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有机VS无机:本质区别在哪里?
现如今,无化肥农药、低添加剂的有机产品已然成为市场的宠儿.美国农业部国家有机标准计划(NO P)列出了有机食品的基本标准:一是禁止使用农药、化肥、生长激素、化学杀虫剂、化学除草剂在栽种、处理的农作物或牲畜上;二是除农作物之外,农场及生产工厂也需符合NOP生产过程及环境的要求,认证产品有效期一年,隔年重新申请;三是在有机产品的生产过程禁止掺杂合成代用品、基因改造物和辐射线照射.
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探索治疗中风的新途径
目前,神经科学家使用一种通过基因改造后得到的携带有部分NMDA受体结构的病毒免疫大鼠,成功地对抗了大鼠由中风引起的脑中神经细胞死亡.因为在中风的发病过程中,脑中有过量的神经递质谷氨酸释放,导致NMDA受体的过度激活而使神经细胞死亡.从理论上说,利用携带有NMDA受体部分结构的病毒制备的抗体进入中风后受损伤的大脑,将与NMDA受体结合,阻止因受体被过度激活引起的神经细胞死亡.在实验中,这种抗原免疫的方法有效地防止了大鼠中风后脑神经元的死亡,其治疗效果令人惊讶.但是,神经学家指出,将这种抗原免疫的方法用于人体,仍需要慎重,它可能给人带来脑炎、学习障碍等副作用.
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治疗性抗体高表达CHO细胞株构建策略
单克隆抗体(MAbs)具有高度的特异性,因而被大量用于各种疾病尤其是癌症和自身免疫性疾病的治疗.2009年,包含生物抗体药物在内的重组蛋白获得了990亿美元的市场销售额[1],突出的重磅炸弹级药物包括:美罗华利妥昔单抗(rituximab,美国Genentech和BiogenIdec公司研制)、赫赛汀曲妥珠单抗(trastuzumab,美国Genentech公司研制)、阿伐斯汀贝伐单抗(bevacizumab,美国Genentech 公司研制)、艾比特思西妥昔单抗(cetuximab,美国ImClone 公司和Bristol-Myers Squibb公司研制)和修美乐阿达木单抗(adalimumab,美国Cambridge抗体公司和Abbott公司研制)等.表1为2011年部分单克隆抗体药物的全球销售情况[2].以上抗体均由大规模培养的经过基因改造的宿主细胞(host cell)来生产表达.对于治疗性抗体而言,为了满足其生物活性,需要进行正确的折叠和翻译后修饰,因此用于生产治疗性抗体的宿主细胞往往是哺乳动物细胞,主要包括:Sp2/0骨髓瘤细胞、NS0小鼠骨髓瘤细胞、HEK293人胚胎肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO),其中以CHO细胞用途为广泛.
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人谷草转氨酶的基因改造及高效重组表达
目的构建人谷草转氨酶(AST)高效重组表达体系。方法优化编码人 AST的核苷酸密码子,合成人 AST新的基因,并将其克隆至 pRSF-Duet表达载体中,转化大肠杆菌 BL21,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白的表达,并通过改变诱导剂浓度、振摇速度及诱导温度优化表达条件,以产生可溶性蛋白。可溶性蛋白经镍离子柱亲和层析及分子筛层析纯化,以 SDS-PAGE电泳及蛋白质免疫印迹鉴定蛋白的性质,对重组蛋白的活性及在血清基质中的稳定性进行检测。结果经过优化的 AST密码子在大肠杆菌中的使用频率均在10%以上;重组蛋白存在于上清和沉淀中,经表达优化,在 IPTG终浓度为2 mmol/L、25℃、150 r/min振摇8 h诱导条件下,可增加可溶性蛋白的产率,纯化后的目的蛋白经电泳及免疫印迹鉴定为谷草转氨酶,活性可达136000 U/L,且在含有蛋白酶抑制剂的血清中稳定存在。结论通过密码子优化,成功构建了重组 AST的高效表达系统,重组蛋白可以达到作为参考物质原料的要求。
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AIDS防治实验研究的新动向
1 抗AIDS新药的研究已可采用大鼠模型[1]由于种属的特异性,一般实验大鼠根本不易感染HIV.近年来,科学家们一直在尝试培育出可以感染HIV的啮齿动物.2007年1月10日文章报道:一种经过基因改造的大鼠很容易感染HIV,能为治疗AIDS药物的研制提供新的帮助[1].
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读《慢活》(二)
慢"食"初看到这个题目--<慢活>,我以为作者只是提倡快节奏的生活力,要细嚼慢咽.读完之后,才知道,远远不是这么简单.作者从食物的生产过程进行了分析:现代的食物,成熟期都比以前快了很多,虽然可以养育更多的人口,但是,化肥农药、生长激素、添加剂、基因改造给人类带来的危害,也伴随其中.
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基因疗法治疗脊柱疾病——现状与展望
随着对人类基因结构及其功能研究的深入,基因疗法极可能成为21世纪临床治疗脊柱疾病的有效手段。成功地将治疗基因转入椎间盘内的靶细胞,以及在动物模型上利用基因疗法成功促进脊柱融合,标志着在这一领域的研究正取得快速进展[1]。但是在基因疗法终进入临床阶段之前,还有待进一步研究。本文在介绍基因治疗研究新发展的基础上,展望基因疗法治疗脊柱疾病尤其是椎间盘变性和脊柱融合相关疾病的前景。1 基因治疗概念的新发展 基因治疗是将编码目的基因的核酸系列(RNA或者DNA)导入某群细胞,改变细胞的基因成分,使细胞成为特定蛋白的“生产工厂”,从而改变该细胞本身的代谢,而且还能影响邻近的未经基因改造的细胞。它不再专指通过转移功能性基因代替缺陷基因来治疗已发生的疾病,而是指通过核酸转移治疗或预防疾病。也就是说基因治疗不仅可用来治疗遗传性疾病,而且将来可治疗后天性疾病,包括肌肉骨骼的病变[2]。
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糖尿病动物模型的研究进展
糖尿病的患病率呈逐年升高的趋势,其发病机制也正在得到阐明,认为它与多种致病基因和环境因素(生活习惯、年龄、应激反应)的交互作用有关.但从患者中得到的研究材料受到诸多因素的制约,需要利用糖尿病动物模型来进行一些基础性研究.在此之前曾通过各种手段(药物投入、外科手术、基因改造等)获得糖尿病的模型动物,这些动物的病态表现和人的糖尿病的病态有部分的相似,可以用于对糖尿病的发生和发展过程的分析,所以糖尿病动物作为人的糖尿病模型而被广泛的应用.
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地中海贫血治疗研究方向和药物治疗研究进展
地中海贫血(珠蛋白生成障碍性贫血)是由于珠蛋白肽链合成量之间不平衡所致,所以纠正珠蛋白肽链失衡成为地中海贫血治疗研究的关键.骨髓移植治疗重症地中海贫血成功的病例报告不断增加,预示基因治疗有望从根本上解决问题.目前基因治疗概念已从正常基因导入扩展至基因改造、RNA治疗、基因功能调整等方面,而使用药物调控基因表达来治疗β地中海贫血获得了低成本、低风险、疗效较明显的结果,利于临床推广应用.一些中成药、中药方剂辨证施治治疗地中海贫血疗效满意,显现祖国传统医药的应用优势和前景.我们重点综述这些药物对地中海贫血的治疗机制和用药方案,以供临床参考.
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用病毒修复聋鼠听觉
美国科学家以病毒修复失聪老鼠的基因,使其恢复部分听力,可望为治疗先天失聪带来突破.先天失聪个案近半与基因缺陷有关,涉及逾70种不同的基因.其中耳朵内用于将声音转化为电子信号、传送至大脑分析的毛细胞,或因一种名为TMC1的基因出现缺陷而令人"听不见"声音.美国波士顿儿童医院集中研究TMC1缺陷,以TMC1出现问题而严重失聪的老鼠做实验.这些老鼠连115分贝左右的声音(约等同摇滚音乐会的声浪)亦听不见.专家将经过基因改造的病毒注射进老鼠的耳朵,感染其毛细胞,以修复出现缺陷的基因TMC1.结果在1个月内,受感染老鼠听力显著改善,听到85分贝的声音(约等同汽车行驶的声浪)时有跳起等反应,并出现相应的听觉脑电波;未受感染的老鼠则没有变化.
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“鸡尾酒”或有新配方——人类免疫缺陷病毒抗体疗法动物实验取得突破
据英国《自然》杂志网站报道,美国科学家们近对恒河猴的研究表明,一种功效强大的艾滋病病毒(HIV)抗体有望与目前的抗逆转病毒疗法“同仇敌忾”,有效对付人类免疫缺陷病毒.抗体疗法成效显著这种名为猿猴和人免疫缺陷病毒(SHIV)的病毒能感染猴子,基因改造使其携带有人类病毒基因组的关键组成部分.两篇发表在《自然》杂志网络版上的研究报告了一种抗体疗法对这种人类免疫缺陷病毒的影响.科学家们将从人类免疫缺陷病毒患者体内分离出来具有强大抗广谱人类免疫缺陷病毒效果的人类抗体注入恒河猴体内,结果发现,恒河猴体内猿猴和人免疫缺陷病毒的浓度会急剧下降.
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解读基因食物
1995年5月,美国某大学的研究人员发表报告,宣称发现有些黑脉金斑蝶死于经过基因改造的玉米花粉.这一消息引起了轩然大波.环境保护组织纷纷对基因生物口诛笔伐,例如"绿色和平"组织的传单指出:"基因生物体会给自然生态系统带来浩劫,损害人类的健康.""地球之友"也厉声警告:"农场真有可能不久就成为野生生物的荒原."
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基因改造中快速PCR定点突变方法应用
铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)因为可以消除O2·-而被广泛应用于延缓衰老和控制炎症,但是由于多种因素影响,尤其是Cu,Zn-SOD具有种质特异性以及在体内停留时间短(通常只有6~10 min),使得Cu,Zn-SOD的应用受到很大限制.定点突变技术是改造、优化基因常用的手段,也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有效方法,在医学上还可用于基因治疗等.目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、重叠延伸PCR定点突变及盒式突变等[1].但由于这些方法操作繁琐,意外突变多等缺陷,使定点突变的实验受到一定限制.本研究采用一种近年来新的定点突变技术一快速PCR定点突变方法成功地对hCu,Zn-SOD进行了基因改良(将hCu,Zn-SOD基因中非活性中心的Cys111密码子突变为Ala密码子,以提高其稳定性),同时对该定点突变技术要点进行探讨.
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重组多克隆抗体——一类新的治疗制剂
抗体作为治疗制剂已有上百年历史,主要有抗血清和单克隆抗体,抗血清对多表位抗原的中和能力较强,但是,抗血清安全性低、供应量有限、批次间差异大、有效抗体成分低,而且不能进行基因改造;单抗药物的特异性强、重复性好、能够进行基因操作、安全性高,不过,在由多表位抗原或者是突变较快的病原体引起的疾病治疗中,单抗的疗效相对较差;重组多克隆抗体几乎拥有抗血清和单抗的所有优点,在多种疾病比如感染和癌症的治疗中将体现其巨大的优势和良好的临床应用前景.本文将对这一类新型抗体治疗制剂做简要综述.
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牛乳铁蛋白十肽的基因改造、克隆及表达
目的 克隆并表达牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2基因.方法 参照大肠杆菌偏爱密码子,分别针对牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2基因,设计并合成两个具有相同黏性末端的DNA片段,同时在其基因前后分别加上天冬酰胺和甘氨酸的密码子,构成羟胺裂解位点,通过连接获得其二拷贝基因同向串联体.分别将该串联体克隆至载体pUC18上,经双酶切、PCR及测序鉴定后,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物纯化后,用凝血酶切割及羟胺裂解.结果 获得了牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2二拷贝基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出相对分子质量约29 000的目的 蛋白条带,纯化后的蛋白经凝血酶切割后,相对分子质量约29 000的目的 蛋白条带消失.结论 已成功克隆并表达了牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2基因,为基因工程抗真菌肽的制备奠定了基础.
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绵羊骨髓细胞抗菌肽基因的改造及其在原核生物中的表达
目的 通过对绵羊骨髓细胞抗菌肽(sheep myeloid antibacterial peptides with 29 amino acids,SMAP-29)的活性片段SMAP-29(1-18)基因的改造,使其以C-端融合蛋白的形式在大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中表达.方法 根据大肠埃希菌偏爱密码子表,将SMAP-29的活性片段SMAP-29(1-18基因序列进行改造,应用ProtParam分析SMAP-29的理化特性,Anthorprot软件预测其螺旋轮结构,设计新的基因片段,插入质粒pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30aSMAP-29[1-18,K24,L13],转化感受态E coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物过2次Ni2+NTA His Bind resin 柱进行纯化.结果 SMAP-29基因序列经改造后,稳定性、等电点及半衰期均明显提高.重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确.表达的重组蛋白相对分子质量约61 257,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的41%,纯度为81%.结论 已成功对SMAP-29基因进行改造,实现了其在E.coli BL21(DE3)中的高表达,获得了纯度较高的目的蛋白,为进一步规模化生产SMAP-29奠定了理论及实践基础.
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嵌合抗原受体T细胞技术的介绍及研究进展
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)是一种过继性细胞免疫治疗(ACI),并在近年来得到迅猛发展.通过导入外源基因使T细胞表达嵌合抗原受体(CAR),在肿瘤免疫效应上表现高特异性、靶向性、MHC非限制性等特点.目前,CAR-T技术已经发展至第三代,即表达于T细胞表面的CAR分子由胞外抗原识别区和胞内双信号产生区构成,该结构保障了CAR-T细胞与靶细胞接触时收到双信号的激活以发挥大的抗肿瘤效应.但同时CAR-T细胞在临床应用中也存在如脱靶效应、细胞因子风暴等风险,需要急待解决.
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利用重组大肠杆菌合成莽草酸的研究进展
莽草酸是芳香族氨基酸合成途径中的一种重要中间代谢产物.近年来,莽草酸作为临床上对抗禽流感的惟一有效药物达菲的合成前体而备受关注.通过改造大肠杆菌代谢通路使之能大量积累莽草酸是研究的热点之一.文章综述了莽草酸在重组大肠杆菌中生物合成的途径,并分析了莽草酸合成过程中的关键基因的改造及其对莽草酸积累的影响,后还讨论了减少莽草酸产生菌培养过程中副产物产成的若干措施.
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Exendin-4的表达及其降糖活性研究
根据Gene Bank中登录的Exendin-4的氨基酸序列(AAB2006),结合大肠杆菌的密码子偏嗜性,对原有基因70%的密码子进行改造,使其在大肠杆菌中高效表达;同时添加KpnI和NcoI酶切位点和肠激酶识别位点,构建成重组表达载体pET-32a(+)-Exendin-4,转化大肠杆菌BL21(DE3).在30℃条件下1 mmol/L的IPTG诱导表达6 h,融合蛋白表达量占细菌蛋白总量的32%.利用亲和层析纯化融合蛋白,每克湿菌体可获得纯度98%的融合蛋白6.44mg.利用肠激酶切除融合蛋白的N端融合部分,用亲和层析吸附N端融合肽,每克湿菌体可获得纯度99%的Exendin-4 1.59 mg.腹腔注射糖尿病基因小鼠(BKS.Cg-m+/+Lepr db/J鼠),血糖浓度下降极显著,佳用量为7μg/kg,注射后4 h血糖降低达51.93%.
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溶癌腺病毒及其抗肿瘤作用研究进展
溶癌腺病毒(oncolytic adenovirus,OAd),又称条件增殖型腺病毒(conditionally replicative adenovirus,CRAd),是通过对腺病毒的基因改造使其复制具有肿瘤特异性,在功能正常细胞中复制能力极低.在肿瘤细胞中复制后裂解肿瘤细胞,并释放出子代病毒,感染周围肿瘤细胞,直至完全杀灭肿瘤.