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乙型肝炎病毒X蛋白的功能研究进展
乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染是引发肝细胞癌的主要危险因子,了解HBV X蛋白在病毒复制及肝细胞基因表达调节中重要的生物学作用对于弄清HBV慢性感染的预后非常重要.本文对X蛋白的反式激活作用,X蛋白对细胞凋亡及在DNA损伤修复中的作用,X相关蛋白的功能及X蛋白的致癌和转化作用等研究进展做较全面的综述.
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96种中药材对流感病毒神经氨酸酶活性的影响
目的:筛选抑制流感病毒神经氨酸酶的中药材,为临床流感治疗提供参考.方法:以2-(4-methylumbellifery1)-α-D-N-aeetylneuraminie acid(MUNANA)为底物,分别用奥司他韦、各种中药材进行干预,体外观察药物对流感病毒神经氨酸酶的活性影响.结果:在96种中药材中,有25种中药材对流感病毒神经氨酸酶活性有促进作用,有71种中药材对流感病毒神经氨酸酶活性有抑制作用,其中抑制率在50%以上中药材有19种,特别是五倍子、苏叶、柴胡、白蔹、石榴皮、槟榔、丁香7种中药材的抑制率在80.0%以上.结论:部分中药材对流感病毒神经氨酸酶活性抑制效应明显,它们可能在流感治疗中发挥重要作用.
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中药调控酪氨酸酶活性的现状分析
酪氨酸酶是黑素生成途径中的主要限速酶[1],体现在酪氨酸生成多巴和多巴醌的过程均需酪氨酸酶的参与.近年来,色素性皮肤病防治的研究热点趋向于中药对酪氨酸酶的抑制或激活作用,并有望通过这一途径取得突破性的进展.现对目前国内外有关中药调控酪氨酸酶活性的实验报道分析如下.1 酪氨酸酶与色素性皮肤病色素性皮肤病可分为色素减退和色素增加两大类,分别表现为皮肤颜色变白和变黑.白癜风是常见的色素减退性皮肤病[2],发病率为0.5%~2%[3],发病原因复杂.而其发病机制则是由于人体皮肤和毛囊的黑素细胞内酪氨酸酶的活性减低或消失,导致黑素体生成的进行性减少或消失而引起的局限性或泛发性脱色素病变[4].补骨脂素是目前国内外治疗白癜风的有效药物之一[2],用药后能增强紫外线的作用,使酪氨酸酶活性增加,从而增加黑素合成.
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10种中药对酪氨酸酶激活作用的研究
应用多巴色素法测定了中药对酪氨酸酶活性的影响,发现10种中药对酪氨酸酶具有激活作用,其中丹参、何首乌、黄芩激活作用较强.
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慢性支气管炎患者血清与痰中IL-8含量初步观察
白细胞介素8(interleukin-8,IL-8)对特异性和非特异性的免疫反应细胞具有趋化作用,尤其对于中性粒细胞的趋化作用和激活作用明显[1].通过对慢性支气管炎患者在急性期和临床控制期中血清、痰与诱导痰内IL-8含量水平的检测分析,以研究其临床及应用意义.
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无细胞短棒状杆菌纳米级制剂对小鼠PMΦ和NK细胞的激活作用
短棒状杆菌制剂(Corynebacterium parvum,CPP)是一种非特异性免疫增强剂,许多动物实验和临床研究证实具有抗肿瘤作用,但副作用较大限制了其临床应用.为了减少副作用,我们采用纳米技术,制备出了无细胞短棒状杆菌纳米制剂(NCPP).并对比研究了NCPP与CPP的毒副作用、对小鼠腹腔巨噬细胞(PMΦ)的激活作用以及NK细胞的杀伤作用,为NCPP的临床应用奠定基础.
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preS2荧光融合蛋白的表达及其对人端粒酶逆转录酶启动子的激活作用
目的 探讨乙型肝炎病毒编码的preS2蛋白对人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子的激活作用.方法 PCR扩增人preS2基因,构建preS2与绿色荧光蛋白融合表达的载体pEGFP-preS2,共转染后通过荧光显微镜检测融合基因的表达.将pEGFP-preS2和hTERT全长启动子报告质粒pGL3B-TRTP共转染HepG2细胞,48 h后裂解细胞,双荧光检测分析preS2对hTERT启动子的激活作用.结果 荧光显微镜检测证实pEGFP-preS2可在体外有效表达preS2融合蛋白,双荧光试验表明preS2可显著激活hTERT启动子,此激活作用具有剂量依赖性.结论 成功构建preS2绿色荧光融合表达载体,并初步证实其对hTERT启动子的激活作用,为进一步探讨肝癌发生中hTERT表达调控机制奠定基础.
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HBx及其截短体与HBV复制
HBx是HBV小的开放读码框(open reading frame,ORF)编码的一个154个氨基酸(amino acid,aa),分子量约17 kDa的多功能蛋白,它通过多种作用影响HBV的复制,如细胞周期、胞质信号转导以及与胞核转录作用元件的直接作用[1-2].HBx结构包含C-端2/3(aa51~154)反式激活区域与N-端1/3(aa1~50)负性调节区域[3].丙氨酸诱变突变扫描方法已经证实aa52~65及aa88~154对增强HBx在HBV中的复制十分重要[4],并且HBx的反式激活作用对增强HBV的复制能力可能是至关重要的,因此C-端反式激活区域对于增强HBV的复制能力是需要的,而N-端截短体对此并未产生明显的影响.
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血管内皮功能检测及临床应用
1980年Furchgott和zawadzki[1]发现在外源性乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)介导的血管舒张过程中血管内皮细胞起着重要的作用.此后人们逐渐认识到血管内皮不仅在血管舒张方面发挥作用,而且还发现血管内皮分泌的一氧化氮(nitric oxide,NO)和内皮依赖性收缩因子(endothelium-dependent constricdng factors,EDCFs)对血小板聚集、血管平滑肌细胞增殖和迁移、单核细胞黏附、黏附分子的表达以及在凝血和动脉粥样硬化斑块形成过程中起重要作用的各种因子具有抑制和激活作用.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活研究进展
丙型肝炎病毒非结构区3(HCV NS3)基因位于HCV基因组非结构区3420-5312核苷酸区段.HCV NS3具有多种潜在生物学功能,如蛋白酶、解旋酶活性,介导细胞免疫反应、反式激活端粒酶、调节p53活性及参与蛋白激酶A和STAT信号转导等[1,2],从而影响宿主细胞功能,导致细胞增生、凋亡,甚至癌变.对于NS3蛋白反式激活作用研究,可为进一步研究HCV致病(癌)的分子生物学机制和探索新的丙型肝炎治疗技术提供帮助.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5反式调节基因的筛选
目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5的反式调节基因.方法:以分子生物学技术构建NS5ATP5的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP5,以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP5后,有17条基因表达增强,12条基因表达降低.结论:成功筛选了NS5ATP5的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP5的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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应用表达谱芯片技术研究NS5ATP13的反式调节基因
目的:应用基因表达谱芯片研究HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP13的反式调节基因.方法:构建NS5ATP13基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP13,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5ATP13转染的人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP13后,有86条差异基因表达,其中46条基因表达增强,40条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导、代谢、凋亡密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP13的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP13的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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慢性病毒性肝炎发病机制的分子生物学研究
由乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的感染引起的急性和慢性肝病目前还没有满意的治疗方法.新型治疗方法和治疗药物的研究开发,依赖于肝炎病毒致病的分子生物学机制的研究进展.关于HBV感染个体准种概念的引入,使我们对于HBV基因变异的研究,从单一病毒的基因变异上升到群体病毒的基因变异、从静态的基因突变上升到动态的基因变异,从而对HBV存在状态的看法发生了根本的改变.HBV感染肝细胞的相关受体蛋白虽然进行了多年的研究,但还没有终确定.利用新型技术对于HBV表面抗原蛋白的结合蛋白进行筛选是一个重要的方向.HBV和HCV感染与肝细胞癌之间的关系已经得到确定,但是具体的分子生物学机制还有许多工作要做.研究这2种肝炎病毒反式激活作用的把基因是阐明其引起肝细胞癌分子生物学机制的重要途径.在肝细胞中表达的肝炎病毒蛋白不是孤立存在的,或者与其自身结合形成同二聚体,或者与病毒的其他蛋白、肝细胞蛋白结合形成异二聚体,从而对于肝细胞的生长、代谢、甚至是恶性转化产生重要影响,
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丙型肝炎病毒NS5A蛋白的反式激活作用研究
0引言丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股正链RNA病毒,编码一种多蛋白分子,在病毒和宿主细胞蛋白酶的共同裂解作用下,至少裂解为3种结构蛋白(C、E1和E2)和6种非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[1,2].NS5 A是非结构蛋白的一种,哺乳动物细胞表达的NS5A蛋白以两种形式存在,分子量分别为56 kD和58 kD.HCV NS5A是HCV基因组编码的一种为重要的具有多种生物学活性的非结构蛋白质[3-5],是HCV基因组编码的一种具有反式激活作用等多种生物学活性的非结构蛋白质.其基因序列的变异,决定部分HCV病毒株对于IFN-α治疗的疗效应答.HCV NS5A蛋白还具有结合双链RNA激酶(PKR)的生物学活性,对于HCV感染的靶细胞的细胞周期与细胞凋亡的分子生物学调节机制密切相关[6].
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乙型肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究
0 引言随着基因组测序工作的完成,后面就是研究基因的功能,其中基因表达蛋白质的功能的研究尤为重要,因为基因是通过蛋白质起作用的.蛋白质与蛋白质之间的相互作用揭示了蛋白质功能的物理基础之一,即蛋白质起作用是通过与另一蛋白质进行物理接触而完成.大家知道乙型肝炎病毒(HBV),对人体有着广泛的作用,如引起人免疫紊乱、慢性肝炎、肝硬化、肝肿瘤发生,治疗效果不佳[1-9 ],但是他们是如何作用的目前不是太清楚,但是可以肯定其中具有蛋白质-蛋白质之间的相互作用.1990年代以来一系列遗传、生化方法特别是酵母双杂交技术等进展,为研究HBV与人体蛋白质之间的相互作用打下了基础.HBV有四个结构蛋白开放读码框架,S、C、P、X编码前-S1、前-S2、HBsAg、HBcAg、HBeAg、病毒多聚酶、和HBxAg,其中HBxAg作用复杂有反式激活作用[10].但是其结构中没有DNA结合域,推测可能和蛋白质之间的相互作用有关,研究比较多.其次是前-S1等.目前鉴定的与HBV相互作用的蛋白质有十几种
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丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活作用的研究
0引言丙型肝炎病毒(HCV)是1989年应用分子生物学技术克隆成功的一个RNA病毒,属黄病毒科,可引起慢性肝炎、肝硬化及肝细胞肝癌,目前有1.7亿人感染,干扰素联合利巴韦林是其治疗方案,但是疗效不佳[1-9].目前世界各国都在积极研究其发病机制,探索新的治疗措施.但由于HCV的宿主范围较窄,只能在人及黑猩猩中繁殖,为研究带来一定困难.HCV是怎样与宿主细胞相互作用的,世界上进行了广泛的研究.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6上调新生多肽相关复合物α多肽基因的表达
目的:探讨HCV核心蛋白结合蛋白6对新生多肽相关复合物α多肽启动子的激活作用.方法:以基因表达谱芯片技术筛选HCBP6表达质粒转染HepG2细胞后的差异表达基因为基础,利用生物信息学技术确定NACA的启动子区域(NACA-p),聚合酶链反应(PCR)扩增NACA-p,克隆至真核表达载体pCAT3中,构建pCAT3-NACA-p表达载体;以该质粒转染COS-7、NIH3T3细胞系,用酶联免疫黏附方法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;与pcDNA3.1(-)-HCBP6共转染NIH 3T3细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:质粒pCAT3-NACA-p在NIH 3T3、COS-7细胞中能够激活CAT的表达;共转染实验中pCAT3-NACA-p+pcDNA3.1(-)-HCBP6组CAT的表达活性是pCAT3-NACA-p的4倍.结论:pCAT3-NACA-p具有启动子活性;HCV核心蛋白结合蛋白6对NACA-p有激活作用.本研究为探讨HCV核心蛋白结合蛋白6的功能提供新的实验及理论基础.
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HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响
目的:研究HCBP6蛋白在细胞内表达时,是否通过蛋白-蛋白之间的相互作用,对HCV核心蛋白的反式激活作用产生影响.方法:利用常规的分子生物学技术分别构建HCBP6蛋白和丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的真核表达载体.酶联负疫黏附法enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测CAT的表达水平,间接测定HCV核心蛋白对于SV40病毒即刻早期启动子的反式激活活性.结果:重组表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6、pcDNA3.1(-)-core经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.转染HepG2细胞之后,HCV核心蛋白的表达,对于SV40病毒即刻早期启动子的转录表达活性具有显著的反式激活作用.但是,当与HCBP6蛋白的表达载体进行共转染时,SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性受到抑制.重复试验得到了相似的结果.HCBP6蛋白的表达对于HCV反式激活SV40病毒即刻早期启动转录活性的抑制率40.4-62.3%.结论:HCBP6蛋白在细胞内的表达对HCV核心蛋白反式激活SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性具有显著的抑制作用.
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乙型肝炎病毒X蛋白激活基因1的克隆化与序列分析
目的:利用分子生物学技术,研究乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)的反式激活作用,克隆HBxAg反式激活作用的靶基因,为进一步探索HBxAg的反式激活作用,以及反式激活作用的靶基因,阐明HBV感染引起慢性肝炎、肝细胞癌(HCC)发生发展的分子生物学机制,为探索新型预防和治疗技术、寻求新型途径奠定理论基础.方法:利用聚合酶链反应(PCR)技术,扩增HBxAg的编码基因,构建表达载体pcDNA3.1(-)-X,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,与转染空白载体的HepG2细胞对照组分别提取总mRNA,并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于获得的差异表达基因片段序列的同源性基因进行搜索,确认为与已知的功能基因无同源性之后,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,完成新基因序列的确定.然后自HepG2细胞提取总mRNA,应用生物信息学技术确定的新基因的序列设计特异性引物,进行逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术的扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析.结果:PCR技术扩增获得的HBxAg基因序列,经过限制性酶切鉴定和序列测定证实无误.转染HepG2细胞并提取足量的mRNA,利用SSH技术进行分析,获得的基因片段序列分析结果表明,其中之一为新型基因片段序列,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过对EST数据库中注册的基因片段序列同源性的搜索和比对,电子拼接成功,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总mRNA,以RT-PCR技术,扩增获得该新基因的全基因序列,并测序证实,命名为XTP1,在GenBank中注册,注册号为AF488828.结论:利用分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HBxAg的反式激活作用的新基因XTP1,并为进一步研究HBxAg的反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.
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丙型肝炎病毒核心蛋白上调层粘蛋白B1链基因启动子表达活性的研究
目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对层粘蛋白B1链(LAMB)启动子转录的激活作用.方法:以我室构建的HCV核心蛋白反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)筛选结果为基础,利用生物信息学技术确定LAMB的启动子区域(LAMB-p),聚合酶链反应(PCR)扩增LAMB-p,克隆至真核表达载体pCAT3中,构建pCAT3-LAMB-p表达载体;以该质粒转染COS-7、NIH 3T3细胞系,用酶联免疫黏附方法(ELISA)法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;与pcDNA3.1(-)-core共转染NIH 3T3细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:质粒pCAT3-LAMB-p在NIH 3T3、COS-7细胞中能够激活CAT的表达;共转染实验中pCAT3-LAMB-p+pcDNA3.1(-)-core组CAT的表达活性是pCAT3-LAMB-p的3.3倍.结论:构建的pCAT3-LAMB-p具有启动子活性;HCV核心蛋白对LAMB-p有激活作用.本研究为利用SSH技术研究HCV核心蛋白致肝细胞癌机制提供新的实验及理论基础.