体外诱导Muse细胞分化为神经前体细胞(Muse-NPCs),采用免疫荧光细胞化学染色和qPCR技术鉴定其神经干细胞标志物表达情况.从hBMSCs中分选出约0.58％的Muse细胞,Muse细胞表达多能干细胞标志物SSEA-3、Nanog和Oct4,其mRNA表达水平均高于hBMSCs(P＜0.01);诱导后的Muse-NPCs表达神经干细胞标志物Nestin、βⅢ-tubulin,其mRNA表达水平均高于hBMSCs及Muse细胞(P＜0.01).从成人骨髓中成功分离出具有多能干细胞特性的Muse细胞,用体外诱导形成Muse-NPCs,可为今后细胞治疗修复神经损伤提供新的种子细胞.
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拮抗髓鞘抑制蛋白促进神经前体细胞分化的机制
目的 建立局灶性缺血性脑梗死模型,观察Nogo-66受体(NgR1)拮抗剂(sNgR1-Fc)促进内源性成体神经前体细胞(NPCs)定向分化的作用,并探讨其机制.方法 取SD大鼠12只,光化学法建立大脑皮层局灶缺血梗死(PCI)模型.设假手术组、PBS组和sNgR1-Fc治疗组.在PCI术后第1～3天,通过小型渗透性微泵持续性地向梗死灶同侧的侧脑室灌注sNgR1-Fc或同等体积的PBS;第4～6天,通过腹腔注射BrdU(bromodeoxyuridine)；在PCI术后35 d,利用免疫组化染色观察各组海马齿状回NeuN+/BrdU+细胞的比率；Western blot检测梗死侧海马Notch1、Mash1及Neuro D蛋白的表达情况.结果 光化学法可以成功地建立局灶性缺血性脑梗死模型.PCI术后35 d时梗死灶同侧的海马齿状回,sNgR1-Fc处理组的BrdU+细胞的数目显著高于PBS组(P＜0.01),NeuN+/BrdU+细胞的比率也显著高于PBS组(P＜0.05).Western blot实验表明,sNgR1-Fc治疗组海马的Notch1、Mash1、Neuro D蛋白的表达显著高于PBS组,后者又显著高于假手术组.结论 NgR1拮抗剂NgR1-Fc能够促进脑梗死后大脑中的神经前体细胞向神经元方向分化,这一作用可能是通过影响Notch和bHLH家族信号通路而发挥的.
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同种异体胚胎干细胞移植治疗小鼠缺氧缺血性脑损伤
目的 研究Esc来源的神经前体细胞移植入HIBD脑内后的迁移、分化,以探讨细胞移植治疗的机制.方法 取7 d龄C57小鼠,制作HIBD动物模型.术后第2～3天,将Esc来源神经前体细胞植入小鼠损伤侧脑室,同时设对照组(只注射PBS)和正常组.然后对小鼠脑组织进行病理学、PCR、X-gal染色及免疫荧光组织化学检测.结果 Esc来源神经前体细胞移植入HIBD脑内后,长期存在于脑内,并迁移、分布于受损的海马,构成海马结构,经进一步免疫荧光检测可分化为NF阳性的神经元.结论 Esc来源神经前体细胞移植入HIBD脑内后,能迁移至损伤的海马,分化为神经元,替代损伤或坏死的神经细胞,这可能是其发挥治疗作用的机制之一.
