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化学诱变剂诱发基因突变分子机理研究
应用一将突变靶基因与哺乳细胞基因组DNA相分离的实验体系,证明化学诱变剂诱发的基因突变可发生在损伤碱基以外的正常序列中(非定标性突变),并有突变谱特征和突变好发的序列特异性.它的发生依存于化学诱变剂诱发的基因表达改变,应用mRNA差异显示和反义技术分离到两个基因表达序列标识,其相关基因表达被阻断后可分别促进和抑制化学诱变剂诱发的非定标性突变.用体外DNA复制技术证明其发生基础是由于化学诱变剂引发细胞DNA复制保真度的下降,而细胞错配修复功能未发现异常,但DNA聚合酶酶谱发生改变.还证明它的发生可因细胞应激信号通路激活剂所促进,在化学诱变剂作用后有蛋白磷酸化谱和蛋白酪氨酸残基磷酸化谱的改变以及应激激活蛋白激酶的激活和cAMP浓度升高.细胞信号转导通路的激活参与了非定标性突变的发生.
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microRNA在酒精毒性机制中作用及叶酸保护机制的研究
MicroRNAs(miRNAs)是一种由22个核苷酸组成的小的非编码的RNAs,序列特异性的靶向结合并调节mRNAs的表达.miRNAs调节的靶基因广泛涉及到发育、细胞增生、凋亡、和肿瘤基因.
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RNA干扰抗病毒研究进展
RNA干扰(RNA Interfering,RNAi),又称RNA干涉,是一种由双链RNA介导的、转录后mRNA水平关闭相应基因表达的序列特异性基因沉默机制,它也是体内基因组抵御外在感染和内部转座的一种保护机制,广泛存在于各种生物,如植物、真菌、昆虫、后生动物和哺乳动物,包括人类.
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蛋白质和多肽的N端测序技术研究进展
氨基酸序列测定是了解蛋白质性质和功能的重要途径,N端区域又是蛋白质及多肽重要的结构和功能部位,其序列特异性很高,通过N端的少数几个氨基酸残基就可以对大多数蛋白质进行鉴定[1].例如,可以通过对蛋白质和多肽类药物的N端进行人工修饰(如环化修饰、甲基化修饰等),提高其降解稳定性延长药效[2-3].因此N端肽段的鉴定具有非常重要的意义,本文对近年来蛋白质和多肽N端测序技术及方法进行了综述.
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抗乙型肝炎病毒核酶的研究进展
全世界大约有3.5亿乙型肝炎病毒(HBV)携带者,这种感染者集中分布于包括我国在内的东南亚、东亚及非洲的撒哈拉地区.HBV的持续存在常可导致肝硬化以及肝癌,对于已感染HBV者,目前常用的化学及免疫疗法通常无效.因此,寻找新的抗HBV感染的手段成为热点.核酶做为一种成熟的、可剪切特异性RNA的分子生物学方法受到广泛重视.由于核酶有严格的序列特异性,长期使用对细胞无副作用,并且结构简单,可人工设计,因此,很有希望成为治疗HBV感染的新方法.目前,核酶已广泛用于抗病毒及抗肿瘤的研究,尤其对HIV的研究,已进入临床工作阶段.本文将从核酶的构成、核酶研究的热点以及抗HBV感染等方面进行阐述.
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RNA干扰的抗病毒效应
双链RNA介导的RNA干扰(RNAinterference,RNAi)能序列特异性的诱发转录后基因沉默,被认为是机体阻止外来病毒感染、保护细胞免受病毒入侵的一种细胞自我保护机制.近年来研究表明,以病毒基因和宿主细胞受体分子为靶点,引入外源的小分子干扰RNA(siRNA)能显著性抑制病毒的复制与感染.RNAi作为一种抗病毒的有力武器,将给病毒性疾病的基因治疗带来新的希望.
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乙型肝炎病毒DNA聚合酶N末端蛋白基因芯片研究
目的:检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶N末端蛋白(TP)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TP在乙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.方法:根据AF384372 HBVDNA病毒株序列设计、合成HBV DNA P-TP基因序列特异性的引物,以含有AF384372HBVDNA P全基因组cDNA的质粒G318A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HBV DNA-TP编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TP.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有TP蛋白的表达,提取高质量的mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有111个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV DNA P-TP转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TP蛋白致病的分子生物学机制提供依据.
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应用基因表达谱芯片技术筛选NS3TP1转染细胞差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活基因1(NS3TP1)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步NS3TPl蛋白可能的分子生物学功能.方法:设计并合成NS3TPl基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3TP1蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-NS3TPl.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有26个基因表达水平显著上调,14个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS3TPl转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS3TPl蛋白可能的生物学功能及HCV的致病机制提供理论依据.
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基因表达谱芯片技术筛选TAHCCP1转染细胞差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TAHCCP1在肝细胞中上调或下调的基因,探索其可能的调节功能.方法:设计并合成TAHCCP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TAHCCP1基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的TAHCCP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TAHCCP1,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA,逆转录为cDNA,应用基因表达谱芯片技术对两组间差异表达mRNA进行检测和分析.结果:在筛选的1 152点cDNA芯片中,有110种基因的表达水平上调(占9.55%),98种基因的表达水平下调(8.51%),包括一些与体内免疫调节、脂类代谢、蛋白质的翻译合成、氧化反应、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的基因.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了TAHCCP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TAHCCP1蛋白可能的生物学功能提供依据.
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筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白4B转染细胞差异表达基因
目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达基因,进一步阐明NS4B蛋白在丙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成HCV NS4B基因序列特异性的引物,以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS4B蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HCV NS4B编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS4B.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有NS4B蛋白的表达,提取高质量的mRNA并逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有22个基因表达水平显著上调,34个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HCV NS4B转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS4B蛋白致病的分子生物学机制提供依据.
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血小板糖蛋白受体IaC807T基因多态性与心肌梗塞的关系(摘要)
近年来研究发现,血小板糖蛋白(GP)受体基因多态性可能在冠状动脉疾病,尤其是心肌梗塞的发生中具有重要作用.本实验检测中国人群血小板GPIaC807T基因多态性,并探讨其与心肌梗塞发病之间的关系.1资料与方法选择2000年1月至2001年1月间住院男性心肌梗塞患者(心肌梗塞组)72例(包括急性、亚急性及陈旧性心肌梗塞),年龄小于60岁,均符合WHO心肌梗塞诊断标准;对照组70例,为本院体检者中与病例组年龄相匹配的非冠心病者.自全血中提取人基因组DNA.采用引物序列特异性多聚酶链反应(PCR)方法检测血小板GPIaC807T基因多态性.正义引物为5'-GACA~CATTAATAAATGTCTCCTCTG-3',序列特异性反义引物为5'-CCTTGCATATTGAATTGCTACA-807-3'及5'-CCTTGGATATTGAATTGCTACG-807-3'.2结果心肌梗塞组与对照组的平均年龄、高血压与糖尿病患者数、吸烟者数、体重指数、空腹血糖与血脂水平的差异均无显著性.
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靶向MDR1基因的小分子干扰RNA对卵巢上皮性癌裸鼠移植瘤多药耐药的抑制作用
化疗是治疗晚期卵巢上皮性癌(卵巢癌)的重要手段,但多药耐药的产生常使化疗不能达到理想的效果,而多药耐药基因--MDR1基因编码的P糖蛋白(P-gP)的过度表达是导致肿瘤细胞耐药的直接原因.已有研究表明,小分子干扰RNA(siRNA)可诱导序列特异性基因沉默[1].
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miRNA在癌症中的临床应用
miRNAs是一类进化上保守的多效性非编码小RNA,通过序列特异性与同源信使核糖核酸(mRNA)的3'非翻译区(非编码区)靶向相互作用,抑制转录后的基因表达.miRNAs的表达和处理模式在人类多种疾病(包括恶性肿瘤)上表现出多方面的改变,通过靶向作用于几十到数百个基因,可以改变肿瘤发生和发展所必须的基本生物学功能和路径[1].另外miRNA在物种中的保守性,使它们成为治疗癌症具有吸引力的候选者.miRNAs的肿瘤生物网络是复杂的,目前发现了许多新兴的miRNA,随着研究的进一步深入开辟了针对早期发现疾病的新型生物标志物、定义治疗反应性和现在治疗的补充疗法的新道路,为我们提供了miRNAs在癌症治疗方面的广阔视角.
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SATB1基因与细胞凋亡的研究进展
SATB1是一种组织特异性表达的核基质序列特异性结合蛋白,参与染色质高级结构的形成和组织特异性基因的表达调控,在免疫调节、肿瘤转移和凋亡方面发挥着重要的作用.本研究就SATB1基因与细胞凋亡的研究进展作一综述.
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RNA干扰技术的临床应用需要更多的安全性研究
看到关于RNA干扰(RNAi)技术的一期和二期临床试验的文章发表,是一件令人兴奋的事.RNA干扰是一种可以选择性地(序列特异性地)使目标基因沉默的技术.已经发表的临床试验文章是关于将该技术应用于治疗人类的少数几种疾病的,虽然有人相信该技术有被用于成千上万种疾病的潜力.对于4种潜在RNAi产品进行的6项临床试验的文章的发表,象征着这种迷人的基因沉默技术已经距临床应用很近了,从而很快将给临床医师提供与诸如恶性肿瘤、病毒感染、某些年龄相关性变性性疾病,以及可能许许多多与基因的突变或过度表达相关疾病的战斗中可用的崭新武器.本篇评论旨在根据国际医学期刊上发表的文献了解RNAi技术安全性研究方面的概况,包括在临床和动物实验研究中对安全性问题的研究情况,并对将此技术安全应用于人类作出一些建议.
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应用PCR-SSP技术检测HLA-B27等位基因
人类白细胞抗原B27(human leukocyte antigen B27, HLA-B27)因其与强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis ,AS)间的强相关性而引人注目.AS患者HLA-B27阳性率高达90%~96%,而普通人群仅为4%~9%. 但HLA-B27在基因水平上还存在着很大的异质性.我们采用序列特异性引物扩增法(sequence specific primer,PCR-SSP)对HLA-B27作进一步亚型分析,与PCR-SSOP(寡核苷酸探针斑点杂交)和直接DNA测序相比,具有简便、快捷、准确的特点,适用于临床及科研应用.
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湘西土家族不明原因反复流产患者HLA-DRB1基因多态性研究
目的 探讨HLA-DRB1基因多态性与湘西土家族人群不明原因反复流产的遗传关联性.方法 采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术,对76例湘西土家族不明原因反复流产患者和82例湘西土家族健康对照者的HLA-DRB1等位基因进行分析.结果 与对照组比较,病例组的DRB1*04基因频率增高(37.17%比8.27%,Pc<0.01,RR=8.02),而DRB1*12基因频率显著低于对照组(4.72%比28.43%,Pc<0.01,RR=0.11).结论 HLA-DRBl*04可能是湘西土家族不明原因反复流产的易感基因,HLA-DRB1*12可能为保护基因.
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RNA干扰技术及其在口腔肿瘤研究中的进展
RNA干扰(RNA interference,RNAi)首先由Fire等[1]提出,为双链RNA(double strand RNA,dsRNA)介导的细胞内序列特异性转录后基因沉默过程,是生物体在进化过程中,抵御病毒感染及由于重复序列和突变引起基因组不稳定性的保护机制.RNAi技术现已广泛应用于逆基因分析和基因治疗等领域,并日益成为口腔肿瘤患者分子病因和基因治疗研究的重要工具.
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RNA干涉技术治疗STAT3高表达肿瘤的研究进展
RNA干涉(RNA interference,RNAi)是指具有同源性的双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)导致靶mRNA发生序列特异性降解的现象.如果知道引起某种疾病的基因的mRNA序列,则可以使用具有干扰作用的小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)来阻止其表达.近年的实验表明,应用siRNA技术可以使信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)表达沉默,抑制其在癌组织中的活化,从而促进癌细胞的凋亡.siRNA技术在肿瘤的基因治疗方面有很大的应用价值.
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siRNA及其在肿瘤研究中的应用
RNAi(RNA inferference)是一种序列特异性,RNA为依赖性转录后基因沉默技术(PTGS).在大多数真核生物中,RNAi在控制外来基因表达中起到进化上保守的细胞防御作用.