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MBP-1过表达对食管癌Eca-109细胞增殖和凋亡的影响
MBP-1又称为c-MYC启动子结合蛋白(c-MYC promoter binding protein),其过表达可抑制多种癌细胞的增殖,但对食管癌细胞的影响尚未见报道.本研究构建了MBP-1的重组真核表达质粒,并将该重组质粒转染食管癌Eca-109细胞,检测MBP-1能否在食管癌细胞中过表达及其对食管癌细胞增殖和凋亡的影响.
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白细胞介素10基因修饰的树突状细胞对免疫炎症性心肌损伤的作用研究
心肌炎和特发性扩张型心肌病是以心室扩大伴收缩功能障碍为特征的原因不明性心肌疾病,是年轻患者发生心力衰竭、心律失常及猝死的主要原因.实验性自身免疫性心肌炎(experimental autoimmune myocarditis,EAM)是模拟心肌炎和心肌病等免疫炎症性心肌损伤的模型.如何诱导抗原特异性耐受是EAM研究的热点.我们将pcDNA3-IL-10真核表达质粒转染大鼠未成熟DC(immature DC,iDC),观察其对EAM的治疗作用并探讨其可能机制.
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乙型肝炎病毒S基因变异对人白细胞抗原表达的影响
人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA),可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类分子.HLAⅠ在正常肝细胞表达很弱或全无表达,HBV感染肝细胞时,表达量与炎症程度呈正相关.我们将所构建的野生型和变异型乙肝表面抗原中蛋白基因重组质粒转染HepG2细胞,以研究HBV/S基因变异株对宿主细胞HLA表达的影响,从而对变异株造成的肝脏炎症程度作出初步的推论.
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含CpG基序的大肠杆菌DNA对柯萨奇病毒基因免疫的增强作用
柯萨奇病毒B组(CVB)有6个血清型,即CVB1~6.由于CVB血清型多,采用传统疫苗预防本病难度较大.为此我们构建了CVB1/B3型VP1基因重组质粒pCR3-uniB1B3,将该重组质粒转染后进行RT-PCR及免疫荧光检测,证明该表达系统可以在细胞内获得瞬时表达,并应用该质粒免疫BALB/c小鼠,免疫后小鼠体内产生了相应的抗体,但是其抗体水平并不令人满意.为了获得更好的免疫效果,本研究探讨了大肠杆菌CpG DNA作为免疫佐剂以期增强pCR3-uniB1B3的免疫效果.
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恙虫病东方体山西株56kD蛋白基因DNA疫苗的初步研究
我们构建了恙虫病东方体山西株(Sxh951)56kD蛋白基因DNA疫苗(pc-DNA3.1-Tsa56),该重组质粒转染的COS7细胞经IFA和WB染色均为阳性,表明该重组质粒能够在哺乳动物细胞中表达.为了探讨该DNA疫苗诱导机体产生体液和细胞免疫应答的效果,将6周龄BALB/c鼠随机分成5组,每组10只.
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外源性 Nkx2.5、GATA4促进大鼠骨髓间充质干细胞的心肌分化
目的::心脏早期转录因子Nkx2.5、GATA4转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),探讨Nkx2.5、GATA4对大鼠BMSCs向心肌细胞分化的作用和影响。方法:全骨髓法分离、纯化、扩增培养SD大鼠BM-SCs,流式细胞术联合检测第三代细胞表面分子,CD90+/CD29+/CD45-细胞达95%以上。采用阳离子转染试剂LipofectamineTM2000将pEGFP-N1-Nkx2.5、pVP22-GATA4/myc-His质粒转染BMSCs。结果:转染4周后,Western blotting、免疫细胞化学结果表明,与空质粒组、空白对照组相比,Nkx2.5、GATA4显著提高转染组大鼠心肌细胞肌钙蛋白T(cardiac troponin T, cTnT)、连接蛋白43(connexin43, Cx43)的表达。免疫细胞化学结果显示Nkx2.5转染组、GATA4转染组中部分细胞呈cTnT、Cx43阳性,cTnT阳性细胞的胞质中可见棕黄色丝网状及颗粒样结构,Cx43阳性细胞的细胞质中可见棕褐色颗粒。透射电镜观察各组细胞超微结构变化,转染组大鼠心肌细胞的细胞质内出现大量平行排列的肌丝样结构,细胞侧面或细胞末端可见较多缝隙连接。结论:外源性Nkx2.5、GATA4能够促进BMSCs向心肌细胞分化。
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应用基因表达谱芯片技术筛选NS4ATP2蛋白反式调节基因
目的:对丙型肝炎病毒非结构蛋白4A(HCV NS4A)反式激活新基因NS4ATP2转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4ATP2和pcDNA3.1(-)空载体分别转染的HepG2细胞的mRNA的差异性表达进行检测.结果:基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS4ATP2表达质粒转染的细胞有29条差异表达基因,其中12条基因表达增强,17条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、肿瘤的发生密切相关.结论:基因表达谱芯片技术对于初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS4ATP2生物学功能及HCV-NS4A的致病机制提供了理论依据.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6上调新生多肽相关复合物α多肽基因的表达
目的:探讨HCV核心蛋白结合蛋白6对新生多肽相关复合物α多肽启动子的激活作用.方法:以基因表达谱芯片技术筛选HCBP6表达质粒转染HepG2细胞后的差异表达基因为基础,利用生物信息学技术确定NACA的启动子区域(NACA-p),聚合酶链反应(PCR)扩增NACA-p,克隆至真核表达载体pCAT3中,构建pCAT3-NACA-p表达载体;以该质粒转染COS-7、NIH3T3细胞系,用酶联免疫黏附方法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;与pcDNA3.1(-)-HCBP6共转染NIH 3T3细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:质粒pCAT3-NACA-p在NIH 3T3、COS-7细胞中能够激活CAT的表达;共转染实验中pCAT3-NACA-p+pcDNA3.1(-)-HCBP6组CAT的表达活性是pCAT3-NACA-p的4倍.结论:pCAT3-NACA-p具有启动子活性;HCV核心蛋白结合蛋白6对NACA-p有激活作用.本研究为探讨HCV核心蛋白结合蛋白6的功能提供新的实验及理论基础.
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乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒反式调节靶基因的抑制性消减杂交和基因芯片分析结果的比较
目的:筛选与克隆HBV和HCV蛋白反式调节靶基因,阐明HBV和HCV感染后慢性肝脏疾病的发病机制.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及表达谱基因芯片(cDNA microarray)技术筛选并克隆HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因.以HBV和HCV蛋白的表达质粒转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.同时进行表达谱基因芯片技术分析.结果:成功构建人HBV和HCV蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,对HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因同时进行基因表达谱芯片的分析.在SSH分析中,文库扩增后均得到200-800 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列.对于不同的肝炎病毒蛋白反式调节的靶基因类型,以及不同的分析技术研究的结果进行比较分析,发现了一系列的共同调节的靶基因,说明不同的肝炎病毒蛋白反式调节具有共同的作用途径.结论:筛选到的反式调节靶基因,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBv和HCV蛋白可能存在的调控机制,有助于阐明HBV和HCV蛋白的反式调节在慢性肝脏疾病的发生发展中的作用.
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基因表达谱芯片技术筛选NS5A-TP4蛋白反式调节基因
目的:对新基因NS5A-TP4转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析我室通过抑制性消减杂交技术筛选得到的新基因NS5A-TP4的全长编码序列,并NS 5A-TP4构建基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A-TP4.应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A-TP4转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测.结果:确定基因NS5A-TP4由762 nt组成,编码253 aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS5A-TP4表达质粒转染的细胞有18条差异表达基因,其中12条基因表达增强,6条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、生长调节密切相关.结论:基因表达谱芯片技术可为初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS5A-TP4生物学功能及HCV-NS5A的致病机制提供了理论依据.
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丙型肝炎病毒核心蛋白上调层粘蛋白B1链基因启动子表达活性的研究
目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对层粘蛋白B1链(LAMB)启动子转录的激活作用.方法:以我室构建的HCV核心蛋白反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)筛选结果为基础,利用生物信息学技术确定LAMB的启动子区域(LAMB-p),聚合酶链反应(PCR)扩增LAMB-p,克隆至真核表达载体pCAT3中,构建pCAT3-LAMB-p表达载体;以该质粒转染COS-7、NIH 3T3细胞系,用酶联免疫黏附方法(ELISA)法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;与pcDNA3.1(-)-core共转染NIH 3T3细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:质粒pCAT3-LAMB-p在NIH 3T3、COS-7细胞中能够激活CAT的表达;共转染实验中pCAT3-LAMB-p+pcDNA3.1(-)-core组CAT的表达活性是pCAT3-LAMB-p的3.3倍.结论:构建的pCAT3-LAMB-p具有启动子活性;HCV核心蛋白对LAMB-p有激活作用.本研究为利用SSH技术研究HCV核心蛋白致肝细胞癌机制提供新的实验及理论基础.
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DNA疫苗对小鼠HCV-C皮下移植瘤的防治
目的:从病理组织学方面验证DNA疫苗对小鼠HCV-C皮下移植瘤的预防及治疗作用,为将来的临床应用提供动物实验依据.方法:利用脂质体转染技术将pcDNA HCV-C质粒转染SP2/0细胞并将稳定表达HCV C抗原的SP2/0细胞皮下接种于Balb/c小鼠,成瘤后取小鼠瘤组织,用病理组织学方法验证DNA疫苗对HCV-C皮下移植瘤的预防及治疗作用.结果:肿瘤组织中以T淋巴细胞浸润为主;HCV-C抗原表达主要在SP2/0细胞的细胞质和胞膜上,少数位于胞核中;对照组HCV-C抗原表达明显强于实验组.结论:HCV-C DNA疫苗对HCV的感染有预防和治疗作用.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3上调硫氧还蛋白还原酶1基因的表达
目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法:以HCV非结构蛋白NS3反式调节基因的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRDl的启动子区域(TXNRDlp),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRDlp,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫黏附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS3共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:成功获得TXNRDl启动子的正确克隆.CAT3-TXNRDlp和pcDNA3.1(-)-NS3瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的9倍,pCAT3-TXNRDlp的2.0倍,进一步验证了利用基因表达谱技术研究HCV NS3蛋白反式激活作用的结果.结论:TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HCV的NS3蛋白具有对TXNRD1的反式激活作用.
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丙型肝炎病毒NS5A蛋白上调NS3TP6基因启动子表达活性的研究
目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对NS3TP6启动子转录的激活作用.方法:以我实验室前期研究中得到的HCV NS5A/NS3的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定NS3TP6的启动子区域(NS3TP6-p),聚合酶链反应(PCR)扩增NS3TP6-p,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建pCAT3-NS3TP6-p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫黏附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS5A共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:限制性内切酶消化和序列分析结果表明,构建的NS3TP6-p指导的报告基因表达载体pCAT3-NS3TP6-p正确无误.pCAT3-NS3TP6-p在HepG2细胞中能够启动CAT的表达;共转染实验中pCAT3-NS3TP6-p+pcDNA3.1(-)-NS5A组CAT的表达活性是pCAT3-NS3TP6-p单独转染试验的1.87倍.结论:我室克隆的NS3TP6启动子有指导下游基因转录表达的活性;HCV的NS5A蛋白具有对NS3TP6基因启动子的转录具有反式激活作用.本实验进一步验证了我室利用基因表达谱技术研究HCV NS5A蛋白反式激活作用的结果,为进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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KAI1基因抑制胰腺癌细胞转移机制的探讨
目的本研究将pCMV-KAI1重组质粒转染人高转移胰腺癌细胞株PANC Ⅰ和MiaPacaⅡ中,观察转染前后KAI1基因对胰腺癌细胞侵袭转移能力和运动能力的影响,从基因水平探讨KAI1基因抗胰腺癌转移的能力.
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RNAi表达载体对前列腺癌细胞CXCR4基因表达的抑制作用
趋化因子CXC受体4及其配体基质细胞衍生因子1(SDF-1)相互构成的反应轴与肿瘤的恶性表现密切相关[1].它们不仅在肿瘤细胞的迁移过程中起着一定作用,而且与肿瘤细胞发生、增殖和分化等有密切关系,并可能成为肿瘤基因治疗中的一个新靶点.我们利用可在细胞内自主生成siRNA的表达质粒转染激素依赖性和非依赖性人前列腺癌细胞株LNCaP和PC-3m,观察其对CXCR4 mRNA及蛋白表达的影响.
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干扰素α抑制乙肝病毒X蛋白诱导的肝癌转移的分子机制研究
目的 研究干扰素α抑制乙肝病毒X蛋白诱导肝细胞癌侵袭转移的分子机制,为肝癌的临床治疗研究提供实验依据.方法 采用脂质体法构建pcDNA 3.1-HBx质粒转染CCL13细胞,将CCL13/HBx细胞与干扰素-α共培养,并用RT-PCR、Western Blot从mRNA和蛋白质水平检测CCL13/pcDNA3.1、CCL13/HBx、CCL13/HBx-INF-α中p202、PTEN基因表达,Transwell实验检测CCL13/pcDNA3.1、CCL13/HBx、CCL13/HBx-INF-α细胞侵袭能力.结果 CCL13/HBx细胞中p202、PTEN基因的mRNA及蛋白表达水平明显低于CCL13/pcDNA3.1细胞和CCL13/HBx-INF-α细胞(P<0.05),而CCL13/pcDNA3.1细胞与CCL13/HBx-INF-α细胞间表达差异无统计学意义(P>0.05).CCL13/HBx细胞通过Matrigel的细胞数[(37.2±3.8)个/HP]明显多于CCL13/pcDNA3.1[(6.4±1.2)个/HP,t=8.369,P<0.05]和CCL13/HBx-INF-α细胞[(7.6±1.3)个/HP,t=7.256,P<0.05],而CCL13/pcDNA3.1与CCL13/HBx-INF-α细胞间差异无统计学意义(P>0.05).结论 干扰素α可能通过上调乙肝病毒X蛋白所介导的p202基因、PTEN基因表达,抑制肝癌细胞的侵袭转移.
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抑制MMP-2表达对人胰腺癌细胞黏附和侵袭作用的影响及其机制探讨
胰腺癌侵袭和转移的分子生物学机制非常复杂,基质金属蛋白酶-2(MMP-2)能够降解细胞外基质,与癌细胞分泌的血管生成及淋巴趋化因子一起参与浸润癌特异性的组织重塑和基底膜降解过程.本研究设计和构建带有U6启动子的MMP-2基因特异性的小干扰RNA表达质粒,将构建好的质粒转染入人胰腺癌Bxpc-3细胞株中,观察转染后癌细胞MMP-2及血管内皮生长因子-C(VEGF-C)mRNA水平的变化及癌细胞本身迁移能力的变化,旨在探讨靶向MMP-2的RNA干扰抑制人胰腺癌细胞黏附和侵袭的作用及其机制.
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应用RNA干扰技术研究survivin基因对子宫内膜癌细胞增殖和细胞周期的调节作用
survivin基因是近年来发现的在大多数肿瘤组织中高表达的基因,具有调控细胞周期和细胞凋亡的双重作用,与肿瘤的发生密切相关,抑制其功能将有助于肿瘤的治疗[1].RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是利用双链RNA在转录后水平特异性地抑制基因表达的一项技术,是研究基因功能和基因治疗的有力工具[2].本研究应用RNAi技术,将自行设计和构建包含有针对survivin基因的特异性小分子干扰RNA(siRNA)的重组质粒转染入子宫内膜癌细胞,以观察阻断survivin基因表达对细胞增殖和细胞周期的影响.
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siRNA沉默人组织因子基因对大肠癌侵袭转移能力影响的观察
目的:应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)的手段抑制人类结肠癌细胞内组织因子(tissue factor,TF)基因表达,从而探讨对其侵袭转移能力的影响.方法:首先构建携带有针对TF基因有效的siRNA序列的真核细胞表达质粒pSU-PER-TF,用此质粒转染人类结肠转移癌细胞系LoVo,应用RT-PCR和蛋白质印迹法从RNA及蛋白质水平检测证实细胞内源性TF基因被敲减后的表达水平变化,通过Matrigel体外侵袭实验进一步考证对细胞侵袭转移能力所造成的影响.结果:RT-PCR及蛋白质印迹法结果显示,与转染pSUPER质粒的LoVo细胞相比,转染重组干扰质粒pSUPER-TF-1的细胞其内源性TF基因的表达水平被显著敲减.Matrigel体外侵袭实验证实,转染pSUPER质粒的LoVo穿膜细胞均数为(220±7.0)个,而转染pSUPER-TF-1质粒的LoVo穿膜细胞均数为(102±4.0)个,两组差异有统计学意义,t=25.293,P=0.008.结果表明,转染pSU-PER-TF-1质粒的LoVo细胞侵袭转移能力显著下降.结论:以TF基因作为靶点应用RNA干扰技术敲减其表达可以明显降低LoVo细胞体外侵袭转移能力,为结肠癌的临床治疗提出新的思路,可以作为结肠癌治疗的一个新靶点.