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呼吸道病毒基因反义技术的研究进展
反义寡核苷酸是一段与mRNA特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的DNA分子.本文通过对呼吸道病毒特异性反义寡核苷酸的作用位点、序列设计、生物利用度(化学修饰、载体运用等)的讨论为抗呼吸道病毒新型药物的研究提供一条新途径.
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低场MRI头颅矢状位FSET2序列参数优化组合
目的 优化低场强核磁共振成像(MRI)头颅矢状位FSET2不同参数配置,实现高性价比扫描.方法 分别采用不同的视野(FOV)24~40 cm、层厚4~8 cm、小激励次数(NEX)1~4次等参数组合进行扫描,记录每次扫描参数、所用时间,重点观察扫描所得的图像.以0.35T MRI厂家设置的原始参数扫描出的图像为对照,观察较大FOV、稍薄层层厚(slice thick)、小NEX 优化组合后对图像及成像速度的影响.结果 较大FOV(33~35 cm)、较薄层(d =5 mm)、小激励次数(NEX=1)组合方案,得到的图像信噪比及空间分辨率适中,且扫描时间明显缩短,又能常规将颈部一并显示,性价比高.结论 实现低场MRI头颅矢状位FSET2参数优化组合,具有重要的临床意义.
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不同引物对扩增SEN病毒的实验研究
为了解国内SENV的感染状况,根据SENV的5'非编码区和编码区ORF1的保守序列设计引物,采用巢式聚合酶链反应(nPCR)检测SENV,对PCR产物进行序列分析.
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基于低场磁共振的脉冲序列设计和成像研究
目的 利用低场磁共振序列设计平台探讨脉冲序列的设计方法,并分析评价成像质量.方法 在低场磁共振平台上,基于序列编码语言及脉冲和编码梯度的佳施加时间来设计成像序列,并对含油和硫酸铜的样品管进行成像,然后根据T1、T2、质子密度、回波时间、重复时间等基本成像参数对样品管图像进行比较和验证.结果 探索出磁共振成像序列设计的基本方法和流程,并且获得了清晰的磁共振图像.结论 低场磁共振可作为基础研究平台用以设计成像序列并进行成像.在进一步的研究中,可针对不同组织部位设计具有特异性效果的脉冲序列,以将磁共振技术更好地应用于临床.
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大鼠缺氧缺血性脑损伤脑组织中脑红蛋白基因表达的变化
2000年,德国Burmester等[1]首次报道了人和小鼠脑内存在特异的功能上类似于肌红蛋白的携氧球蛋白--脑红蛋白(neuroglobin),可特异性的为脑供氧,从而对脑缺氧的研究提供了全新思路[2],并已在国际范围内掀起重新认识和研究脑缺氧的热潮.我们实验室一直在关注脑缺氧损伤的分子机制研究,并获得了人脑红蛋白全长cDNA序列和大鼠脑红蛋白基因编码区的cDNA序列[3,4],随后根据此序列设计引物,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对大鼠缺氧缺血性脑损伤时脑组织中脑红蛋白 mRNA水平的变化进行动态研究,发现缺氧缺血性脑损伤时脑组织中该基因的表达显著升高,提示该基因可能在脑缺氧的适应性调节过程中起重要作用.
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TT病毒的基因变异分析与基因分型
我们对80例非甲~非庚型肝炎患者、血清ALT升高以及长期维持性血透患者(部分患者有输血史)进行检测,对二十余例 TTV分离株进行测序研究,结果如下: 提取患者血清DNA,巢式PCR扩增TTV。参照Okamoto等报道的N22分离株 TTV基因序列设计套式引物:n 5'-ACA GAC AGA GGA GAA GGC AAC- 3'(1892 ~ 1913),T2 5' - GGA TAC CTA TTAGCT C TC AT- 3'(2187 - 2207), T3 5' -GGC AAC ATG TTA TGG ATA GAC- 3'(1914- 1935) ,T4 5' - CCT C GC ATT TTACCA T TT CCA - 3'(2165 - 2186)。
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超广谱β-内酰胺酶基因分型的初步研究
按质粒所携带编码基因同源性的不同,将超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum β-lactamases,ESBLs)分为4类,即TEM型、SHV型、TEM/SHV混合型和非TEM/非SHV型(包括PER、TOHO、CTX-M、OXA型等)。本文报告绍兴地区产ESBLs细菌基因分型的初步结果。 临床标本分离、并经纸片扩散法确证为产ESBLs的细菌42株(其中大肠埃希菌26株,肺炎克雷伯菌16株)。用PCR进行酶基因分型。PCR扩增引物,根据TEM-1和SHV-1编码基因序列设计,TEM引物序列分别为:5′-TCGGGGAAATGTGCG-3′和5′-TGCTTAATCAGTGAGGCACC-3′;SHV引物为5′-TCGGCCTTCACTCAAGGATG-3′和5′-TCCCGCAGATAAATCACCA-3′。待测菌株用碱裂解法提取质粒DNA。PCR反应体积为100μl,含1×PCR反应缓冲液,3.5mmol/L Mg2+,200μmol/L dNTPs,500μmol/L引物,1.6U Taq酶(Promega),10~100ng质粒DNA模板。
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低场MR颅脑急症病例诊断的序列优化
目的优化低场MR在颅脑急症病例成像序列和检查顺序,实现快速诊断与鉴别诊断,提高诊断效率.方法 10例颅脑急症病例(GCS分级≤7分),按(A)DWI,(B)SSFSE,(C) FLASH,(D)T1WI,(E)T2WI,(F)MRA的设计顺序并进行序列的优化,然后进行检查,观察完成检查例数,并与原始检查序列与顺序的结果进行对比.结果 10例考虑颅脑急症患者中,有7例完成了全部改进序列的检查,有2例完成A~C,1例因外伤病人不合作而失败;如果按照原始序列顺序进行检查,10例中仅有4例能够完成全部序列检查.结论通过序列优化,可以在低场MR机上实现对颅脑急症病例的快速,一站式诊断,提高诊断效率.
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掌握磁共振成像序列设计,合理科学运用MR技术解决临床与科研工作中的实际问题
磁共振成像进入中国医疗系统已经有20余年的历史了,与CT的出现一样,磁共振成像又一次拓展了临床医生的视野,不但使我们获得了更加清晰的疾病结构信息,同时也因为其成像的相关化学基础,而在人类疾病功能、代谢信息的获取方面显示出独特的优势.
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PcDNA3.1(+)-MCP-1和PcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒的构建及鉴定
目的:构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα.方法:据GeneBank中大鼠MCP-1和GroαcDNA序列设计并合成引物,提取急性胰腺炎模型大鼠总RNA,RT-PCR扩增,并将扩增产物TA克隆至pGEM-T easy载体,然后分别双酶切pGEM-MCP-1和pGEM-Groα回收目的片段再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).结果:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建完成后,用限制性内切酶、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定,证实其构建成功.结论:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建成功,为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备急性胰腺炎pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Gro DNA疫苗奠定了基础.
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核孔复合体相互作用蛋白(NPIP)对乙型肝炎病毒核心启动子转录活性的调节作用
目的:构建HBV核心启动子及NPIP的重组载体,研究NPIP对核心启动子表达的调节作用.方法:根据HBV核心启动子及NPIP的序列设计引物,用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和NPIP基因,分别构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真核表达载体,脂质体法瞬时转染HepG2细胞.结果:成功构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真核表达载体.脂质体法瞬时转染HepG2细胞48 h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在NPIP的影响下,其活性有降低3-4倍.通过体内实验证明NPIP可以下调HBV核心启动子的表达.结论:NPIP明显降低HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的线索.
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乙、丙型肝炎病毒基因联合诊断芯片的研制及应用
目的:制备一款肝炎病毒检测芯片,能同时实现对乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、HBV YMDD变异株及HCV基因型的检测,并与其他检测方法进行比较,以探讨基因芯片技术临床应用的可行性.方法:根据HBV、HCV的序列设计出探针,采用点样法制备芯片.收集HBV DNA阳性和HCV RNA阳性血清各20份,YMDD变异株阳性血清20份,HBV DNA阴性和HCVRNA阴性血清各10份,用基因诊断芯片检测,并与荧光定量法、错配PCR及测序法比较.结果:HBV DNA阳性标本和HCV RNA阳性标本用芯片检测均为阳性;芯片法检测HBV YMDD变异株和错配PCR法的符合率为75%,和测序法的符合率为95%;芯片法检测HCV基因型和测序法的符合率为75%.结论:基因诊断芯片的敏感性和特异性较高,且能检测出不同病毒株的共生状态,但在检测HCV基因型方面存在一定的假阴性和假阳性.
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多对型特异性引物巢式PCR检测湖南省乙肝病毒基因型
目的:采用多对型特异性引物,通过巢式PCR法检测湖南省乙肝患者血清中乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情况.方法:根据从前Sl基因到S基因中的保守序列设计出10条内外引物,并将其中8条内引物分成A、B两组,分别扩增A、B、C和D、E、F型HBV,然后将第2轮PCR的两组产物分别用3%琼脂糖进行电泳,根据PCR产物片断大小直接判定HBV基因型.与目前常用的PCR-RFLP法进行了比较,并做重复试验以证实该方法的可靠性和准确性.用此法检测了220例湖南籍慢性乙肝血清中的HBV基因型,以了解湖南人群的HBV基因型分布情况.结果:多对型特异性引物巢式PCR与PCR-RFLP法的检测结果完全一致,重现率(100%);湖南人群HBV基因分型结果为B型190例(86.4%)、C型30例(13.6%).结论:这种新的巢式PCR分型法能清晰直观地辨别HBV基因型,结果准确可靠.用此法证实了湖南人群的HBV优势基因型以B型为主,C型次之.
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乙型肝炎病毒基因组中前-前-S区编码基因的界定
目的:乙型肝炎病毒(HBV)基因组内部结构基因与编码基因之间相互重叠,是基因组序列高度集中利用的-个典型.早期研究中确定了编码病毒蛋白的4个开放读码框架(ORF),本研究通过对于中国HBV感染者的流行病毒株的基因序列进行分析比较,阐明基因组结构的特点,并探索是否存在新型ORF的可能性.方法:考虑到HBV基因组序列的准种特点以及多聚酶链反应(PCR)技术的精确度,我们采用的技术是长距离且精确PCR(LA-PCR)技术,根据中国HBV患者的病毒基因序列设计PCR扩增用引物,自慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列,克隆入pGEM Teasy质粒,挑选克隆进行全基因组DNA测序,与其他HBV基因组序列进行比较.结果:测序结果5株HBV全基因组核苷酸序列存在一新的ORF,定义为前-前-S区,并发现该区之前存在一TA富集区,提示存在新型启动子的可能性.新界定的前-前-S区ORF编码氨基酸序列为MQLIITSKLGⅡYILCGRLVFYIREKLHAVPHFVGHHILGNKSYS,与前-S1、前-S2和表面抗原主蛋白编码基因框架一致表达.结论:在HBV基因组中存在有一新的ORF,命名为前-前-S区.
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乙型肝炎病毒基因组中前-X编码基因的界定
目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组存在前-X基因.乙型肝炎病毒(HBV)基因组内部结构基因与编码基因之间相互重叠,是基因组序列高度集中利用的一个典型.早期研究中确定了编码病毒蛋白的4个开放读码框架(ORF),本研究通过对于中国HBV感染者的流行病毒株的基因序列进行分析比较,阐明基因组结构的特点,并探索是否存在新型ORF的可能性.方法:考虑到HBV基因组序列的准种特点以及多聚酶链反应(PCR)技术的精确度,我们采用的技术是长距离且精确PCR(LA-PCR)技术,根据中国HBV患者的病毒基因序列设计PCR扩增用引物,自慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列,克隆入pGEM Teasy质粒,挑选克隆进行全基因组DNA测序,与其他HBV基因组序列进行比较.结果:测序结果提示来源于2个患者的5株HBV全基因组核苷酸序列在X基因之前存在一ORF,我们命名其为前-X(pre-X)区.前-X区编码氨基酸与X蛋白融合表达,序列为MGLGYWPSPPAWNLCGSSADPYCGTPSSLFCSQPVWSETYRNRQLCCPLSQIHLLS.该编码序列仅在adr血清型中有编码表现.结论:在HBV基因组中存在有一新的ORF,命名为前-X区,该区可能是一种HBV血清型特异性编码区.
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利用细菌内重组腺病毒系统构建胃癌MG7-Ag模拟表位疫苗
目的:以复制缺陷的腺病毒为疫苗载体,构建基于胃癌MG7-Ag模拟表位的重组腺病毒疫苗.方法:将编码MG7-Ag模拟表位的互补序列设计到上游引物的5/端.以含有HBcAg全序列的质粒p1.2Ⅱ为模板,通过PCR扩增,获得MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因.经序列测定证实后,亚克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒,再与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5 183中进行同源重组.经抗性筛选及酶切鉴定的重组质粒,再用导入293细胞进行包装,利用Adeasy系统上的绿色荧光蛋白标签鉴定病毒表达.结果:序列测定证实,PCR产物为胃癌MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因片段;酶切鉴定表明胃癌MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因片断插入了pAdTrack-CMV穿梭质粒,卡那霉素进行抗性筛选及Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3 d后见明显的绿色荧光蛋白表达.回收病毒,可重复感染293细胞,证实有感染能力的病毒颗粒包装成功.结论:胃癌MG7-Ag模拟表位的重组腺病毒载体的构建成功,为进一步研究胃癌MG7-Ag模拟表位诱发抗胃癌免疫打下了基础.
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小干扰RNA的设计
小干扰RNA(siRNA)是产生RNA干扰的功能分子,在作为基因研究工具和治疗药物方面具有广泛的前景.为了有效地沉默靶基因并减少脱靶效应,需对siRNA进行精确设计.本文从提高siRNA的沉默效率、降低siRNA的序列特异性和非序列特异性脱靶效应、siRNA进入RNA诱导沉默复合物时的序列选择倾向性、化学修饰的种类和位点选择策略、靶序列的位置和结构选择等几个方面提出并分析了设计siRNA时需要遵循的原则.
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人类神经丝蛋白基因hSTE的分子克隆
啤酒酵母是人类基因组计划的重要模式生物,它的全基因组测序已于两年前完成,其功能基因组研究亦已全面展开.到目前为止,在已知基因中约1/3功能已经清楚,余下2/3基因的功能有待进一步研究.在全基因组所有6 000多个基因中,约1/4的基因尚未被研究,其中一部分基因在功能上尚不能进行归类,称为"孤儿基因"(orphan genes).我们根据系统测序发现的新的开放阅读框基因STE编码的蛋白质序列,在Internet下进行Blast分析,搜寻到一个高分值的人EST,再根据获得的EST序列设计两条引物分别和人脑cDNA文库插入子两端的载体序列配对组成类似于5′-RACE和3′-RACE的扩增体系,获得5′端序列和3′端序列.完成测序后和人的EST库中相关EST进行比较分析,拼接出一个全长为3773bp的cDNA,其中长的开放阅读框在1~3078之间,编码的蛋白质含1026个氨基酸,并含有多个重复的KSP磷酸化位点.同源性检索发现它和人类神经丝蛋白H的同源性在90%以上.将克隆的该基因命名为hSTE并登录到Genbank,登记号为AF203032.利用模式生物对克隆的基因进行遗传互补测验的工作目前正在进行中.
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在线继续医学教育对医生知识、态度和行为的效果
有越来越多的医生选择学习在线课程来进行继续医学教育,但却很少有严格的评估方法来确定在线继续医学教育活动的效果.鉴于此,美国阿拉巴马大学医学院继续医学教育部的研究人员进行了相关研究.应用时间序列设计的方法,来比较完成了继续医学教育网站提供的任意30分钟在线继续医学教育课程的医生在教育活动前后其知识、态度和自我报告的在临床实践中诊疗行为的变化.
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选择两种药剂疗法的序列设计比较研究
如果两种治疗方法的疗效差别是大的,那么,通过使用舍位的序列程序来比较两种疗法的优越性,就可早期中止一个临床试验。这种舍位的序列程序是由阿尔米塔吉引进的,用以测试两个二项分布的平均值之间的差。根据瓦尔德的序列概率比例测验的修改而导出的这种序列程序是为了确定样品规模的上限,以便减少平均的样品数目。丹布罗西亚研究了几种程序的可行性。……