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高通量测序技术进行流产组织染色体拷贝数检测的结果分析
目的 探讨高通量测序染色体DNA拷贝数(CNVs)分析技术在流产病因查找中的应用价值.方法 收集2015年11月至2017年11月在甘肃妇幼保健院就诊的266例自然流产患者的流产组织、稽留流产组织、绒毛组织,进行染色体核型分析与CNV检测.结果 266例样本中,核型分析共检测出异常79例,其中,单体17例、三体61例、双重三体1例;CNV分析共检测出155例异常,其中致病性CNVs改变119例,包括非整倍体112例(其中单体26例、三体83例、双重三体3例)、致病性缺失或者重复7例.结论 高通量测序技术可以更全面地发现染色体异常改变,查明流产的遗传学病因,为再次妊娠提供临床建议和遗传咨询.
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基因组高通量测序技术进展及其在预防医学中的应用
测序技术在生命科学研究中发挥着重要作用.研究人员借助第一代测序技术完成了人类基因组图谱的绘制,但其读取片段较长,一次仅读取数十条序列,导致测序结果的准确性受到影响,并且费时费力,因而很快被以高通量为主要特点的第二代测序技术所取代,其代表性技术包括美国罗氏公司的454技术、英国Illumina公司的Solexa技术和美国应用生物系统公司的SOLiD技术.新涌现的第三代测序技术,以单分子实时(single molecule real time,SMRT)测序技术[1]、Oxford的纳米孔测序技术[2 ]和Helicos的基因分析系统[3]为代表,与第二代测序技术相比,拥有更高的通量、准确度和更低的成本,目前,仍以第二代高通量测序技术应用较为广泛.可见,测序技术正朝着高通量、低成本、长读取片段的方向发展.高通量测序技术打破了疾病研究过程中的通量限制,使得对疾病的多层面、全方位研究成为可能,为疾病的预防、诊断及治疗提供了有效手段.目前,常用的基因组高通量测序技术包括DNA水平测序技术、DNA甲基化修饰测序技术和DNA-蛋白质交互作用测序技术,笔者对其原理、特点及在预防医学中的应用介绍如下.
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开源基因组学:对抗新发和突发传染病的新策略
一、基因组学的发展及其在新发传染病中的应用随着20世纪70年代Sanger双脱氧链终止核酸测序方法的发明,DNA自动测序技术进入到生命科学领域,并成为不可或缺的技术之一,为生命科学的发展做出了突出贡献.进入21世纪以来,DNA测序技术突飞猛进,新的测序方法不断涌现,使得测序通量以超越摩尔定律的速度迅速提高,与之相伴的是测序成本的大大降低.这完全改变了传统生命科学的研究模式,并推动了很多新学科(如合成生物学、生物信息学、跨组学、系统生物学等)的发展与成熟.
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国内外基因计算机识别的研究方法及进展
众所周知,核酸测序技术已有实质性的发展,迄今为止,全世界完成整个基因组序列测定的物种已超过25种,人类基因组的全序列测定也已基本完成,但是知道了基因组全序列并不等于知道了该种生物全部生活的奥秘.全序列中一个个具有生物功能的片断才称为基因(gene),它是生物遗传信息的载体.非基因部分不编码蛋白质,与生物性状无直接关系,所以对于蛋白质组研究来说,基因区才是真正有价值的部分.但是基因区在序列中所占比例只有3%~5%,因此如何从基因组全序列中找出基因区就成为生物信息学家关注的问题,各种各样的基因组全序列的分析测定程序就应运而生.
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蛋白质和多肽的N端测序技术研究进展
氨基酸序列测定是了解蛋白质性质和功能的重要途径,N端区域又是蛋白质及多肽重要的结构和功能部位,其序列特异性很高,通过N端的少数几个氨基酸残基就可以对大多数蛋白质进行鉴定[1].例如,可以通过对蛋白质和多肽类药物的N端进行人工修饰(如环化修饰、甲基化修饰等),提高其降解稳定性延长药效[2-3].因此N端肽段的鉴定具有非常重要的意义,本文对近年来蛋白质和多肽N端测序技术及方法进行了综述.
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高通量测序技术在宏基因组学中的应用
随着生命科学及研究技术的不断发展,人们对生命现象的了解更加深入.微生物因为其在工业、农业、医疗卫生、环境保护等各方面的重要地位,被越来越多的研究者关注.自然状态下,微生物几乎无处不在,无论是在自然环境如土壤、海洋甚至一些极端环境(如酸矿水)中,还是在人类和动物的皮肤、口腔、肠道中,微生物都与它们所在的环境相伴相生.除生存环境极为广泛以外,微生物的数量还极为庞大,以人类为例,人类的基因总数只占人类身上微生物基因总数的1%左右[1].这些微生物是环境能量、物质代谢的重要中间环节和组成部分,它们有些可以代谢生成周围其他生物所必需的底物,而有些则会代谢生成毒性物质,导致环境污染,或者宿主的疾病.因此,对微生物的研究显得极为重要.
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催化甾体羟基化的P450氧化酶BM3的蛋白质工程的研究进展
甾体关键位点的羟基化在药用甾体的合成中发挥重要作用。为探究细胞色素 P450(CYP450)氧化酶 BM3在甾体羟基化合成中的潜在应用,基于细胞色素 P450 BM3的蛋白质工程逐渐发展起来。在取得的若干 P450 BM3突变酶的基础上,通过新一代测序技术和生物信息学分析等方法,筛选出催化甾体羟基化的相关 CYP450。根据易错 PCR等定向进化技术获得了突变位点信息,进一步采用(饱和)定点突变等进化技术对活性氨基酸位点进行分析,再经过筛选获得既高于亲本酶也高于易错 PCR技术得到的突变酶活力的新突变酶,并对突变体进行功能验证,进一步阐明甾体羟基化的可行性和重要性。此外,P450 BM3催化底物和生成产物的选择性可以通过迭代的组合活性位点突变而改变。本文旨在探究近年来科研人员在 P450氧化酶 BM3蛋白质工程催化甾体羟基化的改良领域中所做的尝试、获得的成果以及存在的问题,为 P450 BM3羟基化疏水性甾体的深入研究提供理论依据。
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血液肿瘤的分子诊断
随着分子生物学及其相关技术的迅速发展,血液系统肿瘤的诊断已进入“精确诊断”时代。目前血液学实验室中主要的分子生物学平台包括聚合酶链反应( PCR)技术、测序技术和基因芯片等;这些技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点,在血液肿瘤的诊断、分型、预后判断、疗效评估、微小残留病的监测及个体化治疗等多个方面发挥了重要作用。我们简要概述分子生物学在血液肿瘤诊断中的应用和进展。
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乳腺癌异质性的遗传基础
乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤,在遗传及基因表型方面具有显著的多样性,这些差异表现在肿瘤细胞的增殖速度、侵袭能力、转移潜能、治疗效果及致病性突变等方面。乳腺癌异质性的遗传基础是什么?其来源又是什么?乳腺多样性的结构组成可能是乳腺癌异质性的基础,结合高通量测序技术的使用,将有助于人们研究乳腺癌细胞的起源,进而阐释乳腺癌的发生、发展过程。我们从正常乳腺上皮多样性的角度出发,总结了乳腺癌异质性的起源、遗传本质及其相关治疗与预后的研究进展。
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单细胞测序研究淋巴细胞免疫球蛋白基因重排
淋巴结生发中心的研究有其特殊性,即细胞组成相当复杂,采用常规的全组织研究往往不能针对所需要的细胞。1993年Hansmann等[1]建立了一种从组织切片上提取单个淋巴细胞并进行聚合酶链反应(PCR)的研究方法。该方法的大优点在于能够针对所需细胞进行相应的分子生物学研究,主要被应用于霍奇金病中R-S细胞的起源研究[2]。近,该技术又有了进一步的发展,即出现了单个细胞的DNA测序技术。应用该技术能够获得有关体细胞超突变、克隆相关性,克隆内差异(interclonal diversity)和延续性突变(ongoing mutation)的信息。我们对1例滤泡反应性增生性淋巴结进行了单个细胞PCR和单细胞测序研究,以探讨这些技术在淋巴结研究中的价值。
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利用广谱细菌聚合酶链反应-DNA测序技术进行细菌病因学诊断
16S核蛋白体RNA基因(16S rRNA gene, 16S rDNA)存在于所有细菌中,其基因序列由保守性序列和多样性序列相间排列而成.其中高度保守的序列几乎在所有细菌中都是一致的,而多样性序列随细菌种类不同而不同.因此,在16S rDNA 多样性序列两侧的高度保守序列中设计聚合酶链反应(PCR)引物,便可将多种细菌的多样性(特异性)基因片段扩增,再通过DNA测序技术,就能确定细菌的种类.
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登革病毒毒力研究进展
登革病毒(Dengue Virus,DV)是一类有包膜的单股、正链RNA病毒,基因组10~11kb,编码3种结构蛋白(C,PrM和E)和7种非结构蛋白(NS1,NS2a,NS2b,NS3,NS4a,NS4b和NS5)。自然界存在的登革病毒有四种血清型,均可引起温和的登革热(DF)和严重的致死率很高的登革出血热(DHF)、登革休克综合征(DSS),而关于DF至DHF/DSS的发病机理迄今尚未阐明。近年来强毒力病毒理论〔1〕开始获得一些直接证据,越来越受到研究者的重视,该理论认为DHF/DSS的发生是受一种毒力更强的登革病毒株的感染。随着DNA测序技术的发展,登革病毒毒力的研究正进入一个新时期。
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新一代焦磷酸测序平台在HIV/AIDS研究中的应用
Ⅰ型人类免疫缺陷病毒( human immunodefi-ciency virus type 1, HIV-1)是引起全世界范围艾滋病( AIDS)流行的主要病原体。 HIV-1属逆转录病毒科,其基因组由两条相同的正链RNA构成。要完成自身的复制(增殖),必须经历由基因组RNA逆转录形成cDNA ( complementary DNA )的过程,故每复制一代都会向基因组中引入一定频率的新的变异,从而导致了HIV-1在传播与进化过程中产生了众多亚型( subtype )及复杂的重组型( circulating re-combinant form ,CRF),而它们之间又可发生共感染( coinfection )与超感染( superinfection )。再加之抗逆转录治疗过程中产生的各种抗药性突变准种,终为AIDS的诊断、治疗及疫苗的研发带来了极大的障碍。因此准确分析各HIV-1亚型、重组型及抗药性准种的基因组序列,对于深入了解HIV-1的传播、进化特点和AIDS的有效诊断、防控甚至攻克,具有极其重要的意义。但与此同时,也对基因测序技术的通量、速度、准确度等提出了更高的要求。
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细菌演化研究的进展
细菌演化研究在测序技术的支持下获得了大量成果.研究范围从代表性种类向其他种类持续扩大,研究层次从单一序列迅速推进至整个基因组.本文以细菌演化的研究对象、研究发现和研究工具为线索,较详细地介绍了近些年来细菌演化研究及所用工具所取得的各项成果.这些成果对揭示生物演化本质、促进分析技术发展、服务生产生活和医疗卫生都有重要意义.
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基因测序确认二例造血干细胞捐献者新等位基因HLA-DRB1*0114
人类白细胞抗原(HLA)是迄今所知的人类复杂的免疫遗传多态性系统,由于分子生物学技术尤其是DNA测序技术在HLA分型上的应用,新的等位基因不断被发现[1-3].随着中国造血干细胞库捐献者数量的增加,不断地在中国人中发现新等位基因的报道.我们报告2例在对中华骨髓库陕西分库注册的捐献者进行HLA低分辨的过程中发现的一个新等位基因,该等位基因2006年3月被世界卫生组织(WHO)HLA因子命名委员会正式命名为HLA-DRB1*0114.
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焦磷酸测序法检测结直肠癌患者k-ras基因突变
研究证明,k-ras癌基因的激活在CRC发生发展过程中起重要作用[1].k-ras基因常见的激活方式为点突变,其中90%以上的突变发生在1号外显子第12位密码子(野生型:GGT)和第13位密码子(野生型:GGC)[2],突变率约30%~49%[3].近年来,k-ras基因是否突变已成为西妥昔单抗能否用于CRC分子靶向治疗的用药评判标准[4].因此,如何快速准确检出k-ras 基因突变对这类药物的应用及疗效预测显得尤为重要.焦磷酸测序法是一种酶促级联测序技术,特别适用于SNP常规检测[5].
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增加ABI-377自动测序仪测序长度的改进措施
DNA测序技术是现代分子生物学乃至整个生命科学中广泛应用的技术之一,也是完成2003年人类基因组计划(HGP)项目的关键性环节.美国PE公司生产的ABI-377测序仪是近五年来国际上应用广泛的自动化测序仪[1].我们在使用中采取了两项改进措施,使测定较长模板时,能够读出更多的序列资料,从而提高了自动测序的效率,并降低了成本.
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聚合酶链反应-单链构象多态性检测淋病奈瑟菌gyrA基因突变的研究
国外研究表明,DNA旋转酶是淋病奈瑟菌(淋菌)中氟喹诺酮类药物的首要作用靶位,淋菌对氟喹诺酮类药物耐药主要与编码该酶的gyrA基因喹诺酮耐药决定区(QRDR)突变有关[1].为建立一种简便、快速、可靠的淋菌gyrA基因突变的检测方法,并进一步探讨该突变与我国临床分离淋菌对氟喹诺酮类药物耐药的关系,本课题以浓度梯度(Etest)法检测了42株临床分离淋菌对环丙沙星敏感性,采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)结合DNA测序技术,对淋菌gyrA基因QRDR突变进行了研究,报告如下.
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多位点测序技术在病原菌核型分析中的应用
随着分子生物学研究技术的发展,有人说在未来5~10年中,对人类健康做出贡献的关键生物技术是传染病的分子诊断技术.
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运用DNA测序技术提高不常见菌的鉴定水平
临床微生物室的一项重要任务是对感染性疾病进行病原学诊断,同时为临床提供正确的药敏结果.及时、准确的病原学诊断能够帮助临床选择合适的抗感染药物,降低病死率,缩短住院时间.但是目前常规病原学检测手段远不能满足临床需求,主要受限于以下因素:(1)常规培养和药敏试验至少需要48 h,对于分枝杆菌、厌氧菌等,需要更长时间;(2)广谱抗菌药物的使用极大地降低了培养的阳性率;(3)许多苛养菌和不常见菌,体外常规培养困难;(4)基于生化谱型的自动化鉴定系统或其他表型方法对于特殊或不典型谱型的菌或数据库无法覆盖的菌,常常无法准确鉴定到种.