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治疗性抗体高表达CHO细胞株构建策略
单克隆抗体(MAbs)具有高度的特异性,因而被大量用于各种疾病尤其是癌症和自身免疫性疾病的治疗.2009年,包含生物抗体药物在内的重组蛋白获得了990亿美元的市场销售额[1],突出的重磅炸弹级药物包括:美罗华利妥昔单抗(rituximab,美国Genentech和BiogenIdec公司研制)、赫赛汀曲妥珠单抗(trastuzumab,美国Genentech公司研制)、阿伐斯汀贝伐单抗(bevacizumab,美国Genentech 公司研制)、艾比特思西妥昔单抗(cetuximab,美国ImClone 公司和Bristol-Myers Squibb公司研制)和修美乐阿达木单抗(adalimumab,美国Cambridge抗体公司和Abbott公司研制)等.表1为2011年部分单克隆抗体药物的全球销售情况[2].以上抗体均由大规模培养的经过基因改造的宿主细胞(host cell)来生产表达.对于治疗性抗体而言,为了满足其生物活性,需要进行正确的折叠和翻译后修饰,因此用于生产治疗性抗体的宿主细胞往往是哺乳动物细胞,主要包括:Sp2/0骨髓瘤细胞、NS0小鼠骨髓瘤细胞、HEK293人胚胎肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO),其中以CHO细胞用途为广泛.
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持续释放人血管抑素的基因修饰化工程细胞hE/293细胞株的建立
目的:在人胚肾HEK293细胞中转染真核表达载体pSNA2/hEndostatin(hEndostatin,人血管抑素),建立能稳定分泌hES的基因工程细胞株.方法:将含有IL-2分泌肽的人endostatin(ES)全长cDNA插入真核表达载体pSNA2,产生重组质粒pSNA2/hEndostatin;利用阳离子脂质体介导将其转染入HEK293细胞中;用G418筛选出阳性克隆细胞,将其命名为hE/293细胞.用Western blot法检测hE/293细胞培养上清中分泌的hES蛋白.血管内皮细胞(ECV304)增殖抑制试验及鸡胚尿囊膜试验观察其分泌的hES蛋白的抗增殖活性.结果:经过双酶切和DNA测序证实构建出了含hES基因的真核表达载体.通过G418抗性筛选筛选出稳定表达hES的细胞株3株,将其命名为hE/293细胞;Western blot检测该细胞株培养上清中存在分子量为20 kDa的ES蛋白;ECV304增殖抑制试验显示,与HEK293细胞组相比,hE/293细胞组分泌的ES蛋白对bFGF刺激的血管内皮细胞增殖有明显的抑制作用(48 h:0.125±0.007 vs 0.159±0.020,P＜0.01;72 h:0.088±0.016 vs 0.249±0.070,P＜0.01);鸡胚尿囊膜试验证实hE/293细胞分泌的ES蛋白可以抑制鸡胚尿囊膜血管生长.结论:所构建的hE/293细胞株可以稳定的分泌hES蛋白,并能抑制ECV304细胞生长及鸡胚尿囊膜血管生长.
关键词： 人内皮抑素 真核表达载体 人胚胎肾细胞 hES细胞株 Western blot -
马尾松树皮提取物对顺铂所致体外人胚肾细胞毒性的保护作用
目的：体外研究马尾松皮提取物（PMBE）对于顺铂（CDDP）所致人胚肾细胞毒性保护作用及其作用机制。方法体外进行人胚肾细胞293（HEK 293）的培养，分别应用PMBE和CDDP进行处理，并以四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）检测细胞生长情况；同时检测细胞中丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）的含量。结果低浓度（≤80 mg/L）PMBE可促进HEK 293细胞的生长，提高细胞GSH的含量，降低MDA和ROS的含量；在较高浓度下可产生轻微的细胞毒性。结论低浓度PMBE对于CDDP所致肾毒性具有一定的保护作用，作用机制与其抗氧化性有关。
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TDP-43在人胚胎肾细胞中的代谢及其产物对细胞活力的影响
目的研究TAR DNA结合蛋白43 kD(TDP-43)在人胚胎肾细胞HEK293中的代谢过程及其产物对细胞活力的影响。方法应用不同浓度十字孢碱( STS)作用于HEK293细胞，检测TDP-43含量的变化，并联合使用不同的蛋白降解通路阻滞剂研究其代谢机制，再通过转染外源性TDP-43研究其对细胞活力的影响。结果 STS对HEK293细胞中TDP-43蛋白含量影响不大，在较高浓度时(5、10μM)会诱导 HEK293细胞产生35 kD 片段。进一步研究发现这一35 kD片段是通过泛素-蛋白酶体通路降解的，且其过表达时会明显降低 HEK293细胞的活力。结论过表达外源性 TDP-43及其35 kD片段可对HEK293细胞活力产生抑制作用，可能是导致TDP-43相关疾病的原因。
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大鼠kir2.1通道重组质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达
内向整流钾电流(IK1)是心肌主要的背景外向电流,参与静息电位的维持和心肌动作电位3 期终末的复极,进而调控心肌的兴奋性和传导性[1,2].已知心肌细胞IK1通道主要由Kir2 亚家族(Kir2.x) 中的Kir2.1、Kir2.2 和Kir2.3 构成,它们的编码基因分别是KCNJ2、KCNJ12 和KCNJ4.其中,Kir2.1是重要的亚型[3], 也是组成人类心肌细胞IK1电流的主要亚单位[4],大量研究表明IKir2.1减弱或增强均可导致严重的心律失常[1,2].基于此,国内外众多学者在抗心律失常药物筛选过程中将目光投向了Kir2.1 通道,Kir2.1 通道电流克隆细胞模型成为必备的研究工具.本研究利用分子克隆技术, 构建pEGFP-N1-Kir2.1 真核表达质粒, 并对其在人胚胎肾细胞(HEK293)中的表达进行检测.
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NS基因克隆及人成骨肉瘤细胞和人胚胎肾细胞NS基因的表达
目的:研究nucleostemin(核干细胞因子,NS)基因在人成骨肉瘤细胞(OS-732)和人胚胎肾细胞(HEK-293)的表达情况,并克隆该基因的部分片段.方法:以OS-732细胞和HEK-293细胞为实验材料,进行细胞总RNA的提取、反转录反应、PCR反应、NS基因片段的克隆及测序等.结果:(1)提取的总RNA质量很高,基本上无降解;(2)OS-732细胞和HEK-293细胞中均有NS基因的表达,并且在相同量底物的情况下,OS-732细胞NS基因的表达量明显高于HEK-293细胞;(3)将PCR产物成功地与pGEM-T克隆载体连接,构建为pGEM-T-NS质粒,测序结果表明NS基因片段序列与基因库中登陆的序列完全一致.结论:本文成功地从OS-732细胞和HEK-293细胞克隆到NS基因片段,OS-732细胞NS基因的表达量明显高于HEK-293细胞.
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人Kv1.5通道基因转染人胚胎肾细胞的研究
目的 建立表达人Kv1.5通道的细胞模型.方法 采用Lipofactamine 2 000脂质体将人Kv1.5通道基因转染人胚胎肾细胞(HEK293),通过荧光显微镜和全细胞膜片钳技术观测人Kv1.通道基因的表达.结果 pcDNAHKv1.5真核表达载体转染HEK293细胞2 d后,荧光显微镜可观察到人Kv1.5通道表达;3 d后全细胞膜片钳技术记录到人Kv1.5通道基因编码的通道电流.结论 pcDNAHKc1. 5真核表达载体转染HEK293细胞为人Kv1.5通道的研究提供了良好的真核细胞表达系统和细胞模型.
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人Kv1.3通道基因转染人胚胎肾细胞的研究
目的:建立表达人Kv1.3通道的细胞模型,为临床研究提供帮助.方法:Lipofactamine2000脂质体将人Kv1.3通道基因转染人胚胎肾细胞(HEK293),通过荧光显微镜和全细胞膜片钳技术观测人Kv1.3通道基因的表达.结果:pcDNAHKv1.3真核表达载体转染HEK293细胞2 d后,荧光显微镜可观察到人Kv1.3通道表达;3 d后全细胞膜片钳技术记录到人Kv1.3通道基因编码的通道电流.结论:pcDNAHKv1.3真核表达载体转染HEK293细胞为人Kv1.3通道的研究提供良好的真核细胞表达系统和细胞模型,有利于指导治疗自身免疫性疾病新药的开发.
