首页 > 文献资料
-
核酶在AIDS基因治疗中的研究新进展
利用核酶的核酸内切酶活性将核酶应用于AIDS基因治疗的研究,近几年来有了许多新的突破,本文主要在核酶作用的位点、载体选择和宿主细胞选择及提高核酶作用有效率等方面对这一领域中新的研究进展作一综述性介绍.
-
反义基因治疗乙型肝炎研究近况
反义技术为乙型肝炎治疗提供了新策略,其中反义RNA与核酶具代表性.HBV的S与C区似乎是反义RNA抗HBV的佳靶区;核酶库的构建、核酶的改造及多聚体核酶的设计促进了核酶抗HBV的研究进展.HBV感染动物模型研究有助于推动反义基因治疗乙型肝炎向临床的过渡.
-
一种缺陷病毒-丁型肝炎病毒
丁型肝炎病毒(hepatitis D virus,HDV)又称δ因子(delta agent).1977年意大利的Rizzetto首先发现.当时曾被误认为是乙型肝炎病毒(HBV)新的抗原抗体系统.1979～1980年经黑猩猩试验,证明这是一种新型病毒,需要嗜肝病毒(hepadnayirus)辅助其功能,如人乙型肝炎病毒(HHBV)或鸭乙型肝炎病毒(DHBV)帮助它穿上外套,HDV才具有完整结构的病毒颗粒功能.1984年才将这一缺陷病毒正式命名为丁型肝炎病毒.
-
靶向金属硫蛋白基因核酶的设计和T克隆载体的构建
目的为建立靶向人金属硫蛋白(MT)基因的核酶技术,设计靶向MT基因的锤头核酶(Rz),构建其T克隆载体,应用于探讨特异性下调MT表达在多阶段致癌过程细胞模型中的作用.
-
DNA氧化损伤修复基因HOGG1低表达细胞株的建立及其生物学特性鉴定
目的为研究肺癌发生机制中DNA氧化损伤修复基因HOGG1的可能作用,利用携带有HOGG1特异性锤头状核酶基因的载体与肺腺癌A549细胞株,建立HOGG1低表达细胞株并观察其生物学效应.方法 HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体[pcDNA3.1(+)-RZ]经脂质体介导转染A549细胞;G418筛选;Neo基因的RT-PCR法鉴定阳性克隆细胞;RT-PCR半定量检测核酶对HOGG1基因的抑制效应.同时比较转染细胞与正常A549细胞的生长情况、细胞周期、软琼脂克隆形成率以及超氧化物歧化酶(SOD)的活力. 结果转染后G418成功筛选出了阳性转化克隆,经传代形成稳定细胞株.核酶可持续抑制A549细胞HOGG1基因的表达,RT-PCR结果显示转染细胞HOGG1 mRNA的表达比正常A549细胞低61.5 %(P<0.05);转染后,细胞株形态无明显改变;其群体细胞倍增时间为2.05天,稍短于正常A549细胞(2.17d);细胞周期各时相及细胞凋亡率以及细胞增殖指数没有明显改变(P>0.05);软琼脂克隆形成抑制率接近50%(P<0.05);SOD活力比正常A549细胞显著增加(P<0.05).结论成功建立HOGG1低表达细胞株,所观察的生物学效应多数指标与正常A549细胞无显著差异.
-
AIDS的基因治疗
一、AIDS基因治疗的可能性:近些年来,AIDS基因治疗的研究取得了一些进展,NIH重组DNA顾问委员会(RAC)已先后批准多个HIV感染的基因治疗的临床研究方案--1993年7月批准Nobel G等人把插入Rev10基因的CD+4 T细胞用于临床研究;当年9月又批准了Greenberg PD的临床实验计划,把针对HIV-1抗原特异性的携带自杀基因的CD+8 T细胞用于过继转移治疗HIV感染;于此前后,Wang SF等人采用LNL6载体将HIV-1先导序列hairpin核酶基因导入CD+4 T细胞以研究转化细胞在患者体内的行踪方法也获批准.将表达gp160的反转录病毒重组体直接注入患者体内的基因治疗已进入Ⅰ期临床试验阶段[1].这些结果展示了AIDS基因治疗的光明前景.
-
自我剪切锤头状核酶体外切割HPV11/E2的研究
研究证实,人乳头瘤病毒(human papillo-mayirus,HPV)6型(HPV6)和11型(HPV11)的增殖是尖锐湿疣发生和复发的主要病因,其分子机制是HPV6型和HPV11型基因组DNA的复制和表达,其中HPV11早期基因组(E1、E2、E4、E5、E6和E7)的转录则是HPV11在宿主细胞中增殖的关键步骤[1].基因组转录的主要调节系统位于上游调控区(upstream regulatory regio,URR)或长控制区(long control region,LCR)中,关键性的调节蛋白是E2蛋白,大小常为45kD～48kD,以三聚体形式结合于DNA.由3个功能性结构域组成,全长E2蛋白是一个典型的反式激活蛋白,以二聚体活性形式特异性结合于上游调控区的E2结合位点AC-CGNNNNCGGT(ACCN6GCT),使HPV1 1早期基因组的转录水平提高20～100倍.
-
RNAi实验技术研究进展
过去在对生物体基因功能研究时,通常利用反义寡核苷酸、核酶[1]等抑制目的基因表达,而近年来发现了一种新的诱导基因沉默的技术,即RNA干扰(RNA interference,RNAi).与其它关闭基因工具不同,RNAi是一种由双链RNA介导的特异性抑制同源基因表达的技术.由于它具有高特异性和高效性,已经广泛应用于植物、真菌、蠕虫和低等脊椎动物以及哺乳动物的基因功能研究,并且在人类基因组功能研究和基因药物研制及基因治疗等方面,有很好的应用前景.
-
PDGF受体β亚单位2个不同切割位点核酶的体外切割效率的比较
目的研究针对大鼠PDGF受体β亚单位基因2个不同切割位点核酶的体外切割活性并加以比较.方法应用计算机对大鼠PDGF受体β亚单位mRNA二级结构进行模拟,设计针对PDGF受体β亚单位mRNA 45位CUU和252位CUU的锤头状(Hammerhead)核酶(Ribozyme)基因RZ1和RZ2,定点克隆于自我切割型核酶载体P1.5的5′-cis核酶和3′-cis核酶之间;将大鼠PDGF受体β亚单位cDNA 608 bp的PCR片段克隆于pGEM-T载体T7启动子下游,在T7启动子作用下分别体外转录成RZ1、RZ2和706 nt的PDGF受体β亚单位mRNA,比较RZ1和RZ2对706 nt的PDGF受体β亚单位mRNA的切割活性的差异.结果 RZ1在体外有较高的切割活性,而RZ2在体外无切割活性.结论提示在应用核酶技术进行基因治疗时,应选择有效的核酶切割位点,以达到有效的治疗目的.
关键词： 核酶 PDGF受体β亚单位 体外转录 体外切割 -
EV71济南分离株感染性克隆的构建及其生物学特征分析
目的 构建以济南本土分离株为模板的EV71感染性克隆,转染细胞以获得拯救病毒并观察其生物学特性,为研究EV71病毒基因结构和功能奠定基础. 方法 分段扩增EV71基因组cDNA并顺序连接至pCDNA3.1载体,同时在序列两端引入自剪切核酶序列,构建能直接转染细胞的病毒基因组全长cDNA克隆,转染RD细胞后获得拯救病毒.通过噬斑形成试验、间接免疫荧光试验和感染性滴度测定观察拯救病毒的生物学特征. 结果 成功构建了病毒基因组全长cDNA克隆,转染RD细胞后观察到典型细胞病变,收获的病毒经RT-PCR扩增出特异性目的片段,全序列测定结果表明拯救病毒与父本株相比具有3个同义突变,未导致推导氨基酸的变异;拯救的子代病毒感染RD细胞后形成典型的空斑;间接免疫荧光试验检测拯救病毒感染细胞可见特异性荧光,荧光密度较父本株病毒稍弱;拯救病毒传代稳定,其感染性滴度(103.48)较父本株(10-5.0)稍低. 结论 成功构建了真核载体的病毒全长cDNA感染性克隆,拯救病毒与野生株具有相似的生物学性状和感染性.
-
丁型肝炎病毒核酶反式切割HBV mRNA片段的实验研究
目的探讨反式作用丁型肝炎病毒(HDV)核酶体外切割乙型肝炎病毒(HBV) mRNA片段的可行性.方法将化学合成的核酶cDNA克隆到含有T7启动子的载体PGEM-4Z中.利用体外转录技术转录出核酶及底物,研究其体外切割活性.利用E-H作图法进行核酶的酶促动力学研究.结果在体外实验中显示两酶均能成功的将底物切割,37℃温浴90 min的切割百分率为50%和51%.利用E-H作图法进行的酶促动力学研究中求得Rc1、Rc2的Km值分别为0.61 μmol/L、0.58 μmol/L,Kcat值分别为:0.64*min-1、0.60*min-1.结论反式作用HDV核酶对非HDV底物-HBV mRNA片段的成功切割为寻找新的HBV的反义抑制手段开辟了途径.
-
核酶在细胞外切割HCV核心区RNA的研究
目的研究核酶在细胞外切割HCV的作用。方法设计核酶cDNA序列。构建核酶重组质粒及HCV核心区基因cDNA重组质粒。分别进行体外转录，并加入γ-32P ATP以标记HCV RNA。将核酶RNA、HCV核心区RNA、RNA酶抑制剂及反应缓冲液混合温育，以核酶RNA切割HCV RNA。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影来分析结果。结果β-半乳糖苷酶表型筛选均可见蓝色及白色菌落生长；核酶重组质粒直接测序结果见预期核苷酸序列；HCV重组质粒限制性酶切分析见410bp条带。核酶切割反应显示：反应时间为15和30*!min时可见453、307、146nt 3条带；反应时间为60min时仅见307及146nt 2条带。结论核酶重组质粒构建成功，所设计核酶对HCV有切割作用。
-
乙肝病毒特异性核酶的构建及体外切割活性的初步研究
设计针对HBV复制中间体mRNA的核酶,用于抗病毒治疗是国内外的一个研究方向.利用重组PCR技术合成了核酸基因(简称RZ),并克隆于T7启动子下游,进行了体外转录及切割活性的研究.
-
抗HPV16E6核酶的原核表达与体外活性研究
目的 获得一种特异性抗人乳头瘤病毒(HPV)16型E6基因的核酶,用以在基因调控水平预防、治疗HPV相关性肿瘤.方法 以核酶(ribozyme,Rz)的锤头结构为模型,采用计算机软件针对HPV16E6基因,设计相应的Rz;体外合成其基因后,克隆于原核表达质粒中.将HPV16E6基因片段也克隆于原核表达质粒中,通过体外转录而得到核酶和病毒mRNA,进行体外切割试验以鉴定核酶的活性.结果 抗HPV16E6核酶(简称抗16HRz)被装入pRG523中而构成pRG16HRz,体外转录后能将核酶独立地释放出来.HPV16E6 mRNA转录质粒pTZ16E6含有HPV16E6基因片段(+94位～+296位),体外切割实验证明抗16HRz具备切割活性,在体外能准确、有效地识别和切割HPV16E6 mRNA片段,得到82nt和132nt的切割产物.结论 所获得的抗HPV16E6核酶能特异性切割HPV16E6 mRNA,可作为对HPV相关性肿瘤进行基因治疗的工具.
-
抗HPV16E6核酶对宫颈癌细胞免疫学特性影响的研究
目的研究特异性抗HPV16E6核酶的转染对宫颈癌细胞免疫学特性的影响。方法以脂质体法将抗HPV16E6-ribozyme、空载体质粒分别导入CaSKi细胞，命名为CaSKi-R、CaSKi-P细胞。流式细胞仪分别检测3种细胞HLA-1、HLA-2、B7-1和B7-2基因的表达，分析CaSKi细胞转染核酶后免疫学特性的变化。诱导制备NK、LAK、CD3AK和肿瘤细胞共激活杀伤细胞，检测各种免疫细胞对CaSKi-R、CaSKi-P、CaSKi细胞的杀伤效应。结果 CaSKi和CaSKi-P细胞中HLA-2、B7-1、B7-2表达都很低，两者差异无显著性。CaSKi-R中HLA-2、B7-1、B7-2表达率均明显升高。3种细胞中HLA-1表达率都很高。NK、LAK、CD3AK细胞对CaSKi-R细胞杀伤率显著高于CaSKi细胞，CaSKi、CaSKi-R分别与rIL-2共激活杀伤细胞（称CASKI和CASKI-R）的杀伤活性无明显差别，对CaSKi-R的杀伤活性高于CaSKi细胞。而各种免疫细胞对CaSKi-P细胞的杀伤率与CaSKi细胞差异无显著性。结论抗HPV16E6-ribozyme的导入能使宫颈癌CaSKi细胞易于被机体免疫系统识别杀伤，难于免疫逃避，但不能增强其免疫原性。
-
抗人乳头瘤病毒16型E6基因核酶对宫颈癌CaSKi细胞生长和端粒酶活性的影响
目的研究抗HPV16E6核酶(Ribozyme)对宫颈癌CaSKi细胞生长和端粒酶活性的影响.方法以脂质体法将抗HPv16E6-Ribozyne、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R和CaSKi-P细胞.点杂交检测核酶在细胞中的表达,northern杂交检测三种细胞中E6基因的表达;细胞生长曲线检测细胞生长的改变;TRAP-Elisa法检测端粒酶活性.结果点杂交证实核酶能在CaSKi-R细胞中稳定表达,northern杂交证实CaSKi-R中表达E6较CaSKi-P和CaSKi明显降低.CaSKi-R细胞生长速度较CaSKi-P和CaSKi明显减慢(P＜0.01);CaSKi,CaSKi-P和CaSKi-R三种细胞的端粒酶活性分别为0.89±0.14,0.90±0.11,0.36±0.06,转染了抗HPV16E6核酶的CaSKi-R的端粒酶活性的抑制率为59.55%.经统计学处理,CaSKi-R的端粒酶活性较CaSKi和CaSKi-P细胞明显下降(P＜0.01).结论转染抗HPV16E6-Ribozyme的CaSKi-R细胞出现一定程度的生长抑制,端粒酶活性较前明显下降.
-
tRNAval-CTE复合核酶真核表达载体构建
目的 构建tRNAval-CTE复合核酶真核表达载体,为进一步研究打下基础.方法 用RT-PCR法扩增CTE cDNA;合成含tRNAval启动子和HCV 5-NCR区195位的核酶以及内切酶Kpn Ⅰ和EcoRⅤ序列,通过退火连接到pPUR质粒的BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点之间,构建质粒pPHCV-Rz;用KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切后,将CTE cDNA定向插入表达载体pPHCV-Rz多克隆位点中,构建成重组表达质粒,并用酶切分析和序列测定进行了鉴定.结果 酶切鉴定和测序证实tRNAval启动子和HCV 5-NCR区195位的核酶基因以及CTE cDNA被正确克隆入真核表达载体pPUR.结论 tRNAval-CTE复合核酶真核表达载体的成功构建,为开展利用tR Naval-CTE复合核酶切割HCV RNA的研究奠定了基础.
关键词： 核酶 D型逆转录病毒胞浆转运信号序列CTE 表达载体 -
功能性适体传感器应用研究进展
近年来,大量研究揭示了核酸的多种生物学功能形式,这些具有不同特性的核酸称之为功能性核酸(functional nucleic acids,FNAs),如天然存在的核酶[1]、反义RNA[2]和核糖开关[3];以及运用selex(systemic evolution of ligands by exponential enrichment)技术人工合成的适体[4-5]和变构核酸酶等.
-
原癌基因c-myc核酶表达载体抑制血管平滑肌细胞的c-myc表达
目的 构建原癌基因c-myc核酶表达载体以抑制心血管系统细胞异常增殖.方法 采用DNASIS软件对大鼠c-myc mRNA进行二级结构和低自由能分析,确定第4600位核苷酸作为核酶的切割位点,设计并合成c-myc核酶.通过体外切割实验证明该核酶的有效性.进一步构建成c-myc核酶表达载体,转染同步化血管平滑肌细胞(VSMC)以检测其对原癌基因c-myc表达的影响.结果 体外切割实验显示该核酶能有效地将85bp的模板切割成60和25 bp的二个片段.所构建载体经酶切法和基因测序法证明其序列的正确性.转染VSMC后能有效抑制血管紧张素Ⅱ诱导的c-myc的表达.结论 c-myc核酶表达载体能有效抑制VSMC的c-myc过度表达,适合用于动脉增殖性疾病的基因治疗.
-
靶向S区和C区基因的M1GS RNA核酶共同抑制HBV的表达
目的:研究靶向HBV S区和C区基因的M1GSRNA核酶共同作用对HBV基因表达的影响.方法:选择HBV ayw亚型S区基因294 nt和C区基因2333 nt为切割位点,以含有编码M1 RNA的DNA序列的质粒pTK117为模板.通过PCR扩增得到M1GS RNA核酶的DNA模板,并将其克隆至真核表达载体pEGFP-C1得到重组质粒pEGFP-GSS和pEGFP-GSC.将2个重组质粒共转染HepG2.2.15细胞,转染后ELISA法测细胞培养液中的HBsAg和HBeAg,RT-PCR检测HBV mRNA.结果:成功构建了分别靶向HBV S区基因和C区基因的真核表达载体.共转染HepG2.2.15细胞后,HBsAg和HBeAg的表达分别被抑制了33.2%和39.1%.HBV C mRNA和S mRNA分别被抑制了32.5%和29.7%,而HepG2.2.15细胞的增殖无明显变化.结论:靶向HBV S区和C区基因的M1GS RNA核酶共同作用可特异性抑制HBV S区和C区基因的表达.
