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呼吸道病毒基因反义技术的研究进展
反义寡核苷酸是一段与mRNA特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的DNA分子.本文通过对呼吸道病毒特异性反义寡核苷酸的作用位点、序列设计、生物利用度(化学修饰、载体运用等)的讨论为抗呼吸道病毒新型药物的研究提供一条新途径.
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034 乙酰胆碱酯酶生物功能的研究进展及其应用
乙酰胆碱酯酶是主要存在于神经系统的一种水解酶,具有多种变体形式,其基本功能为催化水解神经递质乙酰胆碱.本文主要阐述了乙酰胆碱酯酶的非催化功能,如诱导轴突生长和突触形成,参与细胞迁移、粘附和凋亡,促进造血细胞形成和淀粉蛋白聚集以及影响炎症和免疫反应,与帕金森病和肿瘤也有一定的关系.乙酰胆碱酯酶这些生物功能的发现,为其临床应用提供了理论基础,尤其对阿尔茨海默病等疾病的研究有重要意义.
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c-myc反义寡核苷酸对卵巢癌细胞顺铂耐药逆转作用的研究
目的:探讨体外c-myc反义寡核苷酸(AODN)逆转人卵巢癌顺铂(DDP)耐药的可行性.方法:以卵巢癌DDP耐药细胞株COC1/DDP为研究对象,实验组通过脂质体为载体,分别将c-mycAODN、c-myc无义寡核苷酸(SODN)转染到OC1/DDP细胞内,阴性对照组细胞以同体积的培养基转染.采用计数法检测细胞增殖变化:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测DDP对细胞增殖的抑制率;RT-PCR、免疫组织化学技术分别对体外培养细胞c-mycmRNA及蛋白的表达进行检测,研究c-mycAODN逆转癌细胞耐药的作用.结果:实验组转染AODN的COC1/DDP细胞增殖被抑制;实验组转染AODN的卵巢癌细胞对DDP的敏感性提高,细胞生长抑制率高,与SODN组及阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P值均<0.05);AODN转染组COC1/DDP细胞的c-mycmRNA及蛋白表达均明显降低,与相同浓度SODN转染组、阴性对照组COC1/DDP细胞比较,差异均有统计学意义(P值均<0.05).结论:c-mycAODN能有效逆转卵巢癌细胞DDP耐药性;c-myc反义寡核苷酸可望成为一种有效的卵巢癌治疗方法.
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靶向抑制微小RNA-21提高白血病细胞对三氧化二砷的敏感性研究
目的 探讨以微小RNA-21(microRNA-21,miRNA-21)为靶标的反义核酸(AMO-miR-21)提高白血病K562细胞对三氧化二砷(As_2O_3)的敏感性及可能的作用机制.方法 利用LipofectamineTM 2000将化学合成的反义核酸转染K562细胞.MTT法检测单独使用AMO-miR-21、As_2O_3以及两者联合使用对细胞增殖的抑制作用,并计算抑制率和IC_(50);PI单染检测细胞周期及凋亡;实时定量PCR检测miRNA-21表达水平的改变;免疫荧光法检测miRNA-21候选靶基因PDCD_4蛋白表达的改变.结果 AMO-miR-21与As_2O_3联合使用后,IC_(50)从2.10 μmol/L降低到1.23 μmol/L,敏感性提高到单用As_2O_3的1.78倍;AMO-miR-21联合As_2O_3组细胞凋亡明显增加(P<0.05);单独转染AMO-miR-21可显著抑制K562细胞中miRNA-21的表达水平(P<0.01),同时抑癌基因PDCD_4蛋白表达明显增加(P<0.05).结论 AMO-miR-21与As_2O_3联合使用可提高K562细胞对As_2O_3的敏感性,为白血病的治疗提供了新的方法.AMO-miR-21通过靶向抑制miRNA-21,进而上调抑癌基因PDCD_4的表达而发挥抗肿瘤作用.
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RNAi实验技术研究进展
过去在对生物体基因功能研究时,通常利用反义寡核苷酸、核酶[1]等抑制目的基因表达,而近年来发现了一种新的诱导基因沉默的技术,即RNA干扰(RNA interference,RNAi).与其它关闭基因工具不同,RNAi是一种由双链RNA介导的特异性抑制同源基因表达的技术.由于它具有高特异性和高效性,已经广泛应用于植物、真菌、蠕虫和低等脊椎动物以及哺乳动物的基因功能研究,并且在人类基因组功能研究和基因药物研制及基因治疗等方面,有很好的应用前景.
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MMP-28反义寡核苷酸对肺癌细胞系A549生物学行为的影响
目的 探讨基质金属蛋白酶(MMP)-28反义寡核苷酸(AODN)对人肺癌细胞A549生物学行为的影响.方法 人工合成MMP-28反义寡核苷酸基因,转染至A549细胞,通过半定量RT-PCR和Western blot检测MMP-28 mRNA和蛋白表达;M'IT和软琼脂克隆形成实验检测细胞的增殖能力;体外侵袭实验观察细胞体外侵袭能力;裸鼠移植瘤模型观察肺癌细胞形成能力和转移潜能的改变.结果 转染48 h后,与空白对照组和SODN组相比,AODN组细胞MMP-28 mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.01);AODN组细胞增殖活性和体外侵袭能力明显下降(P<0.01);AODN组细胞移植瘤重量明显减轻(P<0.01).结论 MMP-28反义寡核苷酸可明显抑制A549细胞体内、外生长和侵袭,表明MMP-28可能成为肺癌抗侵袭治疗的分子靶点.
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不同方式给予反义寡核苷酸对培养肝癌细胞HBV基因表达的影响
为开发新型抗HBV药物,设计合成针对HBV ENⅡ(1713-1727)的反义寡核苷酸(as-ENⅡ),以不同浓度、不同作用方式作用于HepG2.2.15 细胞,ELISA检测结果表明10μmol/L的as-ENⅡ可显著抑制HBsAg、HBeAg表达,抑制率可达52.1%和40.1%.10μmol/L as-ENⅡ一次性用于HepG2.2.15 细胞后,其对HBsAg、HBeAg的抑制作用呈现双峰现象:分别在1d、5d和1d、3d,抑制作用分别为30.4%,52.1%和34.0%,40.1%.同样浓度as-ENⅡ每天反复加入HepG2.2.15 细胞,其抑制作用缓慢上升,分别在第7、6d达高峰,抑制作用分别为73.69%和73.64%.结果提示HBV ENⅡ是设计抗HBV反义寡核苷酸片段的良好靶位,并为临床设计合理用药方案提供了实验依据.
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KDR反义寡核苷酸对人血管内皮细胞的作用
VEGF及其受体KDR在肿瘤血管生成中起重要作用.我们用KDR特异性反义寡核苷酸作用于人血管内皮细胞,以阻断VEGF的自分泌作用通路,观察对细胞增殖的影响、细胞超微结构的变化及检测细胞DNA含量,测定细胞分泌VEGF的能力,并检测作用后KDR mRNA和KDR蛋白的水平.结果发现未经处理的人血管内皮细胞能分泌一定量的VEGF,KDR ASODN能抑制人血管内皮细胞内KDR基因的表达,并显著抑制细胞的增殖,在一定剂量下还可诱导凋亡.结果说明KDR ASODN能显著抑制血管内皮细胞的增殖,VEGF受体KDR在人血管内皮细胞的增殖和凋亡的调控中起重要作用.
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LMP1促鼻咽癌细胞生长与端粒酶活性
为探讨EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性的关系,用LMP1基因真核表达质粒转染鼻咽癌CNE1细胞;脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞;MTT法检测细胞增殖能力;原位杂交法检测端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达;免疫组化法检测LMP1蛋白表达.结果显示:转染LMP1基因的细胞增殖能力和hTERT mRNA表达水平均显著高于未转染和转染空载质粒的细胞(均P＜0.01).经端粒酶反义核酸作用48h,LMP1基因转染细胞的细胞增殖能力、hTERT mRNA和LMP1蛋白表达水平均显著低于空白对照组(均P＜0.01),反义核酸和脂质体处理组上述各指标无显著变化;反义核酸组LMP1基因转染细胞的增殖能力和hTERT mRNA表达水平仍均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞(均P＜0.01).以上结果提示:EB病毒LMP1的促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性密切相关.
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CT120反义寡核苷酸抑制肺腺癌细胞A549的生长
目的 探讨CT120基因与肺腺癌细胞A549生长、分化的关系.方法 构建含有CT120基因的反义表达载体(命名为pcDNA3.1-CT120),并将该载体转染肺腺癌细胞A549,应用G418筛选,获得了稳定表达CT120反义基因的克隆(命名为pcDNA3.1-CT120-A549).RT-PCR和Western blot检测CT120表达.流式细胞仪和软琼脂集落形成实验分析细胞生长,同时用RT-PCR检测P53、CyclinD1和CDK4的表达.结果 成功构建了含有CT120基因的反义表达载体,而且该载体能够有效抑制CT120在肺腺癌细胞A549中的表达.抑制CT120基因的表达能够抑制细胞的生长,促进细胞凋亡.在稳定表达CT120反义基因的克隆中P53表达明显上调,CydinD1和CDK4表达明显下调.结论 反义寡核苷酸抑制CT120的表达有可能是肺癌基因治疗的一个新的靶点.
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HBV preS2起始区反义核酸对人肝癌细胞在裸鼠体内生长的抑制作用
PCR合成互补于HBV pre-S2起始区的反义寡核苷酸(as-preS2),以HBV DNA转染的HepG2.2.15细胞接种裸鼠制备人肝癌模型,通过连续用药、一次性用药、混合用药等三种途径研究其对人肝癌裸鼠模型的抑瘤生长及体内抗HBV作用. 流式细胞术(FCM)分析asON诱导瘤细胞凋亡作用,ELLSA法检测反义核酸作用裸鼠血清中HBV抗原含量的变化.结果显示,一次性与混合用药组裸鼠均表现为成瘤潜伏期延长,成瘤率明显低于瘤细胞对照未用药组(P＜0.05),瘤体生长缓慢.裸鼠瘤内连续用药,在48h FCM测凋亡峰值为39.57%,S期细胞降低显著,生理盐水与无关序列对照分别为7.92%、10.89%,提示as-preS2可能诱导S期细胞凋亡.as-preS2对荷瘤鼠HBeAg和HBsAg的抑制率分别为45%和65%.提示,as-preS2可有效抑制体内HBV抗原表达,对人肝癌裸鼠在体内的生长有明显的抑制作用.
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端锚酶和端粒酶反义寡核苷酸联合作用对人肺腺癌细胞 A549 端粒的影响
目的 探讨端锚酶及端粒酶反义寡核苷酸联合作用对A549细胞端粒相关蛋白表达和翻译及对端粒缩短和细胞周期的作用.方法 将A549细胞随机分组为空白对照、sTANKS、shTERT、asTANKS、ashTERT 和 asTANKS+ashTERT组,经不同处理,检测 hTERT mRNA、端粒酶及端锚酶活性、端粒平均长度及A549 细胞寿命.结果 ashTERT能抑制hTERT mRNA表达及蛋白质活性;asTANKS不影响hTERT mRNA表达,却能抑制端锚酶活性.asTANKS或ashTERT均可致A549端粒长度缩短,asTANKS+ashTERT则缩短更为明显,其减少A549细胞平均传代数的作用也明显大于asTANKS或ashTERT.结论 asTANKS对A549端粒长度的抑制有别于端粒酶途径,不仅能通过影响端锚酶活性缩短肿瘤细胞 A549 端粒的平均长度,而且可与端粒酶抑制剂协同作用明显缩短肿瘤细胞的生存周期,这可能成为抗癌作用的新靶点.
关键词： 端粒长度 端锚酶 端粒酶 反义寡核苷酸 人肺腺癌A549细胞 -
反义寡聚脱氧核苷酸抑制卵巢癌细胞株SKOV3/mdr1中MDR1基因的表达
多药耐药基因(MDR1)编码的P-糖蛋白(Pgp，P-170)是导致卵巢癌化疗失败的重要原因之一。本研究将针对MDR1基因的硫代反义寡聚脱氧核苷酸导入卵巢癌耐药细胞株SKOV3/mdr1，观察其对该细胞株P170表达的影响。反义寡聚脱氧核苷酸(MDR1-AS)通过阳离子脂质体介导或单纯转染的方式导入SKOV3/mdr1细胞，将正义寡聚脱氧核苷酸(MDR1-S)同样导入细胞为对照。经以脂质体介导的1.6μmol/L MDR1-AS转染后，Pgp阳性的细胞百分数从100%降至48.7%，经过16和10μmol/L两个浓度的单纯MDR1-AS转染后，Pgp阳性细胞的百分数也从100%分别降至52.6%和86.7%。同时，利用RT-PCR检测了MDR1 mRNA水平的变化，以β-actin作为内对照，发现MDR1 mRNA水平在MDR1-AS转染后降至内对照的60%左右，而用MDR1-S转染的细胞与SKOV3/mdr1细胞比无明显变化。所以导入MDR1基因硫代反义寡聚脱氧核苷酸可以部分抑制SKOV3/mdr1细胞中MDR1基因的表达。
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脂质体转染VEGF-C反义寡核苷酸对人胃癌OCUM-2MD3细胞VEGF-C表达的影响
目的 探讨脂质体转染VEGF-C反义寡核苷酸在人胃癌OCUM-2MD3细胞中的转染效率及对VEGF-C表达的影响.方法 以VEGF-C基因翻译起始区为靶点合成反义寡核苷酸,脂质体介导转染人胃癌OCUM-2MD3细胞,荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR检测转染后VEGF-C mRNA表达水平,流式细胞术检测VEGF-C蛋白表达.结果 经脂质体介导可成功将VEGF-C反义寡核苷酸转染至胃癌OCUM-2MD3细胞,12 h达其峰值87.93%.反义组VEGF-C mRNA相对吸光度值为0.38±0.11,显著低于正义组(0.83±0.17)和对照组(0.80±0.14)(P＜0.01).反义组VEGF-C蛋白表达水平(31.26±5.17)%,较正义组(41.83±7.49)%和对照组(38.65±7.11)%亦明显下降(P＜0.01).结论 VEGF-C反义寡核苷酸经脂质体介导转染胃癌OCUM-2MD3细胞,可降低胃癌细胞VEGF-C mRNA及其蛋白表达水平.
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干细胞因子反义寡核苷酸对小鼠成纤维细胞-肥大细胞相互作用的影响
目的 探讨干细胞因子介导的成纤维细胞-肥大细胞相互作用在哮喘病理生理过程中的作用.方法 以SCF反义寡核苷酸(SCF ASON)转染成纤维细胞NIH3T3,免疫组化和RT-PCR法检测SCF的表达;从小鼠骨髓中分离肥大细胞,建立与NIH3T3共育体系,加入10 mg/L SCF ASON,通过ELISA法和荧光测定法检测上清液中组织胺和Eotaxin的含量;绘制NIH3T3和肥大细胞生长曲线;丫啶橙染色、流式细胞仪检测肥大细胞的凋亡.结果 SCF ASON可显著抑制NIH3T3产生SCF;以SCF ASON干预共培养体系后,成纤维细胞生长受抑,肥大细胞出现凋亡(14.0%±0.81%,96 h);组胺[3.08±0.38]μg/L比较(3.83±0.4)μg/L,P＜0.05]和Eotaxin的产生[(4.40±0.33)μg/L比较(5.79±0.40)μg/L,P＜0.05]减少.结论 SCF可能通过抑制肥大细胞凋亡,促进肥大细胞激活和成纤维细胞增殖,参与哮喘的发生、发展.
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PKC-α反义核酸对鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖及c-myc和c-fos表达的影响
为探讨PKC-α反义核酸对CNE-2Z细胞增殖及c-myc、c-fos表达的影响,采用脂质体(LP)介导法,用0.01～ 1.00μmol/L各浓度PKC-α反义核酸(asODN) 转染CNE-2Z;MTT法及软琼脂克隆形成法分别检测CNE-2Z生长指数(growth index, GI)及其体外增殖能力;免疫组化法检测PKC-α、及c-myc、c-fos的表达.结果表明: PKC-α asODN 0.05～1.00μmol/L各浓度组CNE-2Z GI显著降低(P＜0.05),且呈量效依耐关系;其中1.00μmol/L和0.50μmol/L PKC-α asODN对CNE-2Z生长有非常显著抑制作用(P＜0.01); 0.50 μmol/L PKC-α asODN组CNE-2Z软琼脂克隆形成率均低于对照组(P＜0.05),并可下调其PKC-α、c-Myc、c-Fos的表达(P＜0.05).结果提示:LP介导PKC-α asODN转染CNE-2Z细胞,可有效阻断CNE-2Z KC-α的表达,抑制其体外增殖能力,下调c-myc、c-fos蛋白表达;PKC-α asODN可能通过下调c-myc、c-fos表达发挥作用.
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骨桥蛋白反义核酸抑制乳腺癌细胞系增殖和诱导其凋亡
目的 观察结合于骨桥蛋白(OPN)mRNA上低自由能区域的反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对OPN基因的抑制效应,以及对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞体外增殖和凋亡的影响.方法 基于小自由能算法,针对OPN mRNA上的低结合自由能区域设计合成ASODN,转染高表达OPN的人乳腺癌细胞系MCF-7;MTT法测定细胞增殖抑制率;电子显微镜下观察细胞形态学改变;RT-PCR检测OPN mRNA水平;流式细胞术检测细胞周期及凋亡发生率.结果OPN ASODN呈时间和剂馈依赖性抑制MCF-7细胞增殖(P<0.05);经16μmol/L OPN ASODN作用72 h,细胞呈典型凋亡特征;OPN mRNA表达水平下降;反义组凋亡细胞比例显著升高(P<0.01).结论 OPNASODN在体外可抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖并诱导其发牛凋亡;利用小自由能原理来设计反义寡核苷酸是一种较为可靠的方法 .
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Caspase-3 mRNA反义核酸对γ-射线诱导的HL-60细胞凋亡的影响
目的观察caspase-3 mRNA反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞凋亡的抑制作用,筛选有效ASODN.方法用脂质体介导法将针对caspase-3 mRNA不同序列的4条ASODN导入HL-60细胞中,γ-射线照射.应用电泳法检测DNA梯状条带;Hoechst 33258-碘化丙啶染色,荧光显微镜分析凋亡细胞百分率;流式细胞术进行细胞凋亡定量.结果以caspase-3 mRNA 5'非编码区(-62至-46位)与编码起始区(-1至16位)ASODN转染,当转染终浓度≥3μmol/L时,DNA电泳梯状条带消失,流式细胞术亦未见明显的亚二倍体峰;荧光染色分析,凋亡细胞百分率比未转染对照组和错配寡核苷酸对照组显著降低(P＜O.01),且随转染终浓度的增加,凋亡抑制率显著增加.另外,5'非编码区ASODN的抑制作用显著强于编码起始区ASODN(P＜0.05). 结论 caspase-3 mRNA ASODN可抑制γ-射线诱导的HL-60细胞凋亡,其作用有序列特异性及剂量依赖性.
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端粒酶逆转录酶及c-myc基因反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性的影响
目的研究端粒酶逆转录酶(hTERT)与c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞端粒酶活性的影响,探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT和c-myc基因表达的关系.方法应用反义寡核苷酸(ASODN)分别封闭HL-60细胞hTRET与c-myc基因,RT-PCR方法检测基因表达;分别使用TRAP-ELISA法、PAGE-银染法检测细胞端粒酶活性.结果ASODN作用细胞72 h后,hTERT、c-mycmRNA的表达受到不同程度抑制,以30 μmol/L作用组表达量低.TRAP-ELISA检测:hTERTA SODN 10、20、30μmol/L作用组,c-myc ASODN 20、30 μmol/L作用组与未作用组比较,端粒酶活性明显降低(P＜0.05);c-myc ASODN 10μmol/L作用组及c-myc、hTERT SODN作用组与未作用组比较无显著差异(P＞0.05).PCR-PAGE检测:hTERT与c-myc ASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmot/L作用组条带少,而同浓度hTERT ASODN作用组较c-myc ASODN作用组条带减少. 结论hTERT与c-myc基因ASODN能够分别抑制该基因mRNA的表达,同时具有下调端粒酶活性作用.
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激活的星形胶质细胞分泌的TNF-α对大鼠离子型谷氨酸受体1表达的影响
目的探讨星形胶质细胞在癫痫发病中的作用.方法选用肿瘤坏死因子TNF-α(TNF-α)刺激及TNF-α反义寡核苷酸阻断后马桑内酯(CL)刺激纯化培养的海马星形胶质细胞,将这两种条件培养基提取液(ACM)10μl分别注入正常大鼠侧脑室,观察动物行为与脑电图的变化;用免疫细胞化学方法检测大脑皮质与海马中离子型谷氨酸受体(NMDAR1)表达水平的改变,并做显微图像分析.结果 1.侧脑室注射肿瘤坏死因子TNF-α刺激后的条件培养基提取液可引起大鼠Ⅲ级癫痫样发作及典型的尖波、棘波、棘-慢波癫痫样脑电图表现,大脑前梨状皮质和海马CA1区NMDAR1免疫反应阳性神经元数和平均光密度值均明显高于对照组;2.侧脑室注射TNF-α反义寡核苷酸阻断后由马桑内酯刺激的条件培养基提取液,大鼠无癫痫样行为发生,大脑前梨状皮质和海马CA1区NMDAR1免疫反应阳性神经元数和平均光密度值与对照组无显著性差异.结论 1.激活的星形胶质细胞分泌的TNF-α可诱导大鼠癫痫发作.2.NMDAR1表达的变化可能与癫痫发作有关.
