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诱导性多能干细胞诱导率的研究现状与进展
2006年,Takahashi和Yamanaka研究小组利用逆转录病毒将Oct3/4[1]、SoX2、c-myc和Klf4四个转录因子导入小鼠胚胎成纤维母细胞(MEF),重编程为iPSCs.iPSCs在形态结构、表面标志物、增殖分化和畸胎瘤形成等方面与ESc极为相似.iPSCs避免了移植免疫排斥以及法律伦理学等方面的问题.在iPSCs的研究过程中诱导率的研究是关键.
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人类心血管系统疾病干细胞模型的研究进展
随着干细胞和人类遗传学研究的发展,患者特异细胞和组织模型已逐步进入到应用阶段.本文概述了在心血管疾病遗传模型方面利用多能干细胞的途径,包括ES细胞系的基因修饰,特异疾病iPS细胞的生成,先祖细胞的分离扩增等.以有效的方式利用这些干细胞模型,将推动疾病机理和药物治疗研究.
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高效制备人诱导多能干细胞并诱导分化为心肌细胞
目的 提高人诱导性多能干细胞(hiPSC)转化效率,缩短其产生周期,并避免引入异源基因.方法 利用GP2-293反转录病毒包装系统对人包皮成纤维细胞(HFFs)进行转化,引入小分子物质,并对类胚胎干细胞(ESC)克隆进行独立培养,检测标记蛋白,定向诱导分化能力和核型分析.结果 HFFs经转化后,20 d出现形态与ESC克隆相似的hiPSC,比经典法缩短了10 d,效率提高约12倍.它们与ESC同样表达标记蛋白；体外成功定向分化为心肌细胞.核型分析表明该hiPSC染色体核型正常.结论 建立稳定的转化效率高、周期短的hiPSC生成体系,并成功诱导分化成心肌细胞,为心血管疾病的模型构建和临床研究提供实验基础.
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诱导性多能干细胞及其转化医学的信息分析
目的 分析诱导性多能干细胞(iPSCs)的研究现状、热点领域及其转化医学研究.方法 采用文献计量分析、共现分析等方法,对2006年至2013年WOS数据库收录的2 859篇iPSCs文献以及ClinicalTrials数据库和Cortellis竞争情报数据库提供的iPSCs临床试验研究和药物研究信息进行分析.结果 iPSCs研究文献年均增长率达159％,美国、日本在发表文章量、篇均被引用次数、相对优势指数方面都处于全球领先,中国科学院和上海交通大学发文量排名进入全球前20位,但篇均被引用次数、相对优势指数均低于全球平均水平.iPSCs科研基金资助发表文献的比例从2008年的36％上升至2012年的81％,重编程的影响因素和其应用研究是国际iPSCs两大热点领域,药物研发和再生医学研究是iPSCs转化研究的重点.结论 iPSCs由基础向临床应用转化是其研究的必然方向,iPSCs的安全性问题是其临床应用首要解决的问题.
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梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织来源iPSCs系的建立
目的 利用梗阻性无精子症(OA)和非梗阻性无精子症(NOA)患者的睾丸组织建立诱导性多能干细胞(iPSCs)系,比较两者建系过程有无差别.方法 分别取3例OA患者和特发性NOA患者5～6 mm3的睾丸组织,组织块培养方法进行原代培养,传至3～4代转染仙台病毒,待细胞增殖满后转移至饲养层细胞上继续培养,第21～22天挑取克隆,建立iPSCs系并进行多能性和分化能力的鉴定.结果 两株iPSCs系均成功建立,建系过程无明显差异,碱性磷酸酶(AP)染色均为阳性;八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定基因相关蛋白2(SOX2)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、肿瘤排斥抗原-1-60(TRA-1-60)的免疫荧光染色均为阳性;小鼠体内的畸胎瘤实验也表明获得的两株iPSCs系具有向3个胚层分化的潜能.结论 利用仙台病毒非基因整合方法,OA患者和特发性NOA患者的睾丸组织均能建立iPSCs系.
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转导特定基因重编程体细胞为多能干细胞
通过转导特定基因将体细胞重编程可获得诱导性多能干细胞,这种建系方法 标志着干细胞实验技术的重大突破.本文综述该细胞建立、鉴定及新进展.
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小鼠诱导性多能干细胞的神经细胞分化与突触连接的建立及其功能分析
目的 探讨小鼠诱导性多能干细胞(iPSCs)在体外某些因素的诱导下能否分化成功能性的神经细胞,以及神经细胞之间突触的发生与建立.方法 首先将iPSCs悬浮培养形成拟胚体,利用维甲酸(RA)将其诱导分化成神经前体细胞,后撤去RA贴壁培养,利用免疫荧光染色技术观察小鼠iPSCs在体外分化成神经细胞以及神经细胞之间突触发生的形态特征,利用FM1-43染色技术分析突触末端的功能活性.结果 小鼠iPSCs能够在RA的诱导下向神经细胞分化,这些神经细胞可以被成熟神经元与胶质细胞标记物标记,新分化的神经元还可以观察到树突棘及突触连接的形成,在去极化刺激下突触活动增强,表现为轴突末端大量FM1-43阳性内吞颗粒.结论 由小鼠iPSCs分化而来的神经细胞在体外形成突触连接的过程,提示其可以进一步分化为功能性的神经元和神经胶质细胞.
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起源于小鼠诱导性多能干细胞的大脑皮质类器官的建立及其生物学特性
目的 利用小鼠诱导性多能干细胞(iPSCs)建立大脑皮质类器官并分析其生物学特性.方法 首先将生长在饲养层细胞上的iPSCs克隆消化成单细胞,悬浮培养使其自发形成拟胚体.随后,对其进行神经上皮分化的诱导.在合适时间将其嵌入Matrigel基质胶做的悬滴中,摇动培养,形成大脑皮质类器官;后利用免疫荧光、Dio示踪、透射电子显微镜等技术检测大脑皮质类器官的生物学特性.结果 大脑皮质类器官有神经上皮、神经元及神经胶质细胞的分化特征;具有简单的片层化结构,如皮质板和分子层,且大脑皮质类器官具有神经再生及修复能力.结论 利用iPSCs成功建立了大脑皮质类器官模型,且该模型具有与活体大脑皮质相似的特征,且具有神经再生能力.
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不同分化阶段诱导性多能干细胞移植实验研究进展
诱导性多能干细胞(iPSCs)是由动物体细胞重编程得到的具有胚胎干细胞特性的全能干细胞.近年来,随着多能干细胞诱导技术的不断优化以及体外分化技术的飞速发展,多种分化状态的多能干细胞被用于移植实验.我们结合新研究进展,阐述各种分化阶段诱导性多能干细胞用于动物移植治疗的优缺点,以及新移植方法所存在的问题.
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血液细胞重编程为诱导性多能干细胞的研究进展
诱导性多能干细胞(iPSCs)技术能够将已分化的体细胞反转为多能细胞,因其不存在伦理、排斥等问题,在再生医学领域具有广阔的应用前景.尽管已经建立了来源于多种体细胞的诱导性多能干细胞,但是能实际应用于临床、取材便利、诱导安全的供体来源仍然具有局限性.我们从血液细胞作为供体细胞进行重编程的特点、优势及应用等方面进行了综述.
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iPS细胞技术在血液系统的研究及应用
Takahashi小组采用导入基因的方式,首次将小鼠皮肤成纤维细胞诱导成类似于胚胎干细胞的多能干细胞,称之为诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS细胞).诱导性多能干细胞不仅具有多向分化的潜能,而且因来源于机体本身而无免疫排斥,同时也无伦理问题,因而有极大的研究前景和应用潜能,有可能为血液疾病的研究提供新的思路和方法.从患者体细胞来源的iPS细胞,可用于了解遗传性疾病的发病机制并用于开发和筛选新的治疗药物;从体外培养的诱导性多能干细胞可用来诱导产生红细胞和血小板,因而是一种潜在的血细胞来源.本综述总结了诱导性多能干细胞建立的方法及其在血液疾病中的研究进展.
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多能性干细胞向红细胞定向诱导分化的研究进展
红细胞输注是临床上治疗急性失血和严重贫血的有效手段,然而目前血源紧张,因输血引起疾病传播等问题威胁着人类的健康.因此寻求安全、可靠、充足、有效的血液来源迫不及待.多能干细胞向红细胞体外分化的研究提供了一个潜在血液替代来源的选择.大量科研工作者进行了体外造血诱导的初步探索,包括定向分化体系及其效率的优化、红细胞的脱核成熟及功能鉴定、诱导型红细胞的安全性评价等.本文根据近年来这一领域的主要进展,着重对多能干细胞体外诱导分化为成熟型功能性红细胞的诱导方法以及调控机制进行综述,并对分化过程中存在的问题与挑战以及发展前景加以讨论.
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诱导性多能干细胞技术的研究进展及其应用前景
在分化的体细胞中表达转录因子可以诱导体细胞重编程,获得诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells).这些细胞具有不断的自我更新能力和多向分化潜能,这些细胞重编程领域的突破性研究进展,为细胞重编程机制、人类疾病发病机制的研究及发展新的治疗方法提供了一种强有力的工具.iPS细胞技术是当前干细胞研究领域的热点之一,近年来取得了迅猛的发展.初,研究者利用逆转录病毒作为载体将4种转录因子导入小鼠成纤维细胞诱导其重编程.近年来,iPS细胞的诱导方法不断改进,包括使用不整合入宿主细胞基因组的病毒载体、非病毒载体或者用基因敲除的方法切除导入的外源基因,从而产生了更为安全的iPS细胞系,许多小分子化合物也被证实能显著提高重编程效率.iPS细胞在再生医学、疾病模型的建立及药物筛选等领域正逐渐显现出它巨大的应用价值.本文回顾过去几年iPS细胞技术的研究进展,包括诱导方法的改进、iPS细胞诱导效率的提高和安全性的提高,并探讨iPS细胞的临床应用前景及当前研究存在的问题.
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体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干/祖细胞的研究
本研究探讨体外诱导人诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)分化为造血干/祖细胞的能力.在体外用小鼠骨髓基质细胞OP9与人类iPSC共培养的方法,将iPSC诱导分化为造血干/祖细胞;用流式细胞术检测造血干/祖细胞表面标志物的表达水平;用实时定量PCR检测分化过程中iPSC及造血干/祖细胞的相关基因mRNA表达水平的变化;用免疫磁珠法分离CD34+造血干/祖细胞并进行半固体集落形成实验检测细胞的集落形成能力.结果表明,iPSC与OP9细胞共培养诱导造血分化的第4天即可观察到iPSC形态变化;流式细胞术检测显示,分化得到的细胞表达已知的造血干/祖细胞相关表面标志物CD34和CD43分子.在体外分化过程中多能性的标志基因Oct4的表达逐渐下降,造血相关转录因子Gata-2的表达逐渐升高,而Runx-1的表达量则呈波浪式变化,CD34表达量逐渐升高.集落培养14 d能够得到红系集落(CFU-E),粒系集落(CFU-G),巨核系集落(CFU-M),粒-巨核系集落(CFU-GM)和混合系集落(CFU-GEMM).结论:iPSC细胞能够在体外通过与OP9细胞共培养分化为造血干/祖细胞.
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危重病多发性神经病患者诱导性多能干细胞系的建立及向神经细胞的诱导分化
目的 利用危重病多发性神经病(CIP)患者皮肤成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPS)系,并诱导其分化为神经细胞,为研究CIP神经细胞损害机制及治疗筛选提供细胞模型基础.方法 选取临床诊断明确的CIP患者,收集患者皮肤组织,分离出皮肤成纤维细胞,对所得细胞进行原代培养,采用Millipore慢病毒转染试剂盒,将含有Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc四个基因组合的慢病毒载体转染CIP患者皮肤成纤维细胞,诱导出患者来源的iPS.并采用碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、实时定量逆转录PCR、畸胎瘤成瘤等实验对诱导的iPS进行全能性鉴定,通过抑制SMAD信号通路诱导iPS分化为神经细胞.结果 培养的iPS镜下观察表现为人胚胎干细胞样克隆形态生长,碱性磷酸酶染色阳性,iPS细胞系的内源多能基因Sox2、REX1、NANOG和OCT4基因相对表达水平远远高于它们在初始的成纤维细胞中的表达水平(t值分别为-9.020、-10.753、-13.295、-12.677,P＜0.01),且iPS高表达人胚胎干细胞标志性蛋白,移植到免疫缺陷型小鼠模型体内能够形成畸胎瘤,并具有向三胚层分化的特点,验证本实验建立的iPS具有全能性,并可成功诱导分化为胆碱能神经元.结论 成功建立了CIP患者iPS细胞系,该iPS细胞系可成功分化为胆碱能神经元,可为CIP的发病机制研究和临床治疗探索提供良好的细胞模型.
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肝衰竭的细胞治疗:距离临床有多远?
肝衰竭患者因发病急、病死率高常须肝移植.除此之外,可能替代肝移植的细胞治疗是目前研究的热点.本文概述了近年来肝细胞移植、造血干细胞移植、间充质干细胞移植的基础研究进展和临床应用现况,及肝前体细胞和诱导性多能干细胞的特点和临床应用前景.
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诱导性多能干细胞治疗小鼠肝损伤的初步研究
目的：了解诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，IPS细胞）对肝细胞损伤的治疗作用。方法取健康雄性C57小鼠28只，分为健康对照组、实验组和实验对照组。实验组小鼠腹腔内注射2500 mg/kg氨基半乳糖造小鼠肝功能损伤模型，造模2天后在实验组小鼠尾静脉注射CFSE荧光标记后的IPS细胞。在注射IPS细胞后5天、10天、15天和20天时，健康对照组、实验组、实验对照组各取两只小鼠处死，取肝脏标本，分别行冰冻切片显微镜观察荧光，石蜡切片行HE染色，取血行生物化学检查。结果 IPS细胞注射入小鼠体内后，可在小鼠肝脏定植，注射IPS细胞的小鼠血中ALT、AST下降速度较未注射IPS细胞的小鼠明显加快。肝脏病理损伤恢复情况较未注射IPS细胞的小鼠明显改善。结论 IPS细胞注射入肝功能损伤C57小鼠体内，可对小鼠的肝功能损伤有一定的修复作用。
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慢病毒介导的miPSC－EC YAP基因过表达及稳定感染细胞系的建立
目的：建立稳定过表达Yes 相关蛋白（YAP）的小鼠诱导性多能干细胞来源的内皮细胞（miPSC－EC）系，为 miPSC－EC 过表达 YAP 基因的体内外实验研究奠定基础。方法将模板质粒（pCMV－Flag－YAP2－5SA）改建成慢病毒表达质粒（pPGK－2Flag－YAP2－Puro）；将慢病毒表达质粒与包装质粒组成共包装系统转染293FT细胞；包装慢病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，测定滴度。诱导miPSC分化为EC，观察其形态特征，并行组织化学鉴定。包装好的慢病毒感染miPSC－EC，嘌呤霉素筛选稳定感染的细胞系 miPSC－EC／YAP，并用 RT－PCR 及 Western blot 方法验证。结果慢病毒表达质粒（pPGK－2Flag－YAP2－Puro）构建成功，并成功包装 YAP 基因过表达慢病毒，滴度达到1．2×109 TU／ml。miPSC诱导分化所得细胞符合EC 形态特征，几乎都表达EC 标志CD31。转染YAP的miPSC－EC 中YAP mRNA表达水平较未转染细胞明显升高，YAP蛋白高表达（未转染细胞中YAP蛋白几乎不表达）。结论成功构建YAP基因慢病毒过表达载体，诱导miPSC分化为EC，成功建立YAP基因稳定感染细胞系miPSC－EC／YAP。
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经诱导的绿色荧光蛋白转基因C57BL雄鼠脾细胞移植重建雌鼠造血功能研究
目的 探讨雄性C57BL绿色荧光蛋白(GFP)鼠诱导的脾细胞移植对造血衰竭小鼠造血重建的作用.方法 建立小鼠造血衰竭模型,移植鱼卵提取物诱导的雄性C57BL荧光鼠脾细胞,检测诱导后细胞的干细胞标志抗原表达;观察受体存活时间,检测外周血白细胞计数、外周血GFP阳性细胞,进行荧光原位杂交检测Y染色体;各组受体脾和肺切片观察GFP细胞分布.结果 鱼卵提取物诱导的雄性C57BL荧光鼠脾细胞比未诱导的脾细胞表达更多的干细胞标志抗原.1×106个脾细胞经尾静脉回输经致死剂量照射的雌性小鼠,明显延长小鼠存活时间,提高小鼠外周血白细胞计数.诱导组受体外周血中检测到GFP阳性细胞,骨髓中检测出60%的细胞含Y染色体.诱导组受体脾和肺切片观察到GFP阳性细胞分布.结论 鱼卵提取物诱导的小鼠脾细胞中含较多的多能干细胞,回输给造血衰竭小鼠能重建其造血功能.
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iPS细胞技术在HIV研究和治疗中的应用
诱导性多能干细胞(iPS细胞),在其被发现的十余年来,得到了迅猛的发展,并广泛应用于多个领域的研究工作中.iPS细胞技术在功能研究、疾病模型、基因治疗等方面具有重要作用.近年来,iPS细胞技术在艾滋病病毒(HIV)研究和治疗方面的应用层出不穷.利用iPS细胞平台,学者们在HIV的CCR5和CXCR4等受体的研究以及细胞治疗等策略的探索中都取得了显著的成果.不仅如此,类似于"柏林病人",有学者提出利用经基因修饰后,自体同源造血干细胞对艾滋病病人进行干细胞骨髓移植,而iPS细胞及重编程技术使该设想更具有可行性.文章对iPS细胞技术在HIV相关的研究和治疗领域的应用进展进行综述.
