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乙型肝炎病毒X蛋白上调前-X基因启动子表达活性
目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)对前-X基因启动子的调节作用,研究HBxAg在HBV致病的分子生物学机制中的作用.方法:应用聚合酶链反应(PCR)扩增HBV前X基因启动子,以T-A克隆法,将前-X基因启动子(promoter)的基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pGEMT-前-X-promoter与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnⅠ和BglⅡ双酶切后构建前-X启动子报告基因表达载体pCAT3-前-X-promoter,以重组表达质粒pCAT3-前-X-promoter分别与pcDNA3.1空载体和HBxAg表达载体pcDNA-HBxAg瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,48 h后收获细胞.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以了解HBxAg对前X基因启动子的调节作用.结果:构建的报告载体pCAT3-前-X-promoter经过序列分析和酶切鉴定正确.真核表达载体pcDNA3.1(-)-X和pCAT3-前-X-promoter共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是CAT3启动子的3.12倍,是pCAT3-前-X-pro-moter的2.65倍,是pCAT3-3.1空载体和pCAT3-前-X-promoter共转染的2.28倍.结论:HBxAg可以上调乙型肝炎病毒基因组中前-X基因启动子的活性.
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表达谱基因芯片技术研究甘草甜素上调白介素-18基因的表达
目的:了解甘草甜素调节白介素-18(IL-18)基因启动子的活性,为甘草甜素的作用机制提供理论依据.方法:应用基因表达谱芯片技术对于甘草甜素刺激HepG2细胞之后的基因表达谱进行研究.聚合酶链反应(PCR)扩增IL-18基因启动子,命名为IL-18P.以T-A克隆法,将IL-18P基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pT-IL-18P,与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnI和Bg1Ⅱ双酶切后构建IL-18启动子报告基因表达载体pCAT3-IL-18P,以重组表达质粒pCAT3-IL-18P瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,甘草甜素刺激后24 h后收获细胞.用酶联免疫黏附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性.结果:表达谱基因芯片研究结果表明,甘草甜素可上调IL-18基因表达水平达2.815倍.构建的报告载体pCAT3-IL-18P经过序列分析和酶切鉴定正确.pCAT3-IL-18P和甘草甜素瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是CAT3空载体的7.7倍,pCAT3-IL-18P的1.5倍.结论:甘草甜素可以上调IL-18启动子的活性,进而上调IL-18基因的表达.为深入了解甘草甜素的免疫调节作用及其在病毒的清除过程中的作用机制提供新的理论依据.
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鼠肝炎病毒3型N蛋白Ⅰ区激活mfg12凝血酶原酶基因
目的:研究鉴定激活mfgl2凝血酶原酶基因之冠状病毒3型或A59型鼠肝炎病毒(MHV-3,MHV-A59)核心(N)蛋白的功能区域.方法:应用定点突变技术、与mfgl2启动子共转染实验明确mfgl2凝血酶原酶基因之MHV-3或MHV-A59 N蛋白的功能区域.N蛋白内含Ⅰ基因突变病毒株Alb 110和其野生株Alb 111体外感染Balb/cJ小鼠巨噬细胞、Ⅰ基因表达载体与mfgl2启动子共转染实验阐明Ⅰ蛋白在mfgl2基因激活中的作用.结果:N蛋白包含由两个可变间隔区(A,B)隔开的三个结构区(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ),MHV-A59N蛋白Ⅰ区可增强mfgl2转录活性,当其基因序列突变为非嗜肝性MHV-JHM或MHV-21区序列时,则丧失激活mfgl2启动子转录活性的功能.Ⅰ基因突变病毒株Alb 110和其野生株Alb 111体外感染Balb/cJ小鼠巨噬细胞后对mfgl2的激活无显著差异,共转染实验阐明Ⅰ蛋白并非mfgl2基因激活中的必备因素,该组mfgl2启动子转录活性与对照组无显著差异,而N蛋白可激活mfgl2启动子,使其转录活性提高62倍.结论:鼠肝炎病毒N蛋白Ⅰ区为激活mfgl2凝血酶原酶基因的病毒蛋白功能区域.
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丙型肝炎病毒NS5A蛋白上调NS3TP6基因启动子表达活性的研究
目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对NS3TP6启动子转录的激活作用.方法:以我实验室前期研究中得到的HCV NS5A/NS3的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定NS3TP6的启动子区域(NS3TP6-p),聚合酶链反应(PCR)扩增NS3TP6-p,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建pCAT3-NS3TP6-p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫黏附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS5A共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:限制性内切酶消化和序列分析结果表明,构建的NS3TP6-p指导的报告基因表达载体pCAT3-NS3TP6-p正确无误.pCAT3-NS3TP6-p在HepG2细胞中能够启动CAT的表达;共转染实验中pCAT3-NS3TP6-p+pcDNA3.1(-)-NS5A组CAT的表达活性是pCAT3-NS3TP6-p单独转染试验的1.87倍.结论:我室克隆的NS3TP6启动子有指导下游基因转录表达的活性;HCV的NS5A蛋白具有对NS3TP6基因启动子的转录具有反式激活作用.本实验进一步验证了我室利用基因表达谱技术研究HCV NS5A蛋白反式激活作用的结果,为进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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两种启动子调控下PNP基因载体的构建和差异性表达
目的:分别构建巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)通用启动子和甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)杂合启动子[HRE]AF调控的PNP基因表达载体并检测、分析二者的差异表达.方法:将[HRE]AF启动子插入载体pcDNA3.0,构建肝癌细胞特异表达载体p[HRE]AF;将PNP基因分别插入pcDNA3.0和p[HRE]AF,构建两种启动子调控的PNP基因表达载体pcDNA3.0/PNP和p[HRE]AF/PNP;经酶切、PCR及测序鉴定各重组体.用脂质体介导法将两PNP基因载体转染不同细胞株,RT-PCR检测PNP基因在各细胞株中表达,分析二者表达的特点.结果:各目的片段均成功插入相应载体中,CMV启动子调控的PNP基因在各株细胞中均实现了表达,而[HRE]AF启动子调控的PNP基因则在AFP阳性和阴性肝癌细胞中实现了组织特异性表达.结论:两PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效的治疗载体,p[HRE]AF/PNP还实现了在AFP阳性,尤其是AFP阴性肝癌细胞中的靶向性表达.
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人UROC28基因真核表达载体的构建
目的:构建人UROC28基因的真核表达载体,观察其在HEK293细胞中的表达.方法:以PUC-19-UROC28质粒为模板,扩增UROC28基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3中,酶切鉴定目的基因.重组质粒用脂质体转染HEK293细胞,Western blot观察基因表达情况.结果: PCR扩增的特异性片段长度为430bp,以此构建的重组质粒pcDNA3-UROC28, 经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5.4kb和430bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人UROC28cds序列一致.证明UROC28因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3中.Western blot证实pcDNA3-UROC28转染HEK293细胞 24 h 后有UROC28的表达.结论:成功构建了pcDNA3-UROC28重组真核表达载体,并在HEK293细胞中表达.
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mTOR反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达
目的:构建哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的反义RNA真核表达载体,观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)功能的影响.方法:提取人VSMC总RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增mTOR基因cDNA序列,经pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1,构建mTOR基因反义RNA真核表达载体.转染VSMC,采用Westem blot法检验反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响,流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果:经RT-PCR获得664 bp产物,T载体克隆后,经DNA测序,确定该片段为mTOR基因cDNA,进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR,测序证明序列正确后转染VSMC,证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达,VSMC的分裂、增殖过程受阻.结论:已经成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体.
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乙型肝炎病毒基因免疫影响因素简述
基因免疫是近年发展起来的一种免疫策略.它是指将编码外源蛋白的基因表达载体直接导入机体以激发机体产生特异性免疫应答.自1992年Tang等率先报道以此法在小鼠体内获得成功以来[1],针对流感等疾病的基因免疫研究大量涌现.1993年以后Davis等多位学者开展了乙型肝炎病毒(HBV)基因免疫的研究.初步研究结果表明,HBV DNA疫苗能诱发机体产生特异性体液免疫、辅助T细胞(TH)增埴、细胞毒性T细胞(CTL)激活.由于其在诱生免疫应答的许多方面比合成肽等常规HBV疫苗有优势[2],应用前景可能广阔.本文仅就影响其免疫效果的因素等作一简述.
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人糖皮质激素受体GRα基因表达载体的构建和GRα蛋白的表达
目前检测糖皮质激素受体采用的是放射配体法[1,2],存在着放射污染、实验结果不稳定、需血量大(6~7 ml)等问题,因此建立一种简便、无放射污染、需血量少、易于推广的检测方法显得很重要.而ELISA检测法基本符合以上条件.要建立ELISA检测法,首先须表达糖皮质激素受体蛋白.人糖皮质激素受体(hGR)有hGRα和hGRβ两种不同的蛋白,hGRα可与糖皮质激素结合而发挥生理作用,而hGRβ不能与糖皮质激素结合,因此无生理活性[3,4].目前hGRα蛋白的表达多采用真核细胞表达,此种表达方式虽能保持蛋白的天然空间结构而具有生理活性,但要大量制备并纯化却存在困难.本研究拟构建可诱导的hGRα基因表达载体,并大量表达hGRα蛋白,为hGRα ELISA检测法的建立奠定基础.
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人生长激素重组载体的构建及其在原代成纤维细胞中的表达
早在1987年,生长激素(GH)基因即被成功克隆,随即开展了基因治疗的有关研究,但其进入临床试验的阻碍主要是缺少一个高效、易操作的基因治疗系统,尤其是靶细胞的问题,尽管传代细胞系易培养,但存在免疫排斥反应和肿瘤形成的危险.本实验以原代小鼠胚胎成纤维细胞为靶细胞,以逆转录病毒为基因表达载体,建立一个可操作的基因治疗系统.
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马铃薯X病毒分子生物学研究进展及其作为表达载体的应用
马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)又称马铃薯潜隐病毒(Potato latent virus)或马铃薯轻花叶病毒(Potato mild mosaic virus),是马铃薯X病毒属(Potexvirus)的模式成员,遍布于全世界马铃薯种植区.受侵染叶片呈花叶症状,田间常与其他病毒混合感染导致马铃薯的毁灭性减产.
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携带白蛋白启动子小鼠SCP2基因表达载体的构建
胆汁中胆固醇的过多分泌伴随肝细胞浆内胆固醇的浓度显著增高是形成胆固醇结石的关键因素,其中固醇携带蛋白2(SCP2)是影响肝细胞中游离胆固醇浓度的主要因素.本实验旨在构建携带白蛋白启动子小鼠SCP2基因表达载体.
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Ad-IL-24诱导U87-MG人脑胶质瘤细胞凋亡的研究
脑胶质瘤是中枢神经系统常见的恶性肿瘤,约占所有脑肿瘤的50%,目前多采用手术、放疗及化疗等常规疗法,但大部分患者预后不佳[1].我们利用已构建的腺病毒介导白细胞介素-24(IL-24)基因表达载体(Ad-IL-24),观察其对U87-MG人脑胶质瘤细胞的生长抑制和凋亡作用,并探讨其分子机制.
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T淋巴细胞生与死的决定
目的:T淋巴细胞抗原受体复合物(TCD/CD3)介导的信号传递途径决定其生存与死亡,而TCR的刺激信号是通过CD3各亚基胞内区免疫酪氨酸受体激活基序(ITAM)传递的.国内外和本实验室的一系列研究发现CD3ε-ITAM中的两个酪氨酸(Y170,Y181)对T淋巴细胞的生存与死亡起不同的调节作用,其中任何一个或两个酪氨酸同时突变为苯丙氨酸均可影响T淋巴细胞激活,并阻断T细胞死亡的信号传递.T细胞接受抗CD3抗体刺激后,CD3ε-ITAM的Y170可募集Lck、3-磷酸肌醇激酶的P85α亚基和Shc,而Y181可募集ZAP70与其结合,从而介导不同的信号极联,决定细胞生(激活)或死(凋亡)的不同命运.方法和结果:在CD3ε介导的细胞凋亡过程中,凋亡基因Fas及其配体FasL的表达增加.进一步的研究发现,核转录因子Nur77在细胞激活时表达上调,在细胞接受持续刺激并出现凋亡时,Nur77的表达进一步增加.为阐明Fas、FasL和Nur77三者表达的相关性,建立了稳定表达Nur77的T细胞株,构建了Fas及FasL启动子驱动的荧光素酶报告基因表达载体并转染该细胞株,研究Nur77过量表达对Fas及FasL转录的影响,结果表明Nur77可以上调Fas的表达,但对FasL的表达没有影响.Nur77上调Fas的表达,从而增加了Fas+细胞和细胞凋亡.结论:Nur77具有决定细胞"生"(细胞激活)或"死"(细胞凋亡)的关键作用.
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人生长激素转基因家蝇表达载体的构建与鉴定
目的:构建人生长激素(hGH)转基因家蝇表达载体。方法:将hGH基因片段分别与线性去磷pcDNA3和pCMVGFP载体连接,经转化、克隆扩增和快速鉴定等步骤筛选可疑重组子,通过特异性限制性内切酶切割,琼脂糖电泳进行鉴定。结果:成功构建hGH转基因家蝇表达质粒载体pchGH和pcFhGH。结论:为建立hGH转基因家蝇模型提供了基本的实验条件。
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TR基因重组腺病毒载体的构建和鉴定
目的:构建含人硫氧还蛋白还原酶(TR)基因的重组腺病毒载体,探讨TR的抗氧化功能与神经退行性疾病的相关性.方法:从重组质粒pGEM-TR上用内切酶切下编码500个氨基酸的全长TR cDNA片段,并连接穿梭质粒pShuttle,再双酶切pShuttle-TR.将带有CMV启动子的目的片段,插入E1、E3缺失的Adeno-X病毒DNA中,以Adeno-TR DNA通过脂质体转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Adeno-TR进行PCR鉴定及病毒滴度测定.用重组腺病毒感染CV1细胞,通过免疫荧光染色与Western blot分别检测重组腺病毒感染的细胞上和裂解液中TR蛋白的表达.结果:重组腺病毒Adeno-TR的病毒滴度为4.4×1011pfu/L.PCR、荧光显微镜证实,以及Western bolt分析,在相对分子质量(Mr)约55 000处均出现特异性条带.结论:成功地构建了重组腺病毒载体,并能介导外源基因TR表达,为进一步研究TR的功能及其与疾病的相关性奠定了基础.
关键词: 人硫氧还蛋白还原酶基因 腺病毒 基因表达载体 -
心脏传导阻滞SCN5A基因L1001Q突变体构建和功能研究
目的 对作者发现的一个中国3代人心脏传导阻滞家系SCN5A基因新突变L1001Q,构建突变表达载体,利用分子生物学方法和全细胞膜片钳技术观察L1001Q突变的功能.方法 一步定点诱变法构建pEGFP-L1001QSCN5A突变体;激光共聚焦和Western blotting技术检测突变蛋白定位和表达;全细胞膜片钳技术观察突变体钠电流.结果 野生型和L1001Q突变均表达在细胞膜上,且表达量无明显变化.二者大激活电流分别为(148.34±0.77) pA/pF和(132.59±0.96)pA/pF(P>0.05),L1001Q突变半失活电压V1/2为(-73.25±0.87)mV,较野生型正向转移约3.5 mV[V1/2为(-76.71±0.73)mV,P<0.05],L1001Q突变失活后恢复时间常数较野生型稍减小,差异无统计学意义(WT tau=16.8 ms,L1001Qtau=14.1ms,P>0.05).结论 L1001Q突变未影响钠通道蛋白的表达和转运,主要通过改变钠通道门控特性引起钠通道功能减弱进而导致心脏传导阻滞.