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植物硒的含量、形态特征及预防肿瘤功能研究进展
自然界中硒可分为无机硒和有机硒,无机硒指单质硒、硒酸盐和亚硒酸盐,其中某些硒酸盐和亚硒酸盐常被作为营养补充剂使用~([1]);有机硒可分为小分子有机硇化合物、硒蛋白、硒多糖等,其中,小分子有机硒化合物包括硒代氨基酸和非氨基酸硒化合物.硒蛋氨酸和硒半胱氨酸能够结合进入体蛋白,故称为蛋白硒氨基酸;所有与硒结合的蛋白称为含硒蛋白,其中由UGA密码子编码的硒半胱氨酸参入的蛋白称为硒蛋白;其他不能结合进人体蛋白的硒代氨基酸则被称为非蛋白硒氨基酸,如甜菜碱、甲基硒代半胱氨酸及其谷氨酰胺衍生物等,非蛋白硒氨基酸和非氨基酸硒化合物合称非蛋白硒化合物.
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禽流感HA基因密码子优化的DNA疫苗构建及其免疫原性的初步研究
目的 构建H5 N1亚型禽流感病毒株密码子优化的血凝素(HA)DNA疫苗并研究其免疫原性.方法 应用MacVector软件分析H5N1亚型禽流感病毒A/Viet Nam1203/04株HA(H5-VN HA)基因序列,对这些序列进行密码子优化处理,人工合成优化后的H5-VN HA基因.将密码子优化H5-VN HA基因与pSW3891质粒连接,并以人组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)信号肽取代H5-VNHA信号肽,构建成表达H5-VN HA基因的重组质粒,命名为HA-VN.tPA(即密码子优化的H5-VN HA基因DNA疫苗).以HA-VN.tPA转染293T细胞,应用蛋白质印迹法检测转染细胞中HA蛋白的表达.以HA-VN.tPA对2只新西兰兔进行DNA免疫,用ELISA方法检测分析免疫后兔血清中HA特异性抗体的产生.结果 密码子优化的H5-VN HA基因中哺乳动物细胞偏爱的密码子频率高于野生型H5-VN HA基因.蛋白质印迹法分析结果表明,HA-VN.tPA转染293T细胞后,细胞裂解液中检测出HA蛋白的表达.ELISA分析结果表明,以HA-VN.tPA免疫3次后,实验兔体内产生了较高水平的HA特异性抗体(血清中平台期抗体滴度达1:13 500).结论 成功构建了H5N1亚型禽流感病毒密码子优化的HA基因DNA疫苗,该疫苗可引导免疫后宿主体内产生高滴度特异性抗体.
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人谷草转氨酶的基因改造及高效重组表达
目的构建人谷草转氨酶（AST）高效重组表达体系。方法优化编码人 AST的核苷酸密码子，合成人 AST新的基因，并将其克隆至 pRSF-Duet表达载体中，转化大肠杆菌 BL21，以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白的表达，并通过改变诱导剂浓度、振摇速度及诱导温度优化表达条件，以产生可溶性蛋白。可溶性蛋白经镍离子柱亲和层析及分子筛层析纯化，以 SDS-PAGE电泳及蛋白质免疫印迹鉴定蛋白的性质，对重组蛋白的活性及在血清基质中的稳定性进行检测。结果经过优化的 AST密码子在大肠杆菌中的使用频率均在10%以上；重组蛋白存在于上清和沉淀中，经表达优化，在 IPTG终浓度为2 mmol/L、25℃、150 r/min振摇8 h诱导条件下，可增加可溶性蛋白的产率，纯化后的目的蛋白经电泳及免疫印迹鉴定为谷草转氨酶，活性可达136000 U/L，且在含有蛋白酶抑制剂的血清中稳定存在。结论通过密码子优化，成功构建了重组 AST的高效表达系统，重组蛋白可以达到作为参考物质原料的要求。
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密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒VP6基因表达量的研究
目的 通过密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒VP6基因的表达量.方法 人工合成按照人的优势密码子优化的人轮状病毒VP6基因,包装重组腺病毒后,与未优化的相同基因的重组腺病毒用免疫荧光和Western Blot方法比较其表达量.结果 密码子优化的人轮状病毒VP6基因,与未优化的相同基因的重组腺病毒比较,其蛋白表达量大大提高.结论 密码子优化确实提高了重组腺病毒中人轮状病毒VP6基因的表达量,可望满足腺病毒载体疫苗的研发需要.
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优化密码促进HPV 6b E7蛋白表达及DNA疫苗诱导的细胞免疫反应
目的探讨优化密码对人乳头瘤病毒6b型(HPV 6b)基因表达及免疫原性的影响,为治疗性DNA疫苗的研究奠定基础.方法设计合成含优化密码及pRB结合位点突变的HPV 6bE7(hu-mE7)全长基因.测序验证无误后,定向克隆于pcDNA3的KpnⅠ和EcoRⅠ位点,成功构建真核表达质粒pcDNA3-hu-mE7.体外转染COS-1细胞,免疫荧光检测其E7蛋白表达.C57BL/6小鼠胫前肌内接种裸DNA,观察其诱导的细胞免疫反应. 结果 pcDNA3-hu-mE7在COS-1细胞获得明显表达,表达产物主要位于细胞核中.DNA免疫结果显示,与含有野生型E7基因的表达质粒pcDNA3-wtE7比较,pcDNA3-hu-mE7免疫小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ产生明显升高,CD8+和CD4+淋巴细胞活性增强.结论优化密码能促进HPV 6b E7蛋白表达及DNA疫苗诱导的细胞免疫反应.
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PD-L1重组蛋白的表达及生物学活性分析
目的 构建细胞程序死亡因子1配体1(PD-L1)的重组表达质粒,在原核系统中表达并分析其生物学活性.方法 经密码子优化后合成PD-L1全基因序列,构建硫氧还原蛋白-pET43b/(PD-L1)重组表达质粒并在大肠埃希菌中表达;用ELISA验证表达产物与其受体结合的生物学活性.结果 正确构建了PD-L1重组表达质粒及其大肠埃菌基因工程菌,能稳定、高效地表达目的 蛋白,相对分子质量为47×103,目的 蛋白能与其受体特异性结合.结论 成功获得有生物学活性的PD-L1重组蛋白,为研制单克隆抗体及其与病毒感染慢性化的关系提供基础条件.
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人博卡病毒VP2蛋白的原核表达及血清学检测方法的建立
目的 获得高表达量的人博卡病毒( HBoV1、HBoV2) VP2蛋白,建立血清学检测方法.方法 按照大肠埃希菌密码子使用偏性,对HBoV1、HBoV2 VP2衣壳蛋白基因编码区序列进行优化合成.将合成的目的基因克隆至表达载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-VP2,转化大肠埃希菌BL21 (DE3),使用IPTG诱导表达并摸索佳表达条件;粗提取蛋白进行Ni亲和层析纯化后建立间接酶联免疫吸附试验( ELISA),进行临床血清标本筛查,分析人群HBoV1、HBoV2感染情况.结果 优化合成的HBoV1、HBoV2 VP2基因正确连接至pET30a载体,开放阅读框正确,用1 mmol/L IPTG过夜诱导表达(25℃)得到高表达量的VP2蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在.粗提取蛋白经NiNTA亲和层析,在pH4.5时获得较理想的纯化蛋白,以其为抗原建立ELISA检查方法,筛查临床血清标本IgG抗体水平,结果显示健康儿童HBoV1阳性率为62.2％,HBoV2阳性率为55.5％,混合感染率为37％.结论 本研究成功将HBoV1、HBoV2 VP2衣壳蛋白基因编码区序列进行优化,得到了较高的蛋白表达量,所建立的ELISA法可以应用于HBoV1、HBoV2人群血清流行病学调查.
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HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因改造及其重组DNA疫苗的构建
目的 构建表达含有密码子优化的HIV-1 CRF01_AE亚型env基因的DNA疫苗,为多载体艾滋病治疗性疫苗的应用提供候选疫苗.方法 对HIV-1感染者血液样本进行型别分析,分型得到的AE亚型标本采用亚型特异性引物克隆env基因,通过序列比对获得其共有序列,对该序列按照哺乳动物密码子使用的偏嗜性进行优化,将人工合成的优化基因克隆至pVR载体,构建DNA疫苗.通过Western Blot方法比较优化前后env基因的表达.结果 成功获得32条具有完整的开放性阅读框的env克隆,型别分析确认均为CRF01_AE亚型.成功对其共有序列进行了优化、合成并构建了DNA疫苗pVR-mod.AE env,该疫苗与野生型的env基因(wt.AE env)相比可以高水平表达env基因,且不依赖Rev的存在.结论 对HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因的优化改造及重组DNA疫苗的构建是成功的.
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密码修饰可增强沙眼衣原体MOMP DNA质粒免疫小鼠的免疫应答
目的探讨密码修饰对沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因表达和DNA质粒免疫的影响.方法根据人类密码子使用偏好对鼠肺炎沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis mouse pneumonitis)MOMP基因进行优化修饰,设计合成人源化MOMP基因(HuMOMP).构建以pcDNA3为载体的含HuMOMP及含野生型MOMP基因(WtMOMP)的真核表达质粒.瞬时转染COS-1细胞,Western blot方法比较HuMOMP基因及WtMOMP基因在哺乳动物细胞中的蛋白表达水平.DNA质粒肌内免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清特异性抗体、DTH和淋巴细胞增殖反应,比较优化密码MOMP基因和野生型MOMP基因DNA质粒免疫的免疫效果.结果人工合成HuMOMP基因,成功构建重组真核表达质粒pcDNA3-HuMOMP及pcDNA3-WtMOMP.转染细胞Western blot结果显示,HuMOMP基因的蛋白表达水平明显高于WtMOMP基因.ELISA结果表明,HuMOMPDNA质粒免疫组小鼠血清特异性IgG抗体有所升高;细胞免疫检测结果显示,HuMOMP DNA质粒免疫组小鼠足垫肿胀程度增强、淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)增高,两者与WtMOMP DNA质粒免疫组相比P＜0.05,差异均有统计学意义.结论人源化密码修饰能够增强沙眼衣原体MOMP基因在哺乳动物细胞中的蛋白表达及DNA质粒免疫小鼠的免疫反应,这对于新型衣原体DNA疫苗的研究具有重要意义.
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人丙氨酸转氨酶高效重组表达体系的构建
目的：构建人丙氨酸转氨酶（ ALT）高效重组表达体系，为ALT相关参考物质的原料制备奠定基础。方法利用生物信息学方法优化编码人ALT核苷酸序列中的密码子，合成人ALT新的基因，并将其克隆至pRSF-Duet表达载体中。重组表达质粒pRSF-Duet-ALT转化大肠埃希菌BL21，以2 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导目的蛋白的表达，并通过改变诱导剂浓度、振摇速度及诱导温度优化表达条件，以产生可溶性蛋白。可溶性蛋白经镍离子柱亲和层析及分子筛层析纯化，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）及蛋白质免疫印迹（ Western blot）鉴定蛋白的性质，并对重组蛋白的活性、不同储存条件下在血清基质中的稳定性进行检测。结果经过优化的ALT核苷酸密码子在大肠埃希菌中的使用频率均在10％以上；经表达优化，在IPTG 终浓度为2 mmol/L、25℃、150 rpm振摇8 h诱导条件下，可增加可溶性蛋白的产率；纯化后的目的蛋白经电泳及免疫印迹鉴定为谷丙转氨酶，活性可达80000 U/L。重组ALT在2～8℃、25℃均可稳定2～8 d，相对偏差均在5％以内。结论通过密码子优化，成功构建了重组ALT的高效表达系统，本重组蛋白可以达到作为参考物质原料的要求。（中华检验医学杂志，2014，37：767-771）
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中国裕固族及汉族人MBL基因ExonI 54位密码子点突变频率研究
甘露糖结合凝集素(mannan binding lectin,MBL)是一种由肝脏产生的可溶性的C型凝集素.能够识别、结合多种微生物或异体抗原表面糖蛋白糖链末端的甘露糖残基和(或)N-乙酰葡萄糖胺,进一步通过胶原样区域调理吞噬作用清除致病原,同时还可以通过凝集素补体途径活化补体,在机体免疫防御和免疫监视中具有重要作用.
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结核分枝杆菌对乙胺丁醇耐药突变基因检测方法的建立
乙胺丁醇(EMB)是一线抗结核药物,近的研究结果表明,结核分枝杆菌(结核菌)对EMB耐药的产生与阿拉伯糖基转移酶编码基因embB改变有关.其中embB基因(尤其是306位密码子)突变是产生对EMB耐药的主要分子机制.聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)是近年发展起来的常用的基因突变分析技术,结合染色法(silver staining),使其应用前景更为广阔.我们应用PCR-SSCP银染技术和PCR-直接测序法对河南省耐药监测中收集的87株结核分离株embB基因进行了研究.
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焦磷酸测序法检测结直肠癌患者k-ras基因突变
研究证明,k-ras癌基因的激活在CRC发生发展过程中起重要作用[1].k-ras基因常见的激活方式为点突变,其中90%以上的突变发生在1号外显子第12位密码子(野生型:GGT)和第13位密码子(野生型:GGC)[2],突变率约30%～49%[3].近年来,k-ras基因是否突变已成为西妥昔单抗能否用于CRC分子靶向治疗的用药评判标准[4].因此,如何快速准确检出k-ras 基因突变对这类药物的应用及疗效预测显得尤为重要.焦磷酸测序法是一种酶促级联测序技术,特别适用于SNP常规检测[5].
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prion是怎样感染传播的?
问:prion是怎样感染传播的?答:现已证明,疯牛病、绵羊瘙痒症、人Kuru病的prion病原体均通过食物污染而传播.如Kuru病是因巴布亚新几内亚的土人吃死人脑的陋习而感染.疯牛病是因健康牛吃了含prion的人工饲料而感染.而人的克雅病是由于医源性的硬脑膜器官移植或应用人脑垂体生长激素而感染,也有病理解剖或外科医师在手术过程接触而传染的报道,还可能因遗传而致,表现为家族性克雅病,如以色列籍黎巴嫩人高发,其原因与prp基因密码子第200位点变异有关.
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血管活性肠肽对胰腺癌细胞的生长调控
目的:研究血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide,IP)对人胰腺癌细胞株AsPC-1、PANC-生长调控,并探讨作用机制.方法:人胰腺癌细胞株AsPC-1、PANC-1进行细胞培养、传代.在无血清培养24 h后,分别加入VIP浓度为10-11 nlL/L～10-5 moL/L应用MTT法观察细胞的增生;用RT-PCR法检测上述细胞株VIP受体(VPAC1)mRNA的表达;直接测序法检测K-ras基因突变;用Western-blotting检测磷酸化MAPK(mitogen-activatedprotein kinase).结果:VIP(10-9～10-5moL/L)对胰腺癌细胞株AsPC-1有明显促生长作用,细胞增生强的浓度是10-8 moL/L,且这种作用能被受体的拮抗剂(D-P-cl-Phe6-Ln17)VIP所阻断;胰腺癌细胞株AsPC-1上有VPAC1 mRNA的表达;同时VIP能显著增加MAPK(即ERK)的磷酸化;直接测序法显示,在AsPC-1细胞株中,-ras基因第12密码子无点突变.结论:VIP对该受体表达的胰腺癌细胞株AsPC-1有促生长作用,其机制可能通过蛋白激酶信号传导途径,与ras 基因突变无关.
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K-ras基因在胰腺癌和慢性胰腺炎中突变和表达异常及其临床意义
目的:探讨Ras蛋白过度表达与胰腺癌和慢性胰腺炎临床病理的关系,以及K-ras突变在慢性胰腺炎中的临床意义和在胰泉癌诊断中的价值.方法:应用EnVision显色系统免疫组化方法分别检测胰腺癌组织(24例)、癌旁组织(77例)、手术切缘正常组织(16例)和慢性胰腺炎(24例)石蜡包埋组织中P21 ras的表达情况.应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法分别检测胰腺癌、癌旁组织、手术切缘正常组织、慢性胰腺炎石蜡包埋组织的K-ras突变并进行DNA测序确认.结果:P21 ras在胰腺导管腺癌组织中的表达阳性率为58.3%(14/24),与慢性胰腺炎胰腺导管增生组织的P21 ras表达阳性率45.8%(11/24)相比,二者差异无显著性(P＞0.05):P21 ras在良、恶性胰腺疾病增生性病变中的表达阳性率为36.6%(30/82),与其在正常胰腺组织中的表达阳性率(0%)相比,有显著性差异(P＜0.05);P21 ras蛋白在正常胰腺组织、导管增生性病变、导管不典型增生中的表达阳性率分别为0%、36.6%和78.9%,呈渐进过程,而且增生性导管病变与不典型增生相比,P21 ras表达阳性率的差异具有显著性(P＜0.05).胰腺癌K-ras12密码子突变率(79%)显著高于慢性胰腺炎(33.3%)(P＜0.01),且在切缘正常组织→癌周导管增生→癌周不典型增生→胰腺癌过程中,突变率有逐渐上升的趋势.突变方式以12密码子GGT→GAT、GTT、CGT为主且同1例患者突变方式一致.结论:P21 ras过度表达和K-ras基因突变在胰腺癌发生中起到作用,但K-ras基因突变作为胰腺癌诊断的分子标志缺乏特异性.
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K-ras 12密码子点突变在胰腺癌早期诊断中的意义
胰腺癌的早期诊断相当困难,众多的研究已证实K-ras12密码子点突变与胰腺癌相关性好.选择敏感的检测方法检测多种途径获取的标本中K-ras12密码子点突变,为胰腺癌的早期诊断提供了可能.本文综述了近年来由胰腺细针穿刺(FNA)、胰液、十二指肠液、外周血和粪便等获取的标本中K-ras12密码子点突变的检测及对胰腺癌早期诊断的价值.
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胰腺癌及相关胰腺疾病组织中K-ras12、13密码子突变的检测及其临床诊断价值
目的 研究K-ms基因第12、13位密码子突变在胰腺导管腺癌及相关胰腺疾病组织中的定量检测及其临床意义.方法 收集经手术切除的130例(胰腺导管腺癌105例,胰腺腺鳞癌8例,胰腺黏液腺癌2例,内分泌癌3例,十二指肠及壶腹部恶性肿瘤6例,胰腺良性疾病6例)有明确病理诊断的组织标本及临床资料,应用双荧光探针联合肽核酸钳制实时定量PCR方法检测组织中K-ras基因第12、13密码子的突变量,以突变量＞100拷贝为阳性计算突变阳性率.结果 胰腺导管腺癌、腺鳞癌、黏液腺癌、内分泌癌、十二指肠及壶腹部恶性肿瘤、胰腺良性疾病的K-ras12密码子突变量的中位数及四分位数分别为4062(495,10800)、238(45,8420)、15(9,21)、3(3,16)、2283(73,5037)和21(8,56)；突变阳性率分别为84.8％ (89/105)、50.0％(4/8)、0、0、66.7％ (4/6)和16.7％(1/6).胰腺导管腺癌的K-ras12密码子突变量及阳性率与胰腺腺鳞癌、十二指肠及壶腹部恶性肿瘤差异无统计学意义,而较胰腺黏液腺癌、内分泌癌、胰腺良性疾病显著增加(P值均＜0.05).通过接受者操作特征(ROC)曲线分析,胰腺导管腺癌K-ras 12密码子突变的曲线下面积为0.727,诊断胰腺导管腺癌的敏感性及特异性分别为84.8％、64.0％.胰腺导管腺癌的K-ras基因第12密码子突变量与患者生存期显著相关.胰腺导管腺癌的K-ras 13密码子突变量及阳性率与其他胰腺疾病的差异无统计学意义.结论 K-ras12密码子基因突变对胰腺癌有较好的鉴别诊断及患者预后判断价值.
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甘露糖结合蛋白基因突变与肝硬化及肝癌关系的研究
目的探讨甘露糖结合蛋白(MBP)基因突变与肝硬化及肝癌的关系.方法采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法和实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术针对代偿性肝硬化(CC)患者73例、失代偿性肝硬化(DC)患者78例、肝细胞癌(HCC)患者35例和对照组88例健康者的MBP基因第54位密码子多态性进行检测.结果 HCC组的MBP基因GGC/GAC基因型频率和GAC等位基因频率与对照组比较,差异无统计学意义(P ＞ 0.05).CC组、DC组MBP基因GGC/GAC基因型频率和GAC等位基因频率均显著高于HCC组和对照组(P ＜ 0.05),其中DC组突变率高(36.5%).结论 MBP第54位密码子与肝硬化进展相关,但可能并非HCC发展中的重要因素.
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阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者β3肾上腺素受体基因Trp64Arg突变的研究
随着阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)研究的深入,越来越多的研究涉及遗传因素.自从1978年Strohl等[1]首次证实了1例家族性OSAHS后,相继出现了OSAHS存在家族聚集现象[2]和遗传因素[3]的报道.有研究指出,几乎有30%～40%的与呼吸暂停发生有关的危险因素可以用遗传因素来解释[4],其中肥胖作为OSAHS的重要危险因素,主要由遗传因素决定[5].β3-AR是一种G蛋白偶联的膜表面受体,主要分布于棕色脂肪组织,具有调节脂肪分解和能量消耗的重要作用.近年有研究报道,β3-AR基因第64位密码子点突变可致机体内脂肪分解下降,生热作用减弱,成为肥胖的发病因素之一[6].那么β3-AR的基因突变是否可能通过肥胖而影响OSAHS的发病呢?我们的研究旨在探讨β3-AR基因突变与肥胖及OSAHS发病之间的关系.目前国内外尚无相关报道.
