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以膜融合脂质体为载体治疗肿瘤的研究进展
本文介绍了膜融合脂质体的膜融合机制、制备及其在近几年来肿瘤治疗方面的研究进展,研究显示膜融合脂质体具有制备方法简单,不良反应小,有融合特性等特点,作为一种新型的载体系统,在肿瘤治疗方面有着广阔的发展前景.
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四种消毒剂对仙台病毒的灭活效果
目的 观察4种化学消毒剂对仙台病毒的灭活效果.方法 采用Klein-Defors悬浮灭活与感染试验方法进行了实验室研究.结果 用含有效碘30 mg/L的碘伏消毒液,2000 mg/L过氧乙酸溶液,含有效氯30 mg/L的复方二氯异氰尿酸钠以及含1000 mg/L苯扎溴铵消毒液对悬液内仙台病毒作用5 min以上,杀灭率均可达到100%.结论 上述4种常用化学消毒剂在较低浓度条件下,可以快速灭活仙台病毒,为使用化学消毒剂对环境中污染仙台病毒进行消毒提供了参考依据.
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CMV与T7启动子对仙台病毒微小基因组拯救效率的比较
构建一种以分泌型荧光素酶基因(Gluc)作为报告基因的仙台病毒BB1株微小基因组质粒,比较了CMV启动子与T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率.首先设计并合成锤头状核酶序列,仙台病毒trailer、L基因非编码区、N基因非编码区和leader序列以及丁型肝炎病毒核酶序列,插入含有CMV和T7双启动子的质粒pVAX1中,获得仙台微小基因组的通用型载体pVAX-miniSeV.将Gluc基因插入pVAX-miniSeV中,分别获得正向插入的仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV-Gluc(+)和反向插入的pVAX-miniSeV-Gluc(-).用pVAX-miniSeV-Gluc(+)转染BHK21细胞能在上清中检测到高水平的Gluc活性,表明其中的CMV启动子具有正常转录功能.将pVAX-miniSeVGluc(-)和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒共转染BSR T7/5细胞(稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK-21细胞)检测到Gluc的高效表达,表明pVAX-miniSeV-Gluc(-)能够被有效拯救；但在BHK-21细胞中却未检测到Gluc的有效表达,提示该载体中的CMV启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率可能没有明显作用.为了进一步了解CMV与T7启动子各自对于仙台病毒微小基因组拯救的作用,本研究又构建了单独含有CMV或T7启动子的仙台病毒微小基因组载体pCMVminiSeV-Gluc(-)和pT7-miniSeV-Gluc(-).将这两种载体和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒分别共转染BSR T7/5细胞,结果pT7-miniSeV-Gluc(-)共转染组检测到了Gluc的高效表达,而pCMV-miniSeV-Gluc(-)共转染组未检测到,证实了通用型载体pVAX-miniSeV中仅T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救起了关键作用,而CMV启动子作用不明显.本研究成功构建了一种通用型双启动子仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV,并证明了T7启动子系统对仙台病毒微小基因组拯救的关键作用.本研究为下一步构建仙台病毒全基因感染性克隆打下了基础.
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新分离的副粘病毒Tianjin株的全基因组序列分析
副粘病毒Tianjin株是一株对普通棉耳狨猴具有高致病性,并可能与人类下呼吸道感染密切相关的毒株.为了明确其基因结构、变异特点及种系进化地位,采用RT PCR、测序和拼接,获得了副粘病毒Tianjin株全基因组序列,与GenBank登录的副粘病毒科7个属和尚未分类的28株病毒及7株仙台病毒代表株,进行同源性比较及系统进化分析.结果表明,副粘病Tianjin株属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、呼吸道病毒属,与仙台病毒关系近.基因组全长及组成规律与仙台病毒相似,只是L基因末尾A15240C变异而使L蛋白增加了一个谷氨酸残基.副粘病毒Tianjin株存在440个独特的核苷酸变异位点,导致110个氨基酸残基的改变,系统进化上构成独立的分支.副粘病毒Tianjin株在基因组序列、宿主亲嗜性和致病性等方面与已知仙台病毒存在较大的差异,可能代表仙台病毒的一个新基因型.
关键词： 副粘病毒Tianjin株 仙台病毒 同源性比较 系统进化分析 -
仙台病毒BB1株6个编码基因的克隆及表达
在仙台病毒BB1株全基因组序列测定的基础上,用反转录和PCR方法获得了核蛋白基因(N),磷蛋白基因(P),神经血凝素基因(HN),基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)和聚合酶蛋白基因(L)等6个编码基因全长克隆;测序结果表明,其序列与Genbank中登录的序列(DQ219803)完全一致.为了提供仙台病毒基因组载体拯救和包装所需的反式作用蛋白,将N、P、M、F、HN和L分别克隆到腺病毒穿梭表达载体pDC316上,将它们分别与腺病毒基因组质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,获得了6种复制缺陷性重组腺病毒Ad5-N、Ad5-P、Ad5-M、Ad5-F、Ad5-HN和Ad5-L,酶切结果表明6种重组腺病毒穿梭质粒构建正确;用PCR方法证明所获得的6种重组腺病毒分别携带了上述6个编码基因;用重组腺病毒感染LLC-MK2细胞后用Western blotting和免疫荧光方法检测到了相应仙台病毒编码基因的表达.本研究为仙台病毒BB1株全长基因组的拼接和病毒载体包装系统组建打下了基础.
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仙台病毒BB1株基因组cDNA序列测定及比较分析
该研究对仙台病毒BB1分离株的cDNA全序列进行测序,通过RT-PCR法获得的4个相互重叠的质粒克隆覆盖了全长基因组,并将BB1全长序列与其它已知的仙台病毒序列进行比较.BB1株病毒的基因组为15 384个碱基构成,与其它已知仙台病毒基因组的基因排列与组成规律是一致的,未发现插入或缺失突变.与现已公布5个仙台病毒代表株全基因组序列比较发现,BB1株与其它仙台病毒株同源性均有较大差异.遗传进化分析结果显示,BB1株与Z株和Hamamatsu株的同源性仅为87%和91%,不属于这两株代表的进化分支而归属于第三个基因型.
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梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织来源iPSCs系的建立
目的 利用梗阻性无精子症(OA)和非梗阻性无精子症(NOA)患者的睾丸组织建立诱导性多能干细胞(iPSCs)系,比较两者建系过程有无差别.方法 分别取3例OA患者和特发性NOA患者5～6 mm3的睾丸组织,组织块培养方法进行原代培养,传至3～4代转染仙台病毒,待细胞增殖满后转移至饲养层细胞上继续培养,第21～22天挑取克隆,建立iPSCs系并进行多能性和分化能力的鉴定.结果 两株iPSCs系均成功建立,建系过程无明显差异,碱性磷酸酶(AP)染色均为阳性;八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定基因相关蛋白2(SOX2)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、肿瘤排斥抗原-1-60(TRA-1-60)的免疫荧光染色均为阳性;小鼠体内的畸胎瘤实验也表明获得的两株iPSCs系具有向3个胚层分化的潜能.结论 利用仙台病毒非基因整合方法,OA患者和特发性NOA患者的睾丸组织均能建立iPSCs系.
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副粘病毒Tianjin株基因组3'和5'末端序列测定及分析
目的 测定副粘病毒Tianjin株基因组3'和5'末端序列,分析其前导区一级及二级结构与功能的关系. 方法 从感染病毒的鸡胚尿囊液中提取总RNA,利用cDNA末端快速扩增(RACE)法分别扩增基因组3'和5'端cDNA片段,并克隆至pGM-T载体中,然后分别测定插入片段的核苷酸序列,用DNAStar软件将测得的3'和5'端前导区序列与GenBank中选取的6株仙台病毒代表株相应序列进行相似性比较及序列比对,用RNAdraw软件预测基因组3'和5'端前导区二级结构并进行比较分析. 结果 副粘病毒Tianjin株基因组3'和5'末端非编码区长度分别为119和142个核苷酸,前导区核苷酸序列与6株仙台病毒基因组的相似性分别在89.1%～96.4%和93.0%～96.5%,二级结构与选取的已知仙台病毒株高度相似而且稳定. 结论 副粘病毒Tianjin株基因组3'和5'端前导区序列相对保守,可能与病毒复制、转录调控及致病性有关.
关键词： 副粘病毒 仙台病毒 3'和5'端前导区 cDNA末端快速扩增法 二级结构 -
仙台病毒基因结构与功能的研究进展
仙台病毒(SeV)是引起啮齿类动物呼吸道疾病的病原,属于副粘病毒科,单股负链RNA病毒.本文就组成SeV的基因结构和功能做一综述.
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一株致普通棉耳狨猴严重下呼吸道感染的副粘病毒种系进化分析
目的 探讨副粘病毒Tianjin株的种系进化地位.方法 将副粘病毒Tianjin株HN核苷酸、氨基酸序列与GenBank发布的副粘病毒相应序列进行比较,构建种系进化树,阐明副粘病毒Tianjin株在副粘病毒科中的分类地位.结果 基于HN核苷酸序列的种系进化分析表明,副粘病毒Tianjin株属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、呼吸道病毒属,与仙台病毒亲缘关系近.Tianjin株与仙台病毒BB1株HN核苷酸、氨基酸序列同源性分别为94.8%、95.1%,与其他仙台病毒,在84.8%～88.7%和89.6%～91.7%之间.Tianjin株与BB1株HN核苷酸序列的差异明显大于同一进化分支内的仙台病毒之间的差异.Tianjin株HN蛋白存在18个独特的氨基酸残基变异.结论 结合种系进化分析结果、病毒的宿主来源和致病特点,提示副粘病毒Tianjin株不属于仙台病毒现有的3个进化分支而自成独立的一支.
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副粘病毒Tianjin株F基因克隆及序列分析
目的 探索副粘病毒Tianjin株的来源和种系进化地位.方法 以副粘病毒Tianjin株基因组RNA为模板,通过RT-PCR方法获得包括F基因全长的两个质粒克隆,分别进行序列测定.将拼接得到的F基因核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与GenBank中公布的15株仙台病毒相应序列进行同源性比较,并构建系统进化树.结果 副粘病毒Tianjin株与15株仙台病毒F基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别在85.3%～94.5%和90.4%～95.4%之间.进化树分析表明,Tianjin株与仙台病毒BB1株亲缘关系较近,但仍有一定差距,与其他仙台病毒株关系较远.结论 副粘病毒Tianjin株很可能不属于仙台病毒现有的Ohita株、Z株及BB1株所代表的3个进化分支,而是独立于这3个分支之外.
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膜融合脂质体给药系统的研究进展
膜融合脂质体是在传统脂质体基础上引入具有融合特性的病毒而形成的一种新的给药系统,它是介于病毒与非病毒性载体之间的杂合体,本文主要对膜融合脂质体给药系统的构建、特点、药物转运的机制及其作为给药系统的研究作一综述.
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阳离子膜融合脂质体介导反义寡核苷酸在Hela细胞中的转染实验研究
目的研究阳离子膜融合脂质体(CFL)介导反义寡核苷酸(ASON)的细胞转染效率及影响因素.方法逆相蒸发法制备3种不同阳离子含量的脂质体(CL),在CL上引入仙台病毒形成CFL,将制得的阳离子膜融合脂质体与反义寡核苷酸混合得到复合物,考察形态学及载药量,用MTT法考察该载体的细胞毒性,流式细胞仪测定阳性细胞百分率和平均荧光强度.结果制得的CFL形态均匀,粒径为(168±65) nm.载药量随着磷脂/ASON(+/-)电荷比增加而增加.CFL细胞毒性明显低于相同电荷比的CL,细胞转染效率是随阳离子含量、磷脂/ASON(+/-)电荷比增加而增加,血清和低温均对CFL的细胞转染有影响.结论阳离子膜融合脂质体作为载体在低电荷比条件下可降低细胞毒性并可提高细胞转染效率,可作为该ASON的给药系统而进一步研究.
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仙台病毒载体的研究与应用进展
仙台病毒(Sendai virus,SeV)属于副粘病毒科呼吸道病毒属,基因组为不分节段的单负链RNA,编码NP,P,M,F,HN,L等11个蛋白.应用反向遗传学构建的仙台病毒载体是新兴的RNA病毒载体,由于其宿主范围广、表达量高、胞质表达、安全性好等诸多优点,目前广泛用于基因治疗药物和疫苗研究.本文从仙台病毒的基因组分子结构、致病性和免疫原性、载体的构建和类型以及其应用等方面进行详细论述.
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阳离子膜融合脂质体的细胞转染机制及其保护作用
目的探讨阳离子膜融合脂质体(CFL)介导反义寡核苷酸(ASON)的细胞转染机制和抗核酸酶的作用.方法用流式细胞仪检测不同转染条件下,阳离子膜融合脂质体(CFL)介导反义寡核苷酸(ASON)细胞摄取的情况,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测阳离子膜融合脂质体对反义寡核苷酸的保护作用.结果在转染4 h后,细胞内总荧光强度已达峰,此时CFL/ASON细胞摄取效率约为游离ASON的30倍.在低能量(4℃)或有溶酶体酶抑制剂(氯喹)的条件下,细胞内的荧光强度未发生明显改变,可推测阳离子膜融合脂质体介导的细胞转染机制主要是融合而非内吞途径.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳证实阳离子膜融合脂质体具有保护ASON的抵抗核酸酶降解的作用.结论阳离子膜融合脂质体有望成为ASON理想的传递系统.
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膜融合脂质体作为疫苗载体的研究进展
目的对病毒-脂质体融合形成的膜融合脂质体的融合机制、制备方法、抗原导入、抗原呈递及其作为疫苗导入载体的研究进展做一分析和总结.方法总结近几年来有关方面的文献.结果膜融合脂质体可以将抗原导入到细胞质中,并诱发强烈的CTL反应.膜融合脂质体的融合为融合蛋白的空间结构发生变化所致.结论膜融合脂质体是一种非常有发展前景的抗原导入载体.
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膜融合脂质体为载体的黑色素瘤疫苗的研究
目的制备膜融合脂质体为载体的黑色素瘤疫苗,并评价免疫小鼠所产生的细胞免疫和体液免疫.方法从B16黑色素瘤中提取混合蛋白质作为抗原,将其包封在脂质体中并与仙台病毒融合形成的膜融合脂质体,制成疫苗.考察膜融合脂质体的形态及粒径分布,测定小鼠免疫后的细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应活性及血浆中总的IgG的浓度.结果以普通脂质体为载体或游离的蛋白质制备的疫苗只能产生体液免疫反应而不能诱发细胞毒T淋巴细胞反应;以膜融合脂质体为载体的疫苗既可产生体液免疫又可诱发强烈的CTL反应(P＜0.001),并能抑制肿瘤细胞的生长.结论膜融合脂质体是一种有效的肿瘤疫苗载体.
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阳离子膜融合脂质体包裹DNA体外转染和稳定性研究
目的研究阳离子膜融合脂质体包裹DNA的体外稳定性以及体外细胞转染.方法采用表达E.coil β-半乳糖苷酶的pSV40β报告基因质粒及组化染色评价阳离子膜融合脂质体的转染效率.用DNase 1 考察阳离子膜融合脂质体的体外稳定性.结果当阳离子膜融合脂质体(CFL)及阳离子脂质体(CL)与DNA电荷比为(2∶1)时,CFL的转染效率为(42.3±4.3)%,明显高于CL的转染效率(23.9±2.1)%,且有很较高的稳定性.结论 CFL可作为载体有待进一步研究.
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仙台病毒的结构和感染动物的诊断
仙台病毒是引起啮齿类动物呼吸道疾病的病原,它是具有包膜、线性、非片段的负链RNA病毒,可通过血清学方法和分子生物学技术进行检测.
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长爪沙鼠仙台病毒(SeV)抗体ELISA检测方法的建立与应用
目的 建立长爪沙鼠仙台病毒(SeV)抗体ELISA检测方法,用于长爪沙鼠体内仙台病毒抗体的检测.方法 孵育鸡胚,接种SeV,制备鸡胚尿囊液正常抗原和SeV特异抗原,滴定酶结合物和抗原佳工作浓度,并进行特异性、敏感性、精密性、稳定性实验.结果 正常抗原、特异抗原和酶结合物佳工作浓度分别为0.1 μg/mL、2 μg/mL和1∶5 000;正常抗原、特异抗原批内变异系数分别为9.6％和8.4％,批间平均变异系数分别为9.0％和5.9％;检测灵敏度为1∶10 240;与沙鼠小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠肺炎(PVM)、呼肠孤病毒3型(Reo3)均无交叉反应.稳定性试验相对偏差小于25％.结论 建立的ELISA方法特异性、敏感性强,重复性、稳定性好,检测结果,准确、可靠.可用于长爪沙鼠体内SeV抗体的检测.
