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成年大鼠脑出血后海马齿状回神经前体细胞的增殖与分化
目的:观察成年大鼠脑出血后海马齿状回神经前体细胞的增殖与分化,探讨脑出血后神经前体细胞的变化规律.方法:制作大鼠脑出血模型,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)腹腔注射标记增殖细胞,用免疫组织化学法检测大鼠海马齿状回BrdU、神经元核抗原(NeuN)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数的变化.结果:正常组和假手术组大鼠海马齿状回均有少量BrdU阳性细胞,脑出血后大鼠各时间段的BrdU阳性细胞均较正常组和假手术组增加,7d组达到峰值后逐渐下降,28 d组仍高于正常组和假手术组.正常成年大鼠海马齿状回可见少量BrdU/NeuN和BrdU/GFAP双标阳性细胞,脑出血后双标阳性细胞数较正常组增加.结论:脑出血后大鼠海马齿状回神经前体细胞增殖明显,且可以向神经元和神经胶质细胞分化.
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与Sertoli细胞共培养大鼠大脑皮质神经前体细胞分化中Notch信号相关基因表达分析
目的:检测与Sertoli细胞共培养条件下大鼠大脑皮质神经前体细胞分化过程中Notch信号相关分子的表达变化.方法:分离大鼠Sertoli细胞和大脑皮质神经前体细胞.神经前体细胞与Dertoli细胞共培养条件下,用Real-time PCR相对定量法,分别检测Notch受体Notch1、Notch2、Notch3、Notch4及其配体Delta1、Delta3、Jagged1、Jagged2,以及ngn1、hes1基因的表达变化.结果:培养细胞汇片后第5天,Sertoli细胞Notch1～4基本表达维持不变;其配体Jagged2表达较高,但不表达Delta1;同时也不表达ngn1、hes1.神经前体细胞Notch表达水平较高,尤以Notch1和Notch2为高;而其配体以Jagged1、Jagged2表达较高,前神经因子Hes1有较高表达,而Ngn1表达较低.细胞共培养条件下,Notch受体、配体以及Hes1与神经前体细胞组相比都有明显的下调,而Ngn1却相对有所提高.结论:Sertoli细胞可通过Notch配体的作用,调节神经前体细胞Notch信号分子的表达.在共培养条件下,Sertoli细胞对神经前体细胞Hes1表达有抑制作用,但对Ngn1有正向调节作用,从而影响神经前体细胞的分化.
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Sertoli 细胞对大鼠大脑皮质神经前体细胞的诱导分化作用
目的:研究Sertoli细胞对体外培养大鼠皮质神经前体细胞生长发育的促进作用,及向多巴胺能神经元分化的诱导作用.方法:将大鼠Sertoli细胞与14 d大鼠皮质神经前体细胞体外共培养,免疫细胞化学检测神经干细胞标记物巢蛋白,神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞标记物βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(GalC),及多巴胺能神经元标记物酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况.结果:随着共培养时间的延长,神经前体细胞中GFAP阳性细胞数量逐渐减少,而β-Ⅲ tubulin 阳性细胞数增多,并出现TH阳性神经元.结论:Sertoli细胞抑制体外培养的大鼠皮质神经前体细胞的生长,但具有显著促神经元分化作用,并能够诱导与其共培养的大鼠皮质神经前体细胞分化为多巴胺能神经元.
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脑缺血再灌注后小鼠海马神经前体细胞的增殖
目的:研究小鼠脑缺血再灌注后海马神经前体细胞的增殖.方法:采用无创微动脉夹夹闭小鼠双侧颈总动脉0.5 h的方法制作脑缺血再灌注动物模型.分正常对照组、假手术组、实验组小鼠脑缺血再灌注后1、3、5、7、14、21、28 d组,共7个时相点.各组小鼠于各时相点处死前注射5-溴脱氧尿苷嘧啶(BrdU).处死后取出脑组织制备石蜡切片进行Nissl染色,BrdU免疫组织化学显色,观察脑组织缺血后的病理变化并比较缺血后不同时相点神经前体细胞增殖的差异.同时从小鼠心采血进行血气分析.结果:夹闭小鼠双侧颈总动脉的脑缺血再灌注模型可致PO2明显降低,PCO2明显升高,大脑皮质出现了缺血的形态学变化.小鼠海马BrdUf细胞在脑缺血再灌注后1 d开始增加,7 d达到高峰,28 d恢复正常水平.结论:夹闭双侧颈总动脉是致小鼠脑缺血冉灌注损伤的理想模型.小鼠脑缺血再灌注损伤能激活海马神经前体细胞的增殖,并在术后7 d达峰值.
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穹隆海马伞损伤诱导巢蛋白在隔-海马通路表达
目的:探讨穹隆海马伞横断后巢蛋白在隔-海马通路表达的情况.方法:在立体定位仪上横切SD大鼠大脑皮质、胼胝体和穹隆海马伞,于术后1～30 d处死动物.用免疫组化染色方法,观察损伤后巢蛋白在隔-海马通路的表达.结果:穹隆海马伞损伤后,第1天,隔区和海马未见巢蛋白阳性细胞;第3天巢蛋白阳性细胞开始出现在损伤近侧背外侧核区和海马CA3区及齿状回;第5天巢蛋白阳性细胞范围扩大,数量增加,出现在远离损伤平面嘴侧端的隔区和尾侧端的海马以及损伤对侧.第7天起,巢蛋白阳性细胞在损伤平面区减少而在远离区增加;第15天损伤对侧多于损伤侧;第20天消失.结论:穹隆海马伞横断引起隔-海马通路巢蛋白表达的改变,巢蛋白阳性细胞具有修复中枢神经系统病变的潜能.
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大鼠大脑皮质神经前体细胞的分离培养及其增殖分化鉴定
目的:体外分离和培养大鼠大脑皮质神经前体细胞并进行增殖和分化鉴定.方法:分离2周龄大鼠皮质神经前体细胞,在含EGF、bFGF和GDNF的NSC培养基中进行体外培养,使用免疫细胞荧光染色技术对细胞的分化特性进行鉴定.结果:EGF、bFGF和GDNF可促进神经前体细胞的增殖及神经球的克隆形成,并获得了Nestin阳性的神经前体细胞,其可分化为分别表达β-Ⅲtubulin、GFAP和GalC的阳性细胞.结论:体外分离和培养的大脑皮质神经前体细胞,在含EGF、bFGF和GDNF的NSC培养基中培养,具有增殖分化的能力,有望应用于神经系统疾病的细胞移植治疗.
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不同化学物质对新生大鼠中脑神经前体细胞神经元生成的影响
目的:观察新生大鼠中脑神经前体细胞对不同化学物质的反应性,以期找到体外有效增加其神经元生成的化学物质.方法:建立新生大鼠中脑神经前体细胞的培养体系,分别被各种化学物质诱导分化,利用神经元特异性标记物进行免疫细胞化学染色,检测不同化学物质诱导神经元生成的比例.结果:白介素-1α促新生大鼠中脑神经前体细胞的神经元生成,天麻素、胶质源性神经营养因子和睫状神经营养因子呈抑制效应,雌二醇、葛根素、牛蒡子苷、人参皂甙Rg1无明显作用.结论:新生大鼠中脑神经前体细胞的分化方向可被环境信号调控.白介素-1α是上述化学物质中唯一有望增加植入后神经元产量的细胞因子.
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神经生长因子/胶源性神经营养因子基因修饰神经前体细胞单独和联合移植促进阿尔茨海默病模型鼠海马胆碱能纤维网的重建
目的:观察神经生长因子(Nerve growthfactor,NGF)/胶源性神经营养因子(Glial oell line-derived neurotrophicfactor,GDNF)基因修饰神经前体细胞(Neural progenitor cell,NPC)单独和联合移植对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型鼠海马胆碱能纤维网的促重建作用.方法:将NGF/GDNF基因修饰的NPC单独和联合移植入FF切断的大鼠侧脑室内.移植后三周取海马切片进行AchE纤维组织化学染色.结果:CA1区和齿状回的NGF组、GDNF组和NGF+GDNF组的AchE纤维数分别为32%和50%、18%和24%、24%和58%,明显高于损伤组(4%和6%)和NPC组(7%和9%),P均＜0.01;NGF组也高于GDNF组(P＜0.05和P＜0.01).结论:NGF/GDNF基因修饰的NPC单独和联合移植均能不同程度地促进AD模型鼠海马胆碱能纤维网的重建,其中NGF组和NGF+GDNF组作用大于GDNF组.
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gp130信号可上调神经前体细胞表面分子CXCR4的表达
gp130信号参与了神经前体细胞(NPC)的自我更新,敲除gp130分子的胚胎不能正常地发育,可导致胎儿在出生前天折.CXCR4是趋化因子基质细胞源因子(stromal cell devived factor-1α,SDF-1α)已知的唯一受体,表达CXCR4的NPC可在体外被SDF-1α趋化而定向迁移,在神经功能缺损的修复中起着重要的作用.gp130和CXCR4分子之间可能存在着一定的相关性.本实验在发现NPC表达gp130和CXCR4的基础上,采用gp130激发型单克隆抗体激发NPC,结果表明能上调NPC表达CXCR4分子以及增强NPC的迁徙能力,从而揭示了gp130信号在胚胎NPC定向迁移中可能起着重要的作用.
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诱导骨髓基质细胞表达神经细胞标记物Nestin,NSE和GFAP:脑源性神经节苷脂定向诱导细胞分化作用的研究
目的:研究脑源性神经节苷脂诱导成年大鼠骨髓基质细胞定向分化为神经前体细胞的作用.方法:成年大鼠骨髓基质细胞传代纯化后,分别在无血清、无外源性生长因子、含2%B27的Neurobasal-A培养基及含20%胎牛血清的DMEM培养基中添加脑源性神经节苷脂作为诱导物,观察细胞的形态变化.结果:在无血清、无外源性生长因子、含2%B27的Neurohasal-A培养基中,脑源性神经节苷脂能诱导骨髓基质细胞定向分化为神经前体细胞,其形态发生显著变化,胞体逐渐变小、折光性增强,突起逐渐增多、延长,部分细胞间可见突起连接、细胞核和核仁;诱导第5 d免疫细胞荧光染色显示,神经前体细胞标记物Nestin染色阳性,同时部分细胞可见神经元特异性标记物NSE及星形胶质细胞标记物GFAP染色阳性,而少突胶质细胞标记物Nogo-A染色阴性.在含20%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基中,脑源性神经节苷脂的这种诱导、分化作用明显被抑制,表现为细胞形态变化不明显,Nestin、NSE及GFAP染色均为阴性.两组对照组细胞形态无变化、上述染色均为阴性.结论:脑源性神经节苷脂具有诱导骨髓基质细胞成为神经前体细胞的作用,这种作用不需要外源性生长因子存在,血清可抑制这种作用,脑源性神经节苷脂在成体干细胞可塑性研究中有重要价值.
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胚胎干细胞来源神经前体细胞在缺氧缺血性脑损伤海马内的分化
目的研究胚胎干细胞(ESC)来源的神经前体细胞移植入缺氧缺血性脑损伤(HIBD)脑内后,在海马的迁移和分化.方法小鼠ESC体外培养和诱导分化,制作小鼠HIBD模型.术后第2～3天,将细胞植入损伤侧侧脑室.对脑组织进行病理学、聚合酶链反应(PCR)、X-gal和免疫荧光组化染色等检测.结果小鼠ESC在特定条件下,能成功诱导分化为神经前体细胞.细胞移植后,经PCR检测和X-gal染色发现能长期存在于脑内,并迁移、分布于受损海马,构成海马结构,经进一步免疫荧光检测发现可分化为神经元;同时病理学检测亦发现细胞移植后受损海马内的神经细胞数量明显增加.结论体外经过特定的诱导分化后,ESC被定向诱导分化为神经前体细胞,植入HIBD小鼠脑内后,能迁移至损伤海马,分化为神经元,替代损伤或坏死的神经细胞,是其发挥治疗作用的可能机制之一.
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大鼠诱导性多能干细胞向神经前体细胞诱导分化研究
目的 探讨大鼠来源的诱导性多能干细胞(iPS细胞)向神经前体细胞(NPC)定向诱导分化的方法.方法 在大鼠iPS细胞培养到悬浮类胚体阶段加入维甲酸(RA)诱导分化,对分化获得的细胞,分别通过免疫荧光染色和实时定量PCR方法检测NPC标志物、用BrdU免疫荧光染色检测其增殖能力、并通过大鼠视网膜下腔移植对其存活、整合情况及分化能力进行检测.结果 经诱导分化获得的细胞能够在贴壁培养条件下形成Rosette结构、表达NPC标志物并且绝大多数呈BrdU阳性,移植到大鼠视网膜下腔后能分化为神经元和胶质细胞.结论 大鼠iPS细胞能够通过悬浮EB加RA诱导的方法分化为NPC,有可能作为细胞移植治疗视网膜退行性疾病的供体细胞.
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caspase-3限制小鼠脑卒中恢复期齿状回神经前体细胞增殖
目的 探讨caspase-3对脑卒中恢复期海马齿状回(dentate gyrus,DG)神经前体细胞(neuronal precursor cells,NPCs)增殖的作用.方法 构建小鼠大脑中动脉远端堵塞(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)缺血模型,取缺血手术后第7天缺血侧DG进行体外细胞培养.研究分为对照组和给药组(caspase-3抑制剂给药组);采用Western blot、免疫细胞化学、流式细胞仪和TUNEL染色检测DG NPCs中caspase-3的表达及NPCs的凋亡和增殖情况.在小鼠脑卒中后第14天,采用免疫组织化学方法检测easpase-3抑制对DG NPCs增殖的影响.结果 体外培养的源自脑缺血后DG的神经球NPCs大量表达激活型caspase-3,但是超过87％的caspase-3阳性细胞与TUNEL阳性没有共定位关系.caspase-3限制了DG NPCs的自我更新,但并未参与细胞的凋亡过程.抑制caspase-3可促进脑卒中恢复期DG NPCs的增殖.结论 caspase-3可通过细胞凋亡之外的途径调控缺血性脑损伤后的神经再生.
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人脐血源和骨髓源间充质干细胞神经前体细胞分化的研究
目的 对比研究人脐血和骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外的分离、培养和生物学特性,并观察其分化潜能和形态学变化,为组织工程选取种子细胞提供实验依据.方法 Ficoll密度梯度离心结合贴壁培养法分别分离纯化成人骨髓和脐血源MSCs,体外培养和连续传代,并在含有2%B27的Neurobasal培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子,将获得的MSCs向神经干细胞定向诱导,利用倒置显微镜连续观察细胞培养、传代和向神经细胞表型转化过程的形态学变化;采用免疫组化和荧光免疫组化法对诱导后细胞进行鉴定.结果 原代分离的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在接种后48 h贴壁,7 d细胞呈长梭形,有一定的方向性,并达到90%融合;而脐血间充质干细胞(UMSCs)48 h后贴壁,似乎贴的不牢,持续14d才能形成小丛、小簇、小集落,21 d排列才有一定的方向性.培养基添加神经营养因子诱导后的细胞呈现典型的神经前体细胞样表型,免疫组化和免疫荧光结果显示,诱导后的细胞能特异性表达神经元特异性标志β微管蛋白(β-tubulin)和星形胶质细胞特异性标志神经胶质相关蛋白(GFAP).结论 人脐血和骨髓中含MSCs,且具备其基本恃征,体外培养UMSCs生长速度比BMSCs缓慢10 d～15 d左右,传代以后的各组细胞生长速度与形态无明显差异.骨髓和脐血来源的MSCs在体外可定向诱导分化为神经细胞.
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神经前体细胞在中枢神经系统基因治疗中的应用
基因治疗有望为中枢神经系统疾病提供一种有效的治疗手段,神经前体细胞由于其良好的生物学特性,因此目前被认为是中枢神经系统转基因治疗较为理想的载体细胞.现仅针对神经前体细胞在中枢神经系统基因治疗中的研究进展作一综述.
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Notch信号通路对神经前体细胞定向分化的作用及相关调控因子的研究进展
背景 Notch介导的信号通路几乎涉及所有类型细胞的增殖和分化活动,在脊椎和非脊椎动物细胞命运的决定以及生长发育调控中发挥着重要作用,其中就包括神经前体细胞(neural progenitor cell,NPC)的定向分化作用.Notch信号通路参与了NPC的自我更新和不同神经细胞的分化过程. 目的 讨论Notch信号通路在NPC定向分化中的角色与相关调控机制. 内容 介绍经典Notch信号通路的构成、Notch信号通路在NPC定向分化过程中的重要作用以及在该过程中调控Notch信号通路的相关因子. 趋向 已知全身麻醉药物应用于婴幼儿与胎儿会影响胚胎神经系统中NPC的定向分化并可能造成长期的学习记忆功能受损,提示Notch信号通路参与了麻醉药的神经毒性机制.
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成年中枢神经发生与脑损伤治疗
脑损伤可导致神经细胞坏死.目前,针对脑损伤的修复方法还很有限,主要局限于预防神经细胞死亡方面.脑内存在具有生成新生神经细胞能力的神经前体细胞,这为大脑结构性重构带来希望.文章概述了成年中枢神经发生的存在和特点及其在脑损伤治疗中的应用现状和前景.
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Rac1蛋白表达与神经前体细胞增殖分化的关系
目的 探讨Rac1蛋白表达与神经前体细胞增殖分化的关系.方法 取新生大鼠大脑皮层,原代培养获得混合细胞堵养体系,在含10%血清的培养基中培养6 d细胞汇合后更换无血清培养基继续培养.实验中设计4个时间点,用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化的变化,免疫荧光染色技术鉴定细胞种类以及Rac1蛋白在细胞内的表达,通过Western blot检测Rae1蛋白的表达变化.结果 建立了新生SD大鼠大脑皮层原代混合细胞培养体系,此体系底层主要是由Ⅰ型胶质细胞组成的单层细胞,GFAP染色呈阳性;在单层细胞上面有一些小圆形强折光性神经前体细胞生长,βⅢ-Tubulin染色呈阳性.更换无血清培养基后上层神经前体细胞大量增殖:βⅢ-Tubulin、Rac1染色呈阳性.Western blot定量分析结果显示,神经前体细胞增殖过程中Rae1蛋白表达上升,而分化过程中Rac1蛋白的表达下降.结论 Rac1蛋白表达与神经前体细胞的增殖分化过程密切相关,可能参与了神经前体细胞的增殖分化过程.
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糖基化终产物对体外培养的胎鼠海马神经前体细胞增殖和分化的影响
/L干预7 d后,NeuN阳性细胞率显著低于对照组(P<0.05).结论 糖基化终产物抑制胎鼠NPCs的增殖和向神经元的分化.
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胍丁胺对体外培养海马神经前体细胞增殖的影响及作用机制
目的 前期证明胍丁胺(agmatine, Agm)作为一种新型神经递质具有抗抑郁作用,能够促进慢性应激小鼠海马神经元再生.本实验通过观察胍丁胺对体外培养海马神经前体细胞增殖的影响及作用机制,探讨其抗抑郁作用的细胞分子机制.方法 培养扩增新生大鼠海马神经前体细胞,通过3H-TdR参入法和CCK-8试剂盒检测胍丁胺对其增殖的影响;培养体系内加入H89(PKA特异性抑制剂)或PD98059(MEK特异性抑制剂),观察这两种抑制剂对胍丁胺作用的影响.结果 胍丁胺在0.1～10 μmol·L-1浓度范围内,浓度依赖性地促进神经前体细胞的增殖,这种促增殖作用可以被H89(10 μmol·L -1)和PD98059(10 μmol·L -1)取消.结论 胍丁胺可以促进体外培养的海马神经前体细胞增殖,此作用与cAMP-PKA-CREB通路和MEK-ERK-CREB通路相关.
