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柯萨奇病毒的临床检测进展
在引起病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)的病原中,柯萨奇病毒(coxsackievirus,COX)较常见.柯萨奇病毒的临床检测主要有病毒分离、血清学检查和分子生物学技术.柯萨奇病毒性心肌炎的临床表现缺乏特异性,病毒分离及传统的血清学检查已不适应快速诊断的需要,近年来包括各种聚合酶链反应及限制性内切酶检测法发展迅速,在柯萨奇病毒的临床检测中发挥重要作用.
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质粒提取及酶切图谱鉴定
本实验是采取碱变性方法从重组大肠杆菌中提取质粒DNA,并用EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ两种限制性内切酶对质粒DNA进行适当酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳对DNA酶切图谱加以鉴定.通过在紫外灯下观察电泳结果,证实利用碱变性方法提取质粒,同时通过酚氯仿抽提,得到的质粒DNA纯度比较高.并且证实酶切图谱与预计相符.从而说明在一般工厂的实验条件下可以进行操作.
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利用全基因组序列优化气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法
目的 对气单胞菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法从限制性内切酶的选择和电泳条件设置上进行优化,减少片段共迁移,使片段在电泳中分布均匀且利于分析.方法 利用6个种的气单胞菌的全基因组数据,通过BioEdit软件对基因组序列进行677种酶的限制性片段分析,选择产生片段数量适宜的、有效片段比例高的酶作为备选酶.对片段长度取以10为底的对数作为自变量,以片段在泳道中的相对迁移距离作为应变量,计算片段长度-相对位置拟合公式,并模拟备选酶的电泳效果图.利用气单胞菌分离株对备选酶进行试验验证,确定PFGE分型方法,并用其对腹泻分离株进行分型应用.结果 经BioEdit分析,根据片段数量及有效片段比例,PmeⅠ、PacⅠ、SwaⅠ比XbaⅠ更适合于气单胞菌的分型.从PFGE模拟效果及分离株试验验证看,PacⅠ、PneⅠ的限制性片段的分布比XbaⅠ和SwaⅠ更均匀,片段重叠更少.终确定PmeⅠ、PacI分别为气单胞菌PFGE分型的首选酶和次选酶,脉冲场电流转换时间为2.16~63.8 s.16株腹泻分离株PFGE分型辛普森多样性指数为99.17%.结论 优化的PFGE方法使用PmeⅠ、PacⅠ作为气单胞菌PFGE分型的限制性内切酶,该方法产生的片段数量与分布都优于XbaⅠ,在腹泻分离株的分型中能获得良好的分辨率.此研究提供的优化程序可用于其他细菌PFGE方法的建立或优化.
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采用基因芯片检出一例丙型肝炎病毒3b基因亚型的报告
研究表明,感染HCV的严重性与所感染的HCV基因型有一定的关系,并且不同的HCV基因型对干扰素治疗有不同的影响.HCV的基因分型目前缺乏统一的分类和命名方法.Chan等对5′NCR进行基因树分析,将HCV分为1、2、3三个主要的基因型[1],随后通过对C、NS3、NS5区段的分析指出,每种基因型均由两到三种基因亚型组成,并将其命名为1a、1b、2a等[2,3].Simmonds等[4]分离出HCV的基因型4,并发展了Chan的命名方法[5].同时Houghton等[6]将1a和1b分别命名为基因型Ⅰ和Ⅱ;Enomoto等[7]将2a和2b命名为基因型Ⅲ; Cha等[8]将3命名为基因型Ⅳ,并将以前在南非发现的一组HCV命名为基因型V.Okamoto等[9]和Mori等[10]将基因型2分为基因型Ⅲ和Ⅳ,基因型3分为基因型Ⅴ和Ⅵ.为了避免混淆,本文中采用Chan和Simmonds的命名方法.HCV的基因分型方法主要包括基因组或基因组的部分序列测序分析,型特异性引物PCR扩增(type-specific primers PCR)[9],限制性内切酶长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)[4],线性探针法(line probe assay,LiPA)[7,11],以及Livache等[12]和Bidan等[13]采用的吡咯阵列传感器芯片的HCV基因分型方法.
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DNA甲基化检测技术与应用前景
表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下,通过DNA甲基化和组蛋白修饰等调控基因表达的一门遗传学分支学科.它不仅对基因表达、调控、遗传有重要作用,而且在肿瘤、免疫等许多疾病的发生和防治中具有重要意义.DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及肿瘤发生中起着重要作用,是目前研究热点之一.DNA甲基化是在DNA甲基转移酶催化作用下,利用S-腺苷甲硫氨酸提供甲基,在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程.在哺乳动物基因组的某些区域,CpG密度很高,形成所谓的CpG岛.它通常位于基因的启动子区或第一外显子区.DNA甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则可诱导基因的重新活化和表达.
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微卫星DNA标记技术及其在蚊虫生物学研究中的应用
遗传标记是指用来区分不同的个体或群体,能够稳定遗传的物质或性状,是研究生物遗传学、发育生物学及分类学的重要工具.遗传标记经历了不同的发展阶段,20世纪70年代以来,随着限制性内切酶的发现和DNA重组技术的创立,遗传标记的研究重点转向遗传信息的载体--DNA分子,出现了多种分子遗传标记.常用的DNA分子标记技术有:DNA限制性酶切长度多态性(RFLP);数量可变的串联重复序列(VNTR)(主要包括微卫星和小卫星)分析;DNA序列分析以及基于PCR的随机扩增DNA多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)和单链构象多态性(SSCP)等分析技术.DNA分子遗传标记,特别是微卫星DNA与其他遗传标记相比,具有稳定性高、信息含量高、种群中分布广泛等优点,正日益受到人们的重视.
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双酶切法构建CRISPR-Cas9载体系统的研究
目的 以pet41a质粒为载体骨架,通过酶切连接法构建crispr-cas9载体系统,建立一种简单有效的基因编辑载体,为研究细菌耐药基因的敲除提供方法. 方法 选择质粒pet41a、pwt-cas9和pgRNA,分析核酸序列,选择合适酶切位点.使用XhoⅠ和BgiⅡ两种限制性内切酶分别酶切pet41a和pwt-cas9,形成带有相同粘性末端的线性载体片段,回收并用T4 DNA连接酶连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,转化菌涂布含卡那霉素的固体LB培养基平板进行阳性单克隆筛选并测序,构建的质粒命名为pet41-cas9.使用BgiⅡ和XbaⅠ两种限制性内切酶分别酶切pet41-cas9和pgRNA,经回收纯化、连接和转化后筛选阳性单克隆菌落并测序,重组质粒命名为pet41a-cas9-gRNA.分别将重组质粒pet41-cas9和pet41 a-cas9-gRNA转化BL-21(DE3),IPTG诱导后提取蛋白进行SDS-PAGE分析. 结果 测序证实质粒pet41-cas9、pet4 1a-cas9-gRNA连接正确,载体构建成功.重组质粒粒转染DE3后经IPTG诱导4h,表达相对分子质量为160×103的重组蛋白,与cas9蛋白理论分子质量相符. 结论 成功构建CRISPR-Cas9载体系统质粒pet41a-cas9-gRNA并表达重组cas9蛋白,为细菌基因的编辑研究奠定了实验基础.
关键词: 基因编辑技术 CRISPR-Cas9 载体构建 限制性内切酶 -
3株弓形虫GRA7基因的保守性鉴定
目的比较弓形虫不同地理株(RH株、ZS2株、GT株)GRA7基因的异同. 方法从弓形虫不同地理株的基因组DNA中扩增出GRA7基因,对目的基因用限制性内切酶(Esp3I、CfrI、MboI)酶切并比较.将目的基因克隆至pGEX-4T-1质粒,转化大肠埃希菌JM109,进行测序并比较. 结果 PCR扩增出3株弓形虫的目的基因片段,大小均在500~750 bp之间;经3种限制性内切酶酶切,其大小均与理论值相符;3株弓形虫GRA7基因序列相同. 结论弓形虫不同地理株GRA7基因具有高度保守性.
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基因克隆技术及其进展
基因克隆技术,又称重组 DNA技术,是将目的基因与具有自主复制能力的载体 DNA进行体外重组,获得新的重组 DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白,以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。近,随着非编码 RNA的发现,这项技术也用于 RNA的研究。基因克隆技术从发明到现在经历了三个发展阶段。第一个阶段是20世纪70年代初经典的基因克隆技术的创建[1-2]。经典的基因克隆技术是需要限制性内切酶和连接酶的克隆方法,至今仍被广泛应用。第二个阶段是20世纪90年代初不依赖连接酶的克隆方法的出现[3]。这种方法不需要连接酶的参与,不受限制性内切酶的限制,使得基因克隆更加灵活。第三个阶段是21世纪初将重组酶运用到基因克隆中[4],使基因克隆更加强大,靶向性更强,操作更简便。本综述从基因克隆技术发展的这三个阶段入手,概述各项方法的原理和特点,方便人们根据自己的需求选择合适的基因克隆方法。
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婴幼儿腹泻物中肠道腺病毒的检测
目的 了解深圳市婴幼儿腹泻患者的不同型别腺病毒的感染情况.方法 应用聚合酶链反应技术(PCR)对114份婴幼儿腹泻标本进行腺病毒DNA检测,并使用Taq I和RsaI内切酶对扩增产物进行限制性内切酶图谱分析结果 婴幼儿腹泻标本腺病毒DNA检测的阳性率为14%(16/114),利用TaqI鉴别腺病毒型别,其中有11份样品水解为191b[p和110bp的两个片段,表明肠道腺病毒DNA检测的阳性率为9.65%(11/114);经RsaI切后,有2份水解为256bp和45bp(腺病毒40型),阳性率为1.75%(2/114),9份水解为2211和90(腺病毒41型),阳性率为7.89%(9/114)。结论 所检要幼儿腹泻患者的样品中肠道腺病毒40和41的感染率约为9.65%(11/114),其他型别腺病毒的感染率为4.35%(5/114)。
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人类巨细胞病毒的变异性分析
目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)基因组的4个片段在人群和单个病人病程中变异性的临床意义.方法通过聚合酶链反应(PCR)对编码糖蛋白B(UL55)、编码DNA单链结合蛋白(UL57)、编码主要衣壳蛋白(UL86)、编码IE抗原(UL122)4个基因片段进行扩增后,用限制性内切酶对扩增片段进行酶切验证,再使用HCMV的标准株AD169进行试验条件的优化,然后对200份临床可疑HCMV感染血标本进行检测.结果 200份血清标本中UL55基因PCR阳性率12.5%,酶切阳性率10.0%,与其他3个基因片段比较差异有显著性(P<0.05);在3例HCMV感染持续阳性的病人血清系列标本中UL55基因存在阳性转阴性现象.结论对HCMV进行PCR检测,应选择变异性较小的基因片段;HCMV通过UL55基因的变异可逃避人体免疫系统对其的攻击.
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PCR限制性内切酶法在苯丙酮尿症突变基因诊断中的应用
苯丙酮尿症(PKU)是一种常染色体隐性遗传病,由苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变导致肝脏PAH酶活性降低或丧失所致.临床表现为不可逆的智力发育迟滞、癫痫等症状.新生儿筛查显示,PKU在中国人群中发病率为1/11 000[1].在中国人pah基因的已知突变中,一些突变改变了基因序列中限制性内切酶的酶切位点.为此,我们应用PCR限制性内切酶法(PCR-RFLP)直接检测一些改变了限制性内切酶酶切位点的突变基因.
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实时荧光PCR结合探针熔解曲线检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因多态性及其与肝硬化的相关性研究
聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)是当前常用的检测基因多态性的方法之一,该法不仅操作时间长,且在采用限制性内切酶对PCR产物进行酶切后,通常采用溴乙锭或银染的方法观察结果.溴乙锭严重危害人体健康,而银染试剂相当不稳定.因此有必要建立一种快速且对人体危害性较低的多态性检测方法.实时荧光聚合酶链反应(PCR)是一种将先进的光学技术、温控技术、荧光素标记技术以及计算机软件有机结合的新型PCR,能够对PCR每一个循环的荧光强度进行监测,故称为实时荧光PCR.双探针杂交技术是一种重要的实时荧光PCR技术,通常用于基因的定量检测,但是如果结合探针熔解曲线则可用于基因多态性和突变的检测[1-3].
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云南省三民族人FⅧ基因XbaⅠ限制性片段长度多态性研究
血友病甲是由于凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷所致的X染色体连锁隐性遗传性疾病[1],FⅧ基因定位于X染色体长臂末端2区8带(Xq28)全长约186 kb,包括26个外显子和25个内含子.目前多利用DNA限制性内切酶片段长度多态性(RFLPs)[2]和可变数目串联重复顺序(VNTR)[3,4]作为遗传标志进行有缺陷基因的连锁分析和产前诊断.但多态性位点在不同人种、不同民族、不同地区人群中出现的频率各异,为获得不同民族FⅧ基因的遗传多态性及其信息量,我们应用聚合酶链反应(PCR)技术特异性扩增了云南省傣、彝、汉族人群FⅧ基因22内含子XbaⅠ限制性内切酶片段长度多态性位点的DNA序列,以确定该位点在上述三个民族中的诊断价值.
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PcDNA3.1(+)-MCP-1和PcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒的构建及鉴定
目的:构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα.方法:据GeneBank中大鼠MCP-1和GroαcDNA序列设计并合成引物,提取急性胰腺炎模型大鼠总RNA,RT-PCR扩增,并将扩增产物TA克隆至pGEM-T easy载体,然后分别双酶切pGEM-MCP-1和pGEM-Groα回收目的片段再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).结果:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建完成后,用限制性内切酶、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定,证实其构建成功.结论:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建成功,为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备急性胰腺炎pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Gro DNA疫苗奠定了基础.
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人hTERT正反义逆转录病毒表达载体的构件建和鉴定
目的:构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)正、反义逆转录病毒表达载体.方法:采用基因重组技术,用限制性内切酶EcoRI将hTERT基因从克隆载体pGRN-145上酶切下,并将其正向及反向克隆到去磷酸化逆转录病毒载体pLXSN中,NotI和XhoI酶切鉴定结果结果:经NotI和XhoI双酶切后,正义重组质粒被切成1438和7838bp两个片段,反义重组质粒被切成1438、1992和5898bp三个片段,与理论计算长度相符.结论:成功构建了hTERT正、反义逆转录病毒载体.
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HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响
目的:研究HCBP6蛋白在细胞内表达时,是否通过蛋白-蛋白之间的相互作用,对HCV核心蛋白的反式激活作用产生影响.方法:利用常规的分子生物学技术分别构建HCBP6蛋白和丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的真核表达载体.酶联负疫黏附法enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测CAT的表达水平,间接测定HCV核心蛋白对于SV40病毒即刻早期启动子的反式激活活性.结果:重组表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6、pcDNA3.1(-)-core经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.转染HepG2细胞之后,HCV核心蛋白的表达,对于SV40病毒即刻早期启动子的转录表达活性具有显著的反式激活作用.但是,当与HCBP6蛋白的表达载体进行共转染时,SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性受到抑制.重复试验得到了相似的结果.HCBP6蛋白的表达对于HCV反式激活SV40病毒即刻早期启动转录活性的抑制率40.4-62.3%.结论:HCBP6蛋白在细胞内的表达对HCV核心蛋白反式激活SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性具有显著的抑制作用.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因10的克隆化研究
目的:丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白5A(NS5A)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因,我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析.研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物.以含有全长HCV-H株cDNA的pBRTM-3011质粒DNA作为模板,进行多聚酶链反应(PCR)扩增,将获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A.以pcDNA3.1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术(bioinformatics),克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因.结果:构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.以pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析.应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因,命名为NS5ATP10,新基因的编码基因序列全长为717个核苷酸(nt),编码产物由238个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV NS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白.微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术.发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为阐明HCV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向.
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KAI1正反义基因对MHCC97-H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响
目的:构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,了解其对高转移潜能的MHCC97-H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响.方法:利用亚克隆技术构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,并用脂质体法将其分别转入高转移潜能的MHCC97-H肝癌细胞系,通过免疫细胞化学SP法检测KAI1蛋白表达情况.结果:限制性内切酶分析证明两个重组子的结构均与KAI1正、反义基因表达质粒的预期结构一致.免疫细胞化学SP法检测显示,转入正义KAI1基因后的肝癌细胞KAI1蛋白染色加深,(细胞积分光密度integra oculus dehter,IOD20.127±5.099 vs12.675±1.921,P<0.01);而转入反义KAI1基因的肝癌细胞则KAI1蛋白染色变浅,(IOD 8.681±2.472 vs 12.675±1.921,P<0.01).结论:成功构建了KAI1基因正、反义真核表达质粒.KAI1正义基因能上调肝癌细胞KAI1蛋白的表达,相反,KAI1反义基因则能下调肝癌细胞KAI1蛋白的表达.
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Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体基因多态性与高血压病及其并发症的关系
血管紧张素Ⅱ(Ang II)在高血压发病机理中有重要作用,由I型AngⅡ受体 (AT1R)介导其绝大多数生物学作用。国外发现AT1R基因A1166C多态性与欧洲白人高血压病有关。本研究旨在探讨AT1R基因多态性与中国人高血压病及其并发症的关系。 一、资料与方法 1.对象:120例高血压病患者(EH组),均为排除冠心病、糖尿病及继发性高血压本院心内科住院患者。86例为健康体检者(对照组)。 2.方法:(1)临床指标:测定血压、身高、体重、空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯。(2)尿微量白蛋白(UA)测定:采用Array 360 system 分析仪。(3)采用ACUSON ASPEN型彩色多普勒超声血流显像仪测定颈总动脉内膜中层复合体厚度(IMT)、颈总动脉内径(D)、壁腔比值(I/D)。(4)采用HP SONOS 5500彩色多普勒血流显像仪测定左心室重量指数(LVMI)。(5)盐析法常规提取基因组DNA。(6)目的基因片段扩增及基因型的检测:所用的引物序列为:引物1: 5′ ATAATGTAAGCTCATCCACC 3′;引物2 :5′GAGATTGCATTT-CTGTCAGT 3′。应用PE-2400进行扩增反应。取6 μl PCR产物,限制性内切酶DdeI 6U,37℃酶切4 h。产物在紫外灯下检测。 3. 统计学分析:用SPSS统计软件处理。正常组与对照组临床指标的比较采用ANOVA检验。基因频率比较用χ2检验。不同基因型患者LVMI、UA、IMT等比较采用t检验。