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P2X2和P2X4受体的调制位点
P2X受体是非选择性阳离子通道,广泛分布于中枢及外周神经系统.近年来,本实验室侧重研究重金属、质子、酒精等对P2X2和P2X4受体的调制.研究发现不同的因素对同一种受体介导的ATP--激活电流有不同的调制作用,如增强效应、抑制效应或者两种效应兼有,而且同一种因素对这两种受体的调制效应也不相同.因此,我们推测P2X受体上存在不同的结合位点,本文主要阐述P2X2和P2X4受体不同的调制位点.
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乙型肝炎病毒S基因系列单突变克隆人工构建
目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)S基因高频突变位点(T126S,M133L,T144A)变异对HBV生物学活性的影响,开发新的检测HBsAg试剂盒,混合HBV多价疫苗及多效价的乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG).方法:利用人工定点突变技术,基因重组,建立系列HBVS基因‘a'决定簇真核细胞表达的质粒.结果:测序和计算机软件分析,克隆的质粒基因突变序列完全正确,并且能在真核细胞中表达,被HBsAg单克隆抗体识别.结论:所构建的乙型肝炎病毒S基因单突变克隆能够在真核细胞表达蛋白,所表达的蛋白可以正确折叠,维持天然二级构象,具有良好的抗原性,为开发新的检测试剂盒,HBV疫苗及高效价的乙型肝炎免疫球蛋白奠定物质基础.
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乙型肝炎病毒核壳蛋白变异株在HepG2细胞的HLA-Ⅰ表达
目的:研究HBV adr亚型野生株和核壳蛋白变异株在HepG2细胞表面的HLA-Ⅰ/抗原肽复合物的表达.方法:通过定点突变技术将1.2拷贝HBV野生型质粒p3.8Ⅱ构建成核壳蛋白变异株V60和L97.经序列测定和生物学活性检测后,野生株和变异株重组质粒分别亚克隆入EB病毒表达载体EBO-plpp以稳定表达.重组载体EBO-野生株、EBO-V60和EBO-L97分别作内切酶双酶切和序列测定鉴定,再用脂质体介导转染HepG2细胞,ELISA(Abbott)试剂盒定量检测各株培养上清HBV抗原,转染细胞用FITC标记的鼠抗HLA-ABC单抗染色,流式细胞术分析细胞表面HLA-I表达.结果:3株重组载体经内切酶消化,电泳后显示2条区带,分别与1.2拷贝HBV基因组和EBO载体大小相同.测序结果证实EBO-V60和EBO-L97分别在nt2078 C→G和nt2189 A→C,保持原定点突变.EBO-野生株的培养上清HBeAg定量S/CO值明显高于变异株V60和L97,3株HBsAg定量S/N值接近,HBsAg表达相近表明实验的转染效率相当.EBO空载体转染的HepG2细胞HLA-I轻微表达,3株重组载体转染细胞HLA-I的荧光强度不同,野生株增强为18.2,L97明显升高至34.5,而V60降低至3.4.结论:HBV能增强HepG2细胞表面HLA-I/抗原肽复合物的表达,核壳蛋白热点变异V60和L97可使宿主细胞HLA-Ⅰ表达发生变化.
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鼠肝炎病毒3型N蛋白Ⅰ区激活mfg12凝血酶原酶基因
目的:研究鉴定激活mfgl2凝血酶原酶基因之冠状病毒3型或A59型鼠肝炎病毒(MHV-3,MHV-A59)核心(N)蛋白的功能区域.方法:应用定点突变技术、与mfgl2启动子共转染实验明确mfgl2凝血酶原酶基因之MHV-3或MHV-A59 N蛋白的功能区域.N蛋白内含Ⅰ基因突变病毒株Alb 110和其野生株Alb 111体外感染Balb/cJ小鼠巨噬细胞、Ⅰ基因表达载体与mfgl2启动子共转染实验阐明Ⅰ蛋白在mfgl2基因激活中的作用.结果:N蛋白包含由两个可变间隔区(A,B)隔开的三个结构区(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ),MHV-A59N蛋白Ⅰ区可增强mfgl2转录活性,当其基因序列突变为非嗜肝性MHV-JHM或MHV-21区序列时,则丧失激活mfgl2启动子转录活性的功能.Ⅰ基因突变病毒株Alb 110和其野生株Alb 111体外感染Balb/cJ小鼠巨噬细胞后对mfgl2的激活无显著差异,共转染实验阐明Ⅰ蛋白并非mfgl2基因激活中的必备因素,该组mfgl2启动子转录活性与对照组无显著差异,而N蛋白可激活mfgl2启动子,使其转录活性提高62倍.结论:鼠肝炎病毒N蛋白Ⅰ区为激活mfgl2凝血酶原酶基因的病毒蛋白功能区域.
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变应原突变体在支气管哮喘免疫治疗中的应用
特异性免疫治疗(SIT)是对明确了变应原的变态反应性疾病的一种有效的治疗方法.重组变应原及其衍生物的技术的进步大大提高了生产用于治疗变应性疾病的新型疫苗的能力.本文将就用定点突变技术获取的重组变应原突变体在支气管哮喘免疫治疗中的应用做一综述.
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基因改造中快速PCR定点突变方法应用
铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)因为可以消除O2·-而被广泛应用于延缓衰老和控制炎症,但是由于多种因素影响,尤其是Cu,Zn-SOD具有种质特异性以及在体内停留时间短(通常只有6～10 min),使得Cu,Zn-SOD的应用受到很大限制.定点突变技术是改造、优化基因常用的手段,也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有效方法,在医学上还可用于基因治疗等.目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、重叠延伸PCR定点突变及盒式突变等[1].但由于这些方法操作繁琐,意外突变多等缺陷,使定点突变的实验受到一定限制.本研究采用一种近年来新的定点突变技术一快速PCR定点突变方法成功地对hCu,Zn-SOD进行了基因改良(将hCu,Zn-SOD基因中非活性中心的Cys111密码子突变为Ala密码子,以提高其稳定性),同时对该定点突变技术要点进行探讨.
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白念珠菌14-α脱甲基酶 K143Q 氨基酸置换与氟康唑耐药形成的相关性研究
目的：研究临床耐氟康唑白念珠菌14-α脱甲基酶的 K143Q 氨基酸置换与氟康唑耐药形成的关系。方法运用体外定点突变技术构建 ERG11基因 A427C 突变型重组质粒，并利用酶切、连接构建 YES2/CT 酵母表达质粒。通过构建成的表达质粒在酿酒酵母中的异源性表达及体外药物敏感性表型的检测，分析其致 K143Q氨基酸置换与白念珠菌对氟康唑产生耐药的关系。结果真菌体外药物敏感性表型检测显示，含氨基酸置换的表达质粒转染于酿酒酵母 INVSc1后，氟康唑低抑菌浓度（MIC）增加16倍。结论K143Q 可增强白念珠菌对氟康唑的耐药性。
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定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6与醛缩酶的作用位点
目的 利用定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6 (MIC6)与醛缩酶的作用位点. 方法 根据GenBank中的弓形虫RH株MIC6基因序列(登录号为AF110270)及C端序列设计特异性引物,将MIC6蛋白羧基端(MIC6C) 348位色氨酸(W348)的密码子碱基突变为缬氨酸(Ⅴ)的碱基,PCR扩增MIC6C W/V突变体基因片段,克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1,转化至大肠埃希菌BL21 (DE3);0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-MIC6C W/V突变体蛋白,亲和层析法纯化表达产物.以GST-MIC6C W/V突变体蛋白为探针蛋白,GST-MIC6C蛋白为对照蛋白,分别与弓形虫速殖子裂解液进行GST沉降实验,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析实验产物.分别以GST-MIC6C W/V突变体蛋白和GST-MIC6C蛋白为探针蛋白和对照蛋白,与弓形虫醛缩酶蛋白液进行GST沉降实验,SDS-PAGE分析实验产物. 结果 获得了MIC6CW/V突变体基因片段,构建了相应的原核表达载体,表达并纯化了GST-MIC6C W/V突变体蛋白.GST-MIC6C W/V突变体蛋白与弓形虫速殖子裂解液的GST沉降产物中未见蛋白条带,而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中可见一蛋白条带,且能被抗醛缩酶抗体特异识别;GST-MIC6C W/V突变体蛋白与弓形虫醛缩酶蛋白液的GST沉降产物中未见蛋白条带,而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中可见一蛋白条带. 结论 色氨酸(W348)为MIC6与醛缩酶的作用位点.
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人尿酸氧化酶进化机制研究
尿酸氧化酶(尿酸酶;EC1.7.3.3;UOX)是一种在嘌呤代谢途径中催化尿酸氧化生成尿囊素的酶.在灵长类动物漫长的进化过程中,人科动物尿酸氧化酶基因因突变失活,成为假基因.通过来源于10种不同生物尿酸氧化酶蛋白质序列比对,鉴别出发生在人科动物的共同祖先的尿酸氧化酶基因上的3个能够引起尿酸分解活性降低甚至丧失的初级突变位点以及发生在人尿酸氧化酶基因上的12个次级突变位点,同时运用定点突变技术对发生在人科动物共同祖先尿酸氧化酶基因上的初级突变位点进行了验证研究.根据这15个突变位点在人科动物尿酸氧化酶基因上出现的频率和灵长类动物的物种进化分支树,判断出上述突变位点在人尿酸氧化酶基因上发生的先后顺序,终阐明了人尿酸氧化酶的进化轨迹.
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HBx基因缺失突变对HBV复制和转录的影响
目的 构建HBx基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,研究HBx缺失对HBV复制和转录的影响.方法 以包含HBV全长基因组的野生型质粒pUC-HBV1.0为模板,用定点突变技术构建HBx基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,并酶切和DNA测序鉴定.用Sap Ⅰ单酶切这两种质粒,获得线性的野生型和HBx缺失突变型HBV基因组,经转染试剂PolyJetTM Reagent介导分别瞬时转染到HepG2细胞中.在转染后各时间点Western blot检测HBx蛋白的表达,Southern blot 和Real-time PCR同时检测细胞质DNA复制和细胞核cccDNA的合成,Real-time PCR分析定量HBV前基因组RNA(pgRNA)的转录.结果 在野生组中可检测到HBx蛋白的表达,而在HBx突变组中HBx蛋白的表达低于Western blot的检测范围.两组中各时间点合成的cccDNA水平无统计学差异(P＞0.05).而在转染后96 hHBx突变组中细胞质DNA的复制和pgRNA的转录都分别比野生组减少50％～70％ (P＜0.05).结论 HBx缺失虽然不影响细胞核HBV cccDNA的合成,但是它能下调细胞质HBV DNA的复制和pgRNA的转录.
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人抗菌肽FALL-39突变体FALL-39-Lys24'32的构建及其抗菌作用研究
目的:用PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体pGEX-1βT-FALL-39-lys24'32,并比较研究FALL-39及其突变肽的功能.方法:采用一步法和两步法PCR定点突变技术,用赖氨酸替代第24位的谷氨酰胺和第32位的天门冬氨酸,构建FALL-39突变体大肠杆菌表达载体;该载体表达的融合蛋白经亲合层析、凝血酶酶切和高效液相后获得高度纯化的FALL-39以及突变肽;用低有效浓度(MEC)、低抑菌浓度(MIC)、低杀菌浓度(MBC)指标比较纯化产物抗菌作用.结果:PCR定点突变得到突变体质粒pGEX-1βT-FALL-39-lys24'32;重组原核表达质粒pGEX-1βT-FALL-39及其突变体融合蛋白有高效表达,经提取纯化可得到高纯度的活性蛋白FALL-39,和FALL-39-Lys24'32(约4Kd).突变蛋白对大肠杆菌ATCC 25922、耐氨苄青霉素菌ML-35p和绿脓杆菌的抗菌活性明显增强.结论:用PCR定点突变技术成功得到FALL-39基因突变体,大肠杆菌表达载体可得到高效表达的蛋白;突变蛋白的抗菌活性明显增强,提示在FALL-39分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性.
