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大肠杆菌偏嗜性人促甲状腺激素β亚基编码DNA序列的克隆及表达
目的:构建PGEX-3X/大肠杆菌偏嗜性人促甲状腺激素(hTSH)13DNA编码序列原核表达载体,并在E.coliDH5α中进行表达,用于GD(Graves diease)的实验研究.方法:用大肠杆菌偏嗜性密码子替换已知hTSHβ亚基基因编码序列中相应的密码子,按重新设计后的编码序列进行DNA化学合成,然后克隆入表达载体pGEX-3X并进行酶切电泳、测序鉴定,进而在E.coli DH 5α中进行诱导表达.对所表达的GST融合蛋白进行SDS-PAGE、Western blotting及hTSH电化学发光免疫测定.结果:经鉴定,重组质粒pGEX-3X/hTSHβ含有与预期结果一致的435 bp编码hTSHβ链的DNA序列.表达产物为hTSHβ与GST融合蛋白.分子质量约42 ku,于SDS-PAGE中的相应部位可见深染的特异性蛋白条带,可被GST抗体识别并可被抗hTSH抗体检测.结论:实验成功建立了hTSHβ肽链的体外表达系统,为进一步制备hTSHAb及进行GD的研究奠定了基础.
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携蜂毒素基因重组腺病毒载体的构建
目的构建含巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子或甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP) 调控序列驱动下的蜂毒素基因的重组腺病毒,进行体外抗肿瘤效果的比较.方法人工合成蜂毒素基因时,用Kozak序列优化翻译起始区,并进行人类适密码子的转换,然后置于CMV启动子或AFP调控序列之后,用细菌内高效同源重组法构建腺病毒质粒,脂质体转染293细胞进行包装.结果目的基因成功地重组人腺病毒质粒.结论上述蜂毒素-腺病毒载体构建时的几个特点,有助于载体的顺利构建,并为下一步的实验奠定了基础.
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肝豆状核变性的治疗及预后
肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration,HLD),又称Wilson病,是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍引起的全身性疾病,世界范围内,发病率为1/30000～1/100000[1],致病基因定位在染色体13q14.3区,称为ATP7B基因,编码一种铜运P型三磷酸腺苷(ATP)酶;其突变致铜与前铜蓝蛋白结合,使转运蛋白铜蓝蛋白减少,大量未经结合的铜排泄障碍,铜在肝、脑、肾等重要器官中蓄积,引起以肝和脑损害为主的疾病.张忠胜等[2]采用PCR产物直接DNA测试法检测,发现ATP7B基因8号外显子778密码子是HLD患者的高频突变位点,12号外显子952密码子可能是HLD患者的高频突变位点,未发现14号外显子基因突变.HLD通常发生在儿童期或青少年期,其发病年龄悬殊,各器官损害顺序、程度及进展速度存在差异,导致首发症状不一、临床表现多样;一般而言,儿童期患者大部分以肝病为主的症状首发;青壮年期患者大多以震颤为主的神经症状首发,部分以构音障碍、肌张力障碍、精神障碍等神经精神症状首发;少数以血液、肾脏、骨关节肌肉、皮肤等症状起病.HLD是少数可以有效控制的遗传性疾病,早期诊断、系统治疗,可以亨受健康人一样的生活和寿命;如果发病时间长或出现严重并发症且不接受系统驱铜治疗,可终致残、致死,给家庭和社会带来沉重的经济负担和社会负担.本文对肝豆状核变性的治疗及预后综述如下.
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终止密码子位点及无义突变介导的mRNA降解途径抑制对抗早发性无义突变药物atalruen通读效率的影响
目的：探讨终止密码子上下文结构和无义突变介导的mRNA降解途径（NMD）抑制对抗早发性无义突变（PTC）药物atalruen通读效率的影响。方法利用聚合酶链反应（PCR）定点突变的方法构建双荧光哺乳动物表达载体的早发性无义突变体pDsRed-EGFPmtag-Y596X和pDsRed-EGFPmtag-Y653X，转染哺乳动物细胞COS7，抗早发性无义突变药物atalruen，结合siRNA-upf1、放线菌酮（CHX）共同作用转染细胞，采用实时荧光定量PCR反应检测突变体上红色荧光蛋白（DsRed）和绿色荧光蛋白（EGFP）的表达，测定通读效率。结果PTC突变体pDsRed-EGFPmtag-Y653X对atalruen的促通读敏感性显著大于pDsRed-EGFPmtag-Y596X；siRNA-upf1和CHX抑制NMD对atalruen的促通读效率没有显著影响。结论 PTC位点的＋4位核苷酸对于atalruen的促通读效率十分关键，该位置是胞嘧啶（C）的突变体敏感性要显著大于腺嘌呤（A）；atalruen与常见促通读氨基糖苷类药物不同，不能协同NMD途径的抑制来促进早发性无义突变的通读。
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终止密码子位点及无义突变介导的mRNA降解途径抑制对抗早发性无义突变药物atalruen通读效率的影响
目的：探讨终止密码子上下文结构和无义突变介导的mRNA降解途径（NMD）抑制对抗早发性无义突变（PTC）药物atalruen通读效率的影响。方法利用聚合酶链反应（PCR）定点突变的方法构建双荧光哺乳动物表达载体的早发性无义突变体pDsRed-EGFPmtag-Y596X和pDsRed-EGFPmtag-Y653X，转染哺乳动物细胞COS7，抗早发性无义突变药物atalruen，结合siRNA-upf1、放线菌酮（CHX）共同作用转染细胞，采用实时荧光定量PCR反应检测突变体上红色荧光蛋白（DsRed）和绿色荧光蛋白（EGFP）的表达，测定通读效率。结果PTC突变体pDsRed-EGFPmtag-Y653X对atalruen的促通读敏感性显著大于pDsRed-EGFPmtag-Y596X；siRNA-upf1和CHX抑制NMD对atalruen的促通读效率没有显著影响。结论 PTC位点的＋4位核苷酸对于atalruen的促通读效率十分关键，该位置是胞嘧啶（C）的突变体敏感性要显著大于腺嘌呤（A）；atalruen与常见促通读氨基糖苷类药物不同，不能协同NMD途径的抑制来促进早发性无义突变的通读。
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BRAF基因突变在甲状腺乳头状癌不同组织亚型中的表达
甲状腺癌的发病率持续升高，部分地区10年来增长了近10倍［1］。甲状腺乳头状癌发病率的增加直接导致甲状腺癌发病率的增加，甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma ，PTC）是甲状腺癌中常见的类型，占60％～80％［2］。近年来，有关PTC 分子机制的研究表明，BRAF V600E基因突变是促使 PTC 形成与进展的重要分子改变。BRA F基因是一个含有18个外显子，位于7号染色体长臂的基因，具有蛋白激酶活性，是M A PK通路中为关键的激活因子。BRA F 基因主要的突变模式为15号外显子的错义突变，这种分子学异常改变会导致所翻译的相应蛋白中600位密码子对应的缬氨酸变为谷氨酸，从而使所产生的蛋白质具有较强的蛋白激酶活性，激活M A PK 信号通路如RAS‐RAF‐MEK‐MAPK通路，造成细胞有丝分裂失控而后形成肿瘤。
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无义密码子介导的mRNA降解机制与疾病
无义密码子介导的mRNA降解(nonsenfe mediated mRNAdecay,NMD)现象的发现,早源于1979年美国学者Losson和Lacroute在对酵母菌URA 3基因的研究中观察到无义密码子突变体在mRNA瞬时合成率并非很低的情况下能够降低mRNA水平[1].随着分子生物学的研究进展,NMD机制在酵母、果蝇、线虫以及哺乳动物细胞中都得到了证实.1999年Hentze和Kulozik[2]在
上发表了关于NMD的文章,NMD机制开始引起人们重视.近年来的研究揭示了NMD与人体遗传病和癌症的发生机制有着十分密切的关系[3].本文就NMD机制以及与人类遗传疾病的研究综述如下. | -
β3-肾上腺素能受体基因与糖尿病关系的研究进展
近年来，在糖尿病的研究领域中，越来越多地涉及遗传因素与环境因素(如年龄的增加、肥胖、过食、运动不足、应激性事件、妊娠、感染等)在糖尿病发生中的作用及其对健康的长远影响。β3-肾上腺素能受体(β3-adrenergic receptor，β3-AR)是一种G蛋白耦联的膜表面受体，具有调节脂肪分解和能量消耗的重要作用[1]。β3-肾上腺素能受体基因第64位密码子点突变可致机体内脂肪分解下降、生热作用减弱，而成为肥胖、胰岛素抵抗、非姨胰岛素依赖型糖尿病(non-insulin dependent diabetesmellitus，NIDDM)等的病因之一[2]。本文就β3-AR基因生物学特性、作用以及β3-AR基因型与糖尿病成因之间的关系作一综述。
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吸烟与肺癌p53及K-ras基因突变关系的研究进展
p53和K-ras基因突变常见于肺癌,吸烟是引起p53和K-ras基因突变的主要危险因素.吸烟相关性肺癌基因突变以G→T为主,这在其它肿瘤及不吸烟者肺癌很少见.p53基因突变常发生于第157、156、245、248、273密码子,K-ras基因突变常发生于第12密码子,他们都是烟草致癌物的强结合位点.对吸烟与p53、K-ras基因突变关系的研究,在临床早期诊断及判断预后等方面均有应用价值.
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大肠癌相关基因的研究进展
癌基因正常情况下是以其前身原癌基因的形式存在于每个细胞基因正常的成份中,当这些原癌基因以某种方式被激活将会发生细胞的癌变,而此癌的发生与多个癌基因有关.肿瘤ras基因突变发生在第12、13或61位密码子,其点突变影响产物P21水解GTP的能力,而导致细胞癌变.ras基因突变见于50%的大肠腺癌和58%＞1cm肿瘤中,K-ras突变约占大肠癌中的88%,仅少部分见于N-ras突变,David等从病人的粪便中提取DNA发现含有变异的ras基因,其变异基因与在肿瘤中检测的变异基因相同,而这些位点是在12和13密码位点.此方法可用于检测不同饮食或治疗的病人,预计可隆低结肠肿瘤的发病率.对于＜1cm腺癌ras突变率很低,而其突变与肿瘤位点、浸润深度及分化程度有关.有ras突变的腺癌比无ras突变者更易向恶性转化.
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北方汉族人MBL EXON Ⅰ 52位基因频率调查
甘露糖结合凝集素(Mannan Binding Lectin,MBL)是一种由肝脏合成和分泌的急性时相蛋白,是Ca2+依赖性凝集素中胶凝素成员之一,可与甘露糖残基结合,参与细胞表面识别,广泛存在于人的肝脏和血液中,是天然免疫的重要组成部分,MBL基因多态性影响MBL水平,MBl的功能及基因结构和感染性疾病的关系近年来倍受关注[1,2].以往的群体研究已发现MBL存在3种结构基因的变异型D,B,C.其突变位点均位于外显子1,分别为52(CGT→TGT),54(GGC→GAC)及57(GGA→GAA)位密码子,并导致氨基酸的改变,影响了亚单位的空间结构和寡聚体的形成,从而形成无功能的蛋白.这样的蛋白大约95%被降解,所以具有变异型MBL的个体,其血清MBL水平低下,导致调理功能缺陷[3,4].本研究采用已建立MBL EXON Ⅰ 52位密码子突变检测的方法,即序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)[5],用该方法测定健康汉族人MBL基因EXON Ⅰ 52位密码子点突变的情况,为深入探索MBL基因突变引起调理吞噬缺损的机制和MBL分子的结构-功能关系及MBL在临床中的治疗应用奠定基础.
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优化密码子提高EGF-PE35KDEL表达量
目的提高EGF-PE35KDEL融合蛋白的表达量.方法设计合成含优化密码子的EGF序列,定向克隆于pET28a-EGF-PE35KDEL的Nco Ⅰ和Nde Ⅰ位点,构建表达质粒pET28a-pBEGF-PE35KDEL.将两种表达质粒转化至BL21中,经IPTG诱导,比较表达量.结果优化密码子的EGF-PE35KDEL表达量要高于未优化的EGF-PE35KDEL.结论优化密码子能促进EGF-PE35KDEL的表达.
关键词： EGF-PE35KDEL 基因 密码子 表达 -
MATLAB 7.X生物信息工具箱的应用——基因序列分析(一)
MATLAB 7.X生物信息工具箱为广大用户提供了一个用于基因组和蛋白质组分析的综合环境,它利用数据库资源,使科学研究事半功倍,在工具箱提供的开放环境里,用户甚至可以按照自己的目的来设计和利用分析工具.本文主要介绍了MATLAB7.X生物信息工具箱在基因序列分析中的应用,包括确定核苷酸组成,密码子组成,氨基酸转化和组成等,所有操作简便高效,结果可视化程度高.
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人促红细胞生成素基因的优化及其在大肠杆菌中的表达
目的 对人促红细胞生成素(human erythropoietin,HuEPO)基因进行优化,提高其在大肠杆菌中的表达量以及纯化过程中的回收率.方法 对HuEPO基因的碱基序列进行设计,用大肠杆菌偏爱密码子替换稀有密码子,构建高效表达重组(r) HuEPO(rHuEPO)的基因.设计rHuEPO的氨基酸突变位点,并对这些位点进行定点诱变,获得高亲水性的突变(M) rHuEPO(MrHuEPO).对rHuEPO和MrHuEPO的三级结构进行预测及对比,验证突变位点设计的合理性.将rHuEPO和MrHuEPO基因克隆至表达载体pET-15b,并在大肠杆菌中进行表达.对表达产物进行初步纯化和复性,比较复性时的rHuEPO和MrHuEPO可溶性和回收率,并用HuEPO活性检测试剂盒检测rHuEPO和MrHuEPO的活性.结果 rHuEPO和MrHuEPO在大肠杆菌中得到成功表达,表达量均＞25％.三级结构预测对比结果表明,突变位点设计合理.rHuEPO和MrHuEPO的表达量无明显差别,但复性时MrHuEPO的可溶性(回收率＞90％)明显高于rHuEPO(回收率＜25％).rHuEPO和MrHuEPO的比活分别为2.36×105和2.33×105 IU/mg.结论 成功构建了可在大肠杆菌中高效表达rHuEPO和MrHuEPO的基因,并通过定点诱变提高了复性时的MrHuEPO可溶性.
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密码子优化的HPV6b L1 DNA诱导BALB/c小鼠产生增强的免疫应答
目的 探讨真核细胞偏好密码子优化对人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6b型L1 DNA诱导BALB/c小鼠特异性体液和细胞免疫应答的增强效应.方法 利用PCR从尖锐湿疣组织中扩增HPV6b L1基因,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建野生型pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)并进行鉴定;同时,对HPV6b L1基因进行真核细胞偏好密码子优化,进一步通过重叠PCR的方法获得全长基因,构建密码子优化的重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)并进行鉴定.将6～8周龄雌性BALB/c小鼠分成4组,分别肌肉注射3次pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)、pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)、pcDNA3.1(+)载体和PBS,间隔2周,每次剂量为150μg/鼠.分别于免疫前和免疫后每隔2周,收集血清,用间接ELISA检测血清igG抗体;并于第8周取小鼠脾细胞,采用乳酸脱氢酶释放法,按效应细胞与靶细胞之比(E:T)为5:1、10:1、20:1进行免疫小鼠特异性CTL杀伤活性检测.结果 成功构建了密码子优化的HPV6b L1重组质粒.小鼠免疫后血清特异性IgG抗体水平随着免疫时间和次数的增加而升高.pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)组血清IgG抗体在第8周达到高峰,与pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)、载体和PBS对照组相比差异均有统计学意义(t=18.138、t=29.140、t=30.840,P值均＜0.01);而pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)组与载体和PBS组比较差异也有统计学意义(t=20.072、t=22.457,P值均＜0.01).在特异性CTL杀伤实验中,当E:T分别为5:1、10:1、20:1时,pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)组的脾细胞特异性CTL杀伤率明显高于pcDNA3.1(+)/HPV6bLl(wt)组(t=11.892、t=15.329、t=2.911,P值均＜0.05)、载体组(t=12.936、t=16.613、t=13.90l,P值均＜0.01)和PBS对照组(t=14.768、t=18.935、t=10.925,P值均＜0.01).结论 密码子优化的HPV6b L1 DNA可诱导BALB/c小鼠产生增强的特异性体液和细胞免疫应答.
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甲型流感病毒基因变异与生存选择压力相关性分析
目的研究甲型流感病毒基因变异与生存选择压力的关系,指导保守疫苗靶位点的寻找.方法选择相同血凝素(HA)血清型具有全基因组序列的分化距离较近的多个流感病毒株系,利用Blast2程序计算各株系之间的核酸保守性、蛋白质保守性、变异核苷酸在密码子序位中的频率以及生存选择压力指数,分析与生存选择压力指数的相关性.结果HA基因较其他基因的核酸保守性为显著低;HA抗原蛋白质保守性与NS基因同为较低;HA基因受生存选择压力作用;NS、聚合酶B1(PB1)基因受选择压力较小;NA、核蛋白(NP)基因受选择压力较大;生存选择压力指数与核苷酸第3密码子位点变异频率完全相关.结论流感病毒基因变异受复制机制形成差异和生存选择压力淘汰差异双重作用影响;各基因在流感病毒生物功能中地位不同,NA、NP基因保守性较强,适宜作为疫苗靶位点候选,HA基因相比较具有一定的保守性,有望寻找到保守区段,NS、PB1基因保守性较弱,不宜作为靶位点.
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基因芯片技术检测乙型肝炎病毒YMDD变异
核苷类似物拉米夫定(3TC)治疗慢性乙型肝炎(CHB)过程中,乙型肝炎病毒(HBV)P基因YMDD基序中的甲硫氨酸密码子(M)易突变为缬氨酸(V)或异亮氨酸(I),形成YMDD变异的两种氨基酸序列,即YVDD和YIDD.国内外研究发现[1,2],YMDD基序变异与拉米夫定耐药、肝炎复发有密切关系.我们采用HBV基因多态性芯片检测技术,对102例长期用拉米夫定治疗CHB患者血清进行了检测,进一步探讨YMDD变异与临床的关系.
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慢性重型乙型肝炎患者T细胞免疫状态与HBV前C区基因变异的关系
HBV前C区常见的基因变异是第1896位核苷酸G→A突变,使第28位密码子形成终止密码,导致HBeAg合成终止.
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胰腺癌高危人群外周血K-ras12密码子和K-ras13密码子突变的定量检测和意义
目的 探讨胰腺癌高危人群外周血K-ras12密码子和K-ras13密码子突变量检测的临床价值.方法 收集2010年5月至2011年11月有胰腺癌高危因素且诊断明确者160例,其中终确诊胰腺癌36例,慢性胰腺炎(CP)36例,自身免疫性胰腺炎(AIP)6例,其他恶性肿瘤16例,胰腺良性肿瘤13例,胆总管结石13例,其他良性疾病40例.采集所有入选者的空腹外周静脉血,以肽核酸钳制实时荧光定量PCR法检测K-ras12密码子和K-ras13密码子突变量.两组间突变量的比较采用Mann-Whitney U检验,率的比较采用卡方检验.根据ROC曲线计算K-ras12和K-ras13突变阳性判定值和突变阳性率.结果 胰腺癌组K-ras12密码子突变量[1154(2207)]与其他良性疾病组[476(973)]、CP组[446 (808)]、胆总管结石组[357(568)]比较差异均有统计学意义(U=502、446、117,P均＜0.05).胰腺癌组K-ras13密码子突变量与其他良性疾病组、CP组、胆总管结石组、AIP组、胰腺良性肿瘤组、其他恶性肿瘤组比较差异均无统计学意义(P均＞0.05).K-ras12密码子突变量＞1000拷贝为K-ras12突变阳性判定值时,胰腺癌和非胰腺癌的K-ras12突变阳性率分别为55.6％(20/36)和25.0％(31/124),以K-ras12突变鉴别胰腺癌和非胰腺癌的ROC曲线下面积为0.664,具鉴别诊断价值(P=0.003).以K-ras13突变鉴别胰腺癌与非胰腺癌的ROC曲线下面积为0.522,无鉴别诊断价值(P=0.695).吸烟者和不吸烟者的K-ras13密码子突变量[分别为943(1510)和571(964)]差异有统计学意义(U=1779,P=0.010).结论 外周血K-ras12突变或可用于胰腺癌的筛查.
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肝癌缺失基因-1基因结构域调控人结肠癌HT29细胞增殖的实验研究
目的 探讨肝癌缺失基因-1(DLC-1)基因主要结构域在调控人结肠癌HT29细胞增殖中的作用.方法 分别构建DLC-1基因Rho蛋白GTP酶活化蛋白(RhoGAP)、SAM、START结构域敲除的亚克隆重组质粒,并转染至人结肠癌HT29细胞,另设野生型HT29细胞组(对照组)、pcDNA3.1-HT29细胞组(空载体组)和pcDNA3.1-HT29-DLC-1细胞组(全长转染组)作为对照.应用四甲基偶氮唑盐(MTT)实验、平板克隆实验检测细胞增殖的改变；流式细胞术检测细胞凋亡；pull-down方法分析RhoA蛋白活性.组间差异采用方差分析.结果 转染成功48 h后,与对照组及空载体组相比,全长转染组细胞增殖(F=146.36)及RhoA蛋白活性(F＝698.08)明显抑制(P均＜0.05),细胞早期凋亡增加(F=294.08,P＜0.05).敲除RhoGAP转染组细胞的增殖能力(F＝0.99)、细胞凋亡(F=0.049)及RhoA蛋白活性(F=5.769)与对照组及空载体组相比差异均无统计学意义(P均＞0.05)；敲除SAM转染组细胞比DLC-1基因全长转染组更显著地抑制了细胞增殖(F=31.00,P＜0.05),使RhoA蛋白活性下调(F=92.57,P＜0.05),凋亡增加(F=130.44,P＜0.05)；敲除START转染组相对于DLC-1基因全长转染组,细胞增殖能力增强(F＝15.47,P＜0.05),凋亡细胞减少(F=110.23,P＜0.05),RhoA蛋白活性上调(F＝199.39,P＜0.05).结论 DLC-1基因抑制HT29细胞增殖具有RhoGAP依赖性,SAM结构域可能是内源性RhoGAP活性的自身抑制区域,START结构域可能协助RhoGAP结构域而起作用.
