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不同来源神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血损伤
背景:脑缺血导致神经功能障碍的根本原因是神经元损伤,促进神经元再生是神经功能恢复的关键,而内源性神经干细胞的修复作用有限,外源性神经干细胞移植为脑缺血后组织重构与功能恢复带来希望,但种子细胞的选择仍缺乏系统的比较研究.目的:比较3种不同来源神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血损伤的效果.方法:分离培养SD大鼠脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和皮肤来源的诱导性多能干细胞,在体外进行神经向诱导分化7 d检测神经干细胞的转化率.取脑缺血损伤模型造模成功的100只SD大鼠,随机分为模型组、骨髓间充质干细胞来源组、诱导性多能干细胞来源组、脂肪间充质干细胞来源组和磷酸盐缓冲液组,每组20只,移植相应的细胞悬液或磷酸盐缓冲液;另随机取20只SD大鼠为假手术组,20只SD大鼠为对照组,不进行细胞移植.细胞移植后1周和4周进行各项指标检测.结果与结论:①体外诱导分化7 d后,诱导性多能干细胞来源的神经干细胞的转化率明显高于脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞,差异有显著性意义(P<0.01);②移植1周和4周后,移植不同来源神经干细胞的大鼠神经元凋亡数量和脑梗死体积明显小于磷酸盐缓冲液组和模型组(P<0.05),诱导性多能干细胞来源组神经功能缺损评分、脑梗死体积和神经元凋亡数量明显低于脂肪间充质干细胞来源组和骨髓间充质干细胞来源组(P<0.05);③移植4周时,各组大鼠神经功能缺损评分、神经元凋亡数量和脑梗死体积明显低于移植1周(P<0.01);④移植神经干细胞3组大鼠纹状体神经元胞质内尼氏体数量较对照组和假手术组明显增多;⑤研究结果表明,3种来源的神经干细胞均能明显改善神经缺损症状、缩小缺血区域的脑梗死面积、减少神经元变性和凋亡的数量,特别是诱导性多能干细胞具有更高的分化能力和更好的移植效果.
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自体来源诱导性多能干细胞移植治疗小鼠慢性乙型肝炎性肝损伤
背景:自体来源诱导性多能干细胞移植改善肝组织结构与功能是慢性乙型肝炎性肝损伤治疗的新研究方向.目的:观察自体皮肤来源诱导性多能干细胞移植治疗HBV转基因小鼠慢性肝损伤的效果.方法:用腹腔注射四氯化碳建立HBV转基因小鼠(购于北京维通达生物技术有限公司)慢性肝损伤模型;造模开始注射四氯化碳第1周后,将模型小鼠皮肤成纤维细胞体外重编程为诱导性多能干细胞并进行鉴定;造模6周结束后第2天,通过门静脉途径将0.1 mL诱导性多能干细胞移植到模型小鼠肝内,对照组注射0.1 mLPBS;移植后7,14 d,冰冻切片观察诱导性多能干细胞定植情况;ELISA法检测小鼠肝功能;石蜡切片苏木精-伊红染色观察肝组织病理学变化.结果与结论:①模型小鼠皮肤成纤维细胞在体外成功重编程为诱导性多能干细胞,具有多向分化潜能;②移植后7d,实验组小鼠肝内可见荧光标记的诱导性多能干细胞;③实验组小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶、总胆红素水平低于对照组,白蛋白水平高于对照组(P＜0.05);④实验组小鼠肝脏中肝细胞变性、坏死及炎细胞浸润较对照组明显改善;⑤结果提示,自体来源诱导性多能干细胞门静脉移植可治疗小鼠慢性乙型肝炎肝损伤.
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3D培养体系下人来源诱导性多能干细胞向肝细胞的转化
背景:生物型人工肝的构建有望成为治疗急性肝衰竭的有效方法,但构建人工肝的种子细胞来源、培养模式、营养获取等方面仍存在较多难题,制约血液净化-人工肝的发展与临床应用.目的:探讨在不添加外源血清等异种来源物质的条件下将人诱导性多能干细胞诱导分化为肝细胞样细胞的可行性.方法:应用含Transwell小室的6孔板构建3D培养体系,外源添加丙戊酸和尼克酰胺对人诱导性多能干细胞进行诱导分化,并将分化的肝细胞样细胞与生物补片共培养.实验分为5组:人诱导性多能干细胞为A组、正常肝细胞为B组、不添加尼克酰胺诱导分化的肝细胞样细胞为C组、添加尼克酰胺诱导分化的肝细胞样细胞为D组、在生物外科补片上培养的肝细胞样细胞为E组.倒置相差显微镜下观察D组肝细胞样细胞的形态;免疫荧光检测D组细胞中肝细胞核因子4α和甲胎蛋白的表达;荧光实时定量PCR和Western blot检测A、B、C、D组细胞中甲胎蛋白与白蛋白的mRNA和蛋白表达;流式细胞术检测A、C、D组细胞的分化效率;免疫细胞化学检测B组和E组细胞中胆盐输出泵蛋白的表达;ELISA检测D组和E组上清液中乳酸脱氢酶活性、白蛋白和尿素氮含量.结果与结论:①D组细胞由梭形逐渐转变成多边形;②D组细胞中肝细胞核因子4α和甲胎蛋白呈阳性表达;③D组细胞中甲胎蛋白、白蛋白的基因和蛋白表达明显高于A组和C组(P < 0.01);④B组和E组细胞中胆盐输出泵蛋白呈明显阳性表达;⑤E组细胞乳酸脱氢酶活性、白蛋白和尿素氮的含量明显高于D组(P < 0.01);⑥结果表明,外源添加小分子化合物的三维培养体系和生物外科补片联合应用有助于促进诱导性多能干细胞在体外诱导分化为功能性肝细胞样细胞.
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诱导性多能干细胞治疗：移植排斥与安全性问题
背景：诱导性多能干细胞自发现以来一直是再生医学的研究热点，但人们过多地关注了它的运用性却忽略了安全性。目的：通过综述目前诱导性多能干细胞在动物移植研究中的表现，分析诱导性多能干细胞的安全性问题及可能原因，为今后的诱导性多能干细胞研究及临床运用提供参考。方法：以英文检索词为“induced pluripotent stem cels，safety，immune，immunogenicity，tumorigenicity， cancer，epigenomic，transplantation，Generation，Reprogramming，genomic，mutation”由第一作者检索2006至2014年PubMed数据库，查阅近年来与诱导性多能干细胞安全性相关的文献，进一步从Cel Press数据库和Nature数据库中获得文献全文阅读，终保留发表时间较近的28篇文献。结果与结论：诱导性多能干细胞的安全性问题正引起越来越多人的重视，免疫原性、潜在的致瘤性与表观遗传学变异问题是其临床应用的主要隐患。诱导性多能干细胞的安全性问题主要来自于重编程过程，“插入式基因操作”比非插入式操作具有更大的致瘤风险。体细胞重编程后不同程度的发生了表观遗传学变异，这些变异多与被重编程细胞的“遗传记忆”有关。
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诱导性多能干细胞在儿童神经系统疾病中的应用
诱导性多能干细胞( induced pluripotent stem cell,iPS)是类似胚胎干细胞的一种细胞类型,可以通过对多种终末分化的体细胞外源性重编程诱导分化而成,其具有多能分化的潜能,进一步诱导生成神经细胞,为研究神经发育疾病、药物筛选及个体化治疗提供了种子细胞。该文对iPS细胞的研究进展及其在儿童神经系统疾病中的应用作一综述。
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多能干细胞视网膜定向分化研究进展
在发达国家,年龄相关性黄斑变性等视网膜变性类病变是导致不可逆性视力丧失的主要原因,以视网膜色素上皮(RPE)细胞的功能障碍及损伤为病理生理学基础.目前,临床上尚无有效的逆转视网膜变性类病变视力丧失的手段,临床试验中的RPE细胞移植及基因治疗有望成为未来有效的治疗措施.胚胎干细胞(ESC)及诱导性多能干细胞(iPSC)的眼部定向分化为眼部单细胞病变类疾病的细胞移植治疗提供了可能性.本文总结了ESC及iPSC眼部视网膜细胞定向分化的研究进展,并对其未来发展前景进行初步探讨.
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体细胞重编程为诱导性多能干细胞的研究进展
诱导性多能干细胞技术构想来源于细胞核移植技术,将外源特异转录因子导入体细胞后,体细胞进行重编程,终分化为具有胚胎干细胞特性和功能的多能干细胞.诱导性多能干细胞在疾病动物模型上的应用已经取得了进展,人们已经成功建立了自体细胞治疗的疾病实验动物模型.诱导性多能干细胞的研究回避了长期以来人们对胚胎使用问题的伦理问题,为干细胞的研究提供了新的方法和理论依据,为人类疾病的治疗带来了新的希望和契机.
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利用 piggyBac 转座子构建小鼠诱导性多能干细胞及其鉴定
目的：利用 piggyBac 转座子载体携带鼠源 Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc 4个核转录因子，重编程胎鼠成纤维细胞（MEFs）为诱导性多能干细胞（iPSCs），并探讨其作用效果。方法：分离 Oct4-GFP 小鼠的MEFs，将携带鼠源 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 等4个基因的 piggyBac 转座子转入至 MEFs；观察 iPSCs 克隆形成过程的形态表现；分析 iPSCs 染色体组成，评价 iPSCs 的核型变化。RT-PCR 法检测小鼠 iPSCs 中胚胎干细胞（ESCs）相关基因 Oct4、Nanog 和 FGF4的表达；免疫荧光、碱性磷酸酶染色和流式细胞术检测小鼠 iPSCs 中SSEA-1和 Nanog 蛋白表达。将 iPSCs 接种到 NOD-SCID 小鼠腹股沟进行畸胎瘤实验，4周后取畸胎瘤制备组织切片进行 HE 染色，观察组织分化情况。结果：通过 piggyBac 转座子成功构建 iPSCs，其具有正常的核型，形态与小鼠 ESCs 相似，克隆边界清晰、呈圆形或卵圆形，克隆内细胞致密、核大。RT-PCR 和免疫荧光染色分析， iPSCs 可表达多能性基因和蛋白（Oct4、Sox2、Kif4和 c-Myc）。在免疫缺陷小鼠体内接种 iPSCs 可形成具有3个胚层组织的畸胎瘤。结论：以 piggyBac 转座子为载体将 Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc 4个转录因子基因导入MEFs，可以成功诱导 MEFs 成为具有 ESCs 特征的正常核型 iPSCs。
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诱导性多能干细胞免疫原性的研究进展
2006年,研究人员将一系列转录因子导入小鼠成纤维细胞中,诱导出了一种类似于胚胎干细胞状态的细胞,称为“诱导性多能干细胞”(induced pluripotent stem cell,简称iPS细胞).iPS细胞在具有高度自我更新和分化能力的同时,进一步避免了传统胚胎干细胞的伦理学问题,特别是该技术使于细胞自体化移植更易实现,在很大程度上推进了干细胞技术的临床应用.目前,在iPS细胞的诱导方式和诱导效率方面,已取得了较大进展,但在iPS细胞的诱导过程以及再分化过程中,细胞针对于自体的免疫原性是否发生改变,目前尚不明确.本文就近年来iPS细胞免疫原性的研究进展作一简要综述.
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利用诱导性多能干细胞技术研究环境致病因素诱导帕金森病发病的进展
帕金森病是一种十分普遍的中枢神经系统退行性疾病,以中脑黑质纹状体多巴胺能神经元丢失为主要特征,诱发因素较多.本文简述帕金森病的环境及职业致病因素和诱导性多能干细胞(iPScs)技术的研究进展,并分析了iPScs技术在研究环境、职业致病因素诱导帕金森病发病机制中的应用前景,提出了将iPScs技术应用于研究帕金森病的发病机制具有重要意义.
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小鼠诱导性多能干细胞移植治疗宫内缺氧新生鼠脑损伤
目的:研究小鼠诱导性多能干细胞(iPSCs)移植对宫内缺氧新生鼠脑损伤的治疗作用及机制.方法:于孕14d开始孕鼠置于动物缺氧培养箱中,制作胎鼠宫内缺氧模型.孕鼠分娩后新生鼠经侧脑室注入BrdU标记的iPSCs悬液移植组和PBS缺氧组,对照组不治疗,H-E染色观察脑组织形态学变化、八臂迷宫测试动物记忆功能、免疫组织化学检测脑BrdU阳性细胞和神经颗粒素(Ng)和神经元烯醇化酶(NSE)的表达、原位杂交检测血管内皮生长因子mRNA(VEGF mRNA)的表达.结果:移植组小鼠的学习记忆能力和脑皮质区细胞结构较缺氧组均明显改善;脑切片检出BrdU阳性细胞存在,缺氧组Ng和NSE阳性细胞表达较对照组显著减少,而VEGF mRNA的表达较对照组显著增加;移植组Ng、NSE和VEGFmRNA表达均较缺氧组显著增加.结论:小鼠iPSCs移植于宫内缺氧的新生小鼠脑中,可减轻缺氧神经元的损伤和提高学习能力,其机制可能通过上调VEGF mRNA和Ng的表达有关.
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诱导性多能干细胞在心血管系统中的作用
诱导性多能干细胞(iPS)是一种类似胚胎干细胞的新型干细胞.iPS细胞可以从各种不同动物的不同体细胞转化而来,它可以分化为心房肌、心室肌、血管以及传导系统的细胞.iPS细胞或由iPS细胞分化来的心肌细胞可用来治疗心肌梗死.通过iPS技术建立细胞模型可研究长QT综合征(LQTS)、Brugada综合征、致右室心律失常性心肌病(ARVC)等遗传性心脏病的发病机制.
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NOD鼠来源诱导性多能干细胞系的建立及其鉴定
利用逆转录病毒将Oct4、Sox2、Klf4 三个干细胞基因导入NOD鼠尾成纤维细胞,将其诱导为多能干细胞,通过形态观察、干细胞标志检测及多能性分析等方面对其进行鉴定,结果表明该NOD鼠来源诱导性多能干细胞具有类似胚胎干细胞( embryonic stem cells,ES)的特性,表达ES相关基因及蛋白,具有多向分化潜能.来源于NOD鼠体细胞的诱导性多能干细胞有助于构建研究1型糖尿病的体外疾病模型.
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诱导性多能干细胞及体细胞转分化技术治疗多发性硬化的研究进展
生于青壮年，是成人神经性致残的主要原因。传统治疗仅能延长疾病的缓解期，并不能多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，多发彻底治愈。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）具有干细胞的分化全能性，在 MS 细胞替代疗法中具有广阔的应用前景；而体细胞转分化技术相较于传统的 iPSCs 分化成少突胶质细胞谱系，缩短了时间窗，为 MS 治疗提供了一条新思路。随着获取神经干细胞和少突胶质细胞效率和质量的提高，未来的 MS 细胞治疗将有望取得重大的突破。
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诱导性多能干细胞的研究进展
胚胎干细胞(embryonic stem cell.简称ES细胞)和成体干细胞(adult stem cell,简称AS细胞)是干细胞研究的两个主要领域[1,2].相比而言,ES细胞是全能干细胞,但存在免疫排斥和伦理学争论;而AS细胞则避免了上述缺陷日渐成为主流.
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体外诱导人iPS细胞向肾脏细胞定向分化的实验研究
目的 探讨人诱导性多能干细胞(iPS)体外定向分化为肾脏细胞的方法,为应用干细胞进行肾脏再生治疗奠定实验基础.方法 以正常人iPS细胞为实验对象,运用生肾因子活化素A(Activin-A)、骨形成蛋白7(BMP7)、人血管内皮生长因子(hVEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、锂盐、维甲酸(RA)等细胞因子联合肾脏上皮细胞培养液对iPS进行定向诱导肾脏细胞分化,分别于诱导后第14、21和28日,细胞免疫荧光染色及Real-Time PCR检测肾脏发育相关蛋白Brachyury (Bry)、Paired box gene 2(Pax2)、水通道蛋白1(AQP1)和E-钙粘素(E-cad)蛋白及mRNA的表达水平,RT-PCR检测分化各阶段多能性基因Nanog和OCT4的表达水平.结果 诱导培养液分别诱导14、21和28 d后,细胞免疫荧光染色观察发现;分化后的细胞分别表达Bry、Pax2、AQP1和E-cad蛋白,而在未分化的iPS细胞中未见表达.Real-Time PCR结果显示:诱导后细胞中Bry、Pax2、AQP1、E-cad mRNA的表达分别较未分化的iPS细胞上调了4、30、37和25倍(P＜0.05),分化各阶段多能性基因OCT4和Nanog的表达水平逐渐下调(P＜0.05).结论 细胞因子联合肾脏上皮细胞培养液可有效诱导人iPS细胞定向分化为肾脏细胞.
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多能干细胞与肾脏再生的研究进展
虽然肾脏移植术为肾功能不全晚期患者提供了一种有效的治疗策略,但尚存在供体器官有限、免疫排斥反应和终身服用免疫抑制剂等缺陷.多能干细胞具有无限自我增殖能力及在体内分化成为多种类型细胞的特点,尤其是胚胎干细胞和诱导性多能干细胞可分化为人体内的任何一种细胞,在组织、器官再生方面显示出良好的应用前景.该文主要对多能干细胞在肾脏再生方面的研究进展进行综述.
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大鼠诱导性多能干细胞向神经前体细胞诱导分化研究
目的 探讨大鼠来源的诱导性多能干细胞(iPS细胞)向神经前体细胞(NPC)定向诱导分化的方法.方法 在大鼠iPS细胞培养到悬浮类胚体阶段加入维甲酸(RA)诱导分化,对分化获得的细胞,分别通过免疫荧光染色和实时定量PCR方法检测NPC标志物、用BrdU免疫荧光染色检测其增殖能力、并通过大鼠视网膜下腔移植对其存活、整合情况及分化能力进行检测.结果 经诱导分化获得的细胞能够在贴壁培养条件下形成Rosette结构、表达NPC标志物并且绝大多数呈BrdU阳性,移植到大鼠视网膜下腔后能分化为神经元和胶质细胞.结论 大鼠iPS细胞能够通过悬浮EB加RA诱导的方法分化为NPC,有可能作为细胞移植治疗视网膜退行性疾病的供体细胞.
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生物钟基因Clock对小鼠诱导性多能干细胞分化的影响
目的 研究生物钟基因Clock对小鼠诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)非定向分化的作用.方法 将Teto-FUW-OSKM、M2rtTA、PsPAX2和PMD2.G4种质粒共转染293FT细胞,收集病毒上清,转染小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF)获得小鼠iPSC,并通过检测多能性基因表达及其体外分化能力对小鼠iPSC进行鉴定;通过RT-PCR检测小鼠iPSC在非定向分化和拟胚体形成过程中生物钟基因的表达,以及生物钟基因Clock下调后,与野生型细胞相比小鼠iPSC多能性基因的表达和形态学改变.结果 通过慢病毒感染MEF的方式获得了小鼠iPSC;小鼠iPSC在非定向分化过程中,生物钟基因Clock、Per2、Rev-erbα表达升高;生物钟基因Clock下调后,小鼠iPSC分化能力下降,多能性基因Sox2、Oct4、Klf4表达升高.结论 生物钟基因Clock对小鼠iPSC的非定向分化起到重要作用.
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诱导性多能干细胞与神经系统疾病模型的构建
利用外源性转录因子将已分化成熟的细胞诱导为多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)对构建神经发育性和神经退行性疾病的体外模型具有重要意义.从患有特定疾病或具有明确遗传基因异常的患者身上获取体细胞进行诱导建立的iPS细胞具有潜在的疾病原特质,这种疾病特异性iPS细胞可以用来研究疾病的发病机制和病理过程,也为药物筛选、药物毒性检测以及个体化治疗方案的制定提供了可能.本文概述了目前用于建立神经系统疾病模型的干细胞类型,重点讨论了利用iPS细胞技术建立脊髓性肌萎缩症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和帕金森病等常见中枢神经系统疾病模型和药物干预的新进展,并对该研究领域所面临的问题进行了详尽的分析.
