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限制酶分析在假单胞菌及其L型鉴定中的应用
假单胞菌是临床常见的致病菌之一,铜绿假单胞菌为医院内感染常规检测菌.为建立对其快速、准确鉴定的方法,我们对获自中国科学院AS菌种保藏中心的14株假单胞菌标准株(包括铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、弯曲假单胞菌、恶臭假单胞菌和嗜麦芽假单胞菌等)及临床分离到的铜绿假单胞菌,用EcoRⅠ、 HindⅢ、SmaⅠ和PstⅠ(Promega及华美公司)等限制性内切酶分析其染色体的限制酶图谱(REP),其中EcoRI和SmaI对这些菌种的鉴别效果较好.
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孕妇血浆中游离DNA在先天性软骨发育不全产前诊断中的应用
基因病的产前诊断多采取在妊娠期取羊水或绒毛细胞进行基因分析的方法.但这2种取材方法均具有创伤性,可能对胎儿及孕妇生命造成危害.Lo等[1]研究证明,孕妇外周血中存在胎儿游离DNA,为单基因病的非侵入性产前诊断提供了一种新的途径.为探讨该途径临床应用的可行性,我们采用Qiagen公司的DNA分离试剂盒,结合基因扩增限制性内切酶分析技术成功地对1例先天性软骨发育不全(achondroplasia,ACH)的孕妇进行了非侵入性产前诊断.
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乙型肝炎病毒DNA聚合酶N末端蛋白基因芯片研究
目的:检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶N末端蛋白(TP)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TP在乙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.方法:根据AF384372 HBVDNA病毒株序列设计、合成HBV DNA P-TP基因序列特异性的引物,以含有AF384372HBVDNA P全基因组cDNA的质粒G318A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HBV DNA-TP编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TP.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有TP蛋白的表达,提取高质量的mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有111个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV DNA P-TP转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TP蛋白致病的分子生物学机制提供依据.
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应用基因表达谱芯片技术筛选NS3TP1转染细胞差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活基因1(NS3TP1)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步NS3TPl蛋白可能的分子生物学功能.方法:设计并合成NS3TPl基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3TP1蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-NS3TPl.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有26个基因表达水平显著上调,14个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS3TPl转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS3TPl蛋白可能的生物学功能及HCV的致病机制提供理论依据.
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乙型肝炎病毒e抗原肝细胞结合蛋白新基因E-36基因表达谱芯片分析
目的:为了研究未知功能的HBeAg结合蛋白E-36的生物学功能,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-E-36分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析,筛选能被E-36反式调节的靶基因.方法:应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增E-36蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载淋pcDNA3.1(-)-E-36.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确.提取转染细胞的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1159个基因表达谱的筛选中,发现有20个基因表达水平显著上调,包括甲状旁腺激素应答的骨肉瘤B1蛋白、SLIT2、核因子κB、白介素受体3、白介素6、血管紧张素Ⅰ转换酶、急性髓细胞性白血病1b、caspase 2、低密度脂蛋白1、T细胞受体重组β链、肿瘤坏死因子受体、肿瘤抑制亚转化因子、细胞周期相关激酶-2、亲代谢性谷氨酸盐受体-7、唾液酸转移酶-8及5个未知蛋白;真核细胞翻译延伸因子2基因的表达水平显著下调.结论:E-36基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.DNA芯片技术是分析反式激活靶基因的有效技术途径.
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基因表达谱芯片筛选NS5ATP3转染细胞差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP3的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明NS5ATP3蛋白可能的分子生物学功能.方法:设计并合成NS5ATP3基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP3蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP3编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP3.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有6个基因表达水平显著上调,18个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP3转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP3蛋白可能的生物学功能提供依据.
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筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白4B转染细胞差异表达基因
目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达基因,进一步阐明NS4B蛋白在丙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成HCV NS4B基因序列特异性的引物,以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS4B蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HCV NS4B编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS4B.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有NS4B蛋白的表达,提取高质量的mRNA并逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有22个基因表达水平显著上调,34个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HCV NS4B转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS4B蛋白致病的分子生物学机制提供依据.
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基因表达谱芯片技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白3反式调节靶基因
目的:丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白3(non-structural protein 3,NS3)是由HCV基因组编码的具有多种功能的蛋白质.NS3蛋白的表达对于HCV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响.为了研究NS3蛋白反式调节的靶基因,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-NS3分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析.方法:以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-NS3.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染hepG2细胞之后有NS3蛋白的表达,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有34个基因表达水平显著上调,37个基因表达水平显著下调.结论:HCV的NS3蛋白是一种反式激活因子.NS3基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.DNA芯片技术是分析反式激活靶基因的有效技术途径.
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基因表达谱芯片技术筛选肝再生增强因子反式调节基因
目的:为了阐明人肝再生增强因子(augmenter of liverregeneration,ALR)的表达对于肝细胞基因表达谱的影响,我们应用基因芯片技术,对于转染和未转染的HepG2细胞进行了分析.方法:从HepG2细胞RNA中用反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)扩增出ALR编码区DNA,常规分子生物学技术构建ALR的真核表达载体pcDNA3.1(-)-ALR,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,ALR的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:经过限制性内切酶分析和序列测定,证实pcDNA3.1(-)-ALR构建正确.ALR在HepG2细胞中的表达以Westernblot杂交技术得到证实.对于ALR重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达谱,利用基因芯片技术进行分析.结果表明,2种基因的表达水平上调,24种基因的表达水平下调.这些基因包括淀粉酶α、肿瘤坏死因子受体、金属蛋白酶1组织抑制因子、性激素相关蛋白等基因,相信这些类型的基因在ALR所发挥的生物学效应起到重要的作用.结论:ALLR于肝细胞基因表达谱存在一定影响;基因芯片技术是分析蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径,有助于了解ALR对肝细胞和其他生物学功能的调节作用.
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HBsAg结合蛋白C-12基因转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析
目的:为研究未知功能的乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)结合蛋白C-12的生物学功能,我们应用基因芯片技术对于C-12转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对细胞基因表达的影响.方法:应用酵母双杂交技术筛选并验证HBcAg的肝细胞结合蛋白基因.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增C-12蛋白编码基因片段,经测序鉴定后构建表达载体pcDNA3.1(-)-C-12.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:筛选出肝文库中HBcAg结合蛋白新基因C-12,构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确.提取转染细胞的总mRNA并逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1159个基因表达谱的筛选中,发现有16个基因表达水平显著下调,包括胰岛素受体、丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制剂、SUMO-1活化酶亚基1、肿瘤易感基因101、磷酸硒合成酶2(SPS2)、caspase 4凋亡相关半胱氨酸蛋白酶4、急性淋巴细胞性白血病易位子T、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、DEAD box蛋白多肽21、前折叠素5(Prefoldin 5)、丝氨酸棕榈酰转移酶、G蛋白通路抑制剂、肿瘤坏死因子受体相关蛋白、转化生长因子β1、ADP-核糖基转移酶及1个未知蛋白基因;1个未知功能蛋白编码基因的表达水平显著上调.结论:C-12基因的表达对于肝癌细胞基因表达谱有显著影响,基因表达谱芯片技术是探索基因功能的有效技术途径,实验结果为进一步阐明C-12与HBcAg结合后的肝细胞生物学变化提供了有力的依据.
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乙型肝炎病毒E抗原肝细胞结合蛋白E-18调节基因的表达谱芯片研究
目的:应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-E-18分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析,筛选能被E-18反式调节的靶基因,研究未知功能的HBeAg结合蛋白E-18的生物学功能.方法:应用酵母双杂交技术和体外免疫共沉淀技术筛选并验证HBeAg的肝细胞结合蛋白基因,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增E-18蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-E-18.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:筛选出肝文库中HBeAg结合蛋白E-18的编码基因,构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确.提取转染细胞的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 159个基因表达谱的筛选中,发现有52个基因有差异表达,其中36种基因表达水平显著下调,16种基因表达水平显著上调.结论:成功地应用DNA芯片技术筛选出HBeAg结合蛋白新基因E-18的反式调节蛋白,证明E-18基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.
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应用表达谱芯片技术对乙型肝炎病毒前-S2抗原结合蛋白S2-29反式调节基因的研究
目的:应用基因表达谱芯片技术,研究未知功能的乙型肝炎病毒(HBV)前-S2(preS2)抗原肝细胞结合蛋白基因S2-29过表达,对HepG2细胞的基因表达的影响.方法:应用酵母双杂交技术筛选并验证HBV前-S2的肝细胞结合蛋白基因.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增S2-29蛋白编码基因片段,经测序鉴定后构建表达载体pcDNA3.1(-)-S2-29,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-S2-29转染的人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:筛选出肝文库中HBV前-S2结合蛋白S2-29的编码基因,构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确.提取转染细胞的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有9个基因表达水平显著下调,包括真核翻译延伸因子2、MAP激酶激活的死亡域、谷胱甘肽过氧化物酶、肌动蛋白、NDRG、Prosaposin、SUMO-1激活酶亚基1、胰岛素受体和1个未知功能蛋白.1个未知蛋白编码基因的表达上调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV前-S2结合蛋白S2-29蛋白的反式调节基因,为进一步阐明S2-29蛋白对细胞表达调控的影响提供了新的依据.
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基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因
目的:乙型肝炎病毒(HBV)基因组编码的HBxAg是一种很强的反式激活(transactivation)病毒蛋白,在正常肝细胞的恶性转化(transformation)以及肝细胞癌(HCC)的形成过程中具有十分重要的作用.为了阐明HBxAg的表达对于肝细胞基因表达谱的影响,我们应用基因芯片技术,对于转染和未转染的HepG2细胞进行了分析.方法:以含有全长乙型肝炎病毒基因的pCP10质粒作为模板,应用聚合酶链反应技术(PCR)扩增的HBxAg基因片段,常规分子生物学技术构建HBxAg的真核表达载体pcDNA3-HBxAg,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,HBxAg蛋白的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2中提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:经过限制性内切酶分析和序列测定,证实pcDNA3-HBxAg构建正确.HBxAg在HepG2细胞中的表达以Western blot杂交技术得到证实.对于HBxAg重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达谱,利用基因芯片技术进行分析.结果表明,16种基因的表达水平上调,58种基因的表达水平下调.这些基因包括细胞生长、细胞凋亡、信号转导等基因,相信这些类型的基因在HBxAg的恶性转化中具有十分重要的作用.结论:HBxAg是一种病毒反式激活蛋白,对于肝细胞基因表达谱有显著影响;基因芯片技术是分析病毒反式激活蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径.
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丙型肝炎病毒结构基因转基因小鼠引起肝脏脂肪变
目的:建立持续表达和诱导表达型丙型肝炎病毒(HcV)结构基因(包括核心蛋白和包膜蛋白El、E2编码基因)的转基因小鼠动物模型,探讨HcV结构基因表达导致肝脏脂肪变的病理改变.方法:以含有近全长HcV cDNA的质粒为模板,通过多聚酶链反应(PcR)技术扩增HcV结构基因的DNA片段(约2.2kb),克隆到真核表达载体pcDNA4HisMas和pMT/BiP/V5-HisA中,分别构建成持续表达型表达载体pcDNA4HisMas-HcV core-E2和诱导表达型表达载体pMT/BiP/V5-HisA-HcV core-E2.以限制性内切酶分析和目的DNA片段的核苷酸序列分析,证实构建HcV结构基因的真核表达载体正确无误.以脂质体体外转染cos-7细胞系,利用抗-HcV E2的多克隆抗体进行westem blot杂交分析,证实转染细胞中有HcV E2蛋白的表达.利用小鼠受精卵细胞核微注射方法,导入线性化表达载体的DNA,利用假孕小鼠的受精卵植入方法,建立了表达HcV结构基因的转基因小鼠模型.对于持续表达型转基因小鼠的死胎、6月龄以及硫酸铜诱导表达型的转基因小鼠模型的肝脏组织,进行HE染色和病理学特征的分析.结果:构建了持续性表达和可诱导性表达型的HcV结构基因表达载体pcDNA4HisMas-HcV core-E2和pMT/BiP/V5-HisA-HcV core-E2,体外转染cos-7细胞证实转染细胞中有HcV E2抗原的表达.对于持续表达型转基因小鼠死胎肝脏病理学特征进行分析,发现肝组织尚未分化发育完成,肝内有大量造血细胞,肝细胞空泡变性,单个核细胞聚集现象.对于持续表达HcV结构基因的6月龄转基因小鼠的肝脏进行病理学分析,发现中央静脉区肝细胞小泡型脂肪变性,中央静脉周围细胞溶解坏死,中央静脉明显扩大,少数组织中亦见大泡型脂肪变性.对于可诱导型转基因小鼠的肝脏进行病理学分析,发现肝小叶内中央静脉周围坏死区累及5-10个小叶,周围无淋巴细胞浸润,交界区可见多数肝细胞核异常,或固化,或呈花环状,或溶解为淡蓝色无定形基质.泡浆内残留大量脂肪小泡,肝脏脂肪变与核异常有-移行过程.结论:建立了表达HCV结构基因的转基因小鼠,发现HCV结构基因的转基因小鼠肝脏有典型的脂肪变病理改变,为进一步研究HCV感染引起的慢性丙型肝炎合并脂肪变的特征和机制研究奠定了基础.
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应用基因表达谱芯片技术筛选HBV前-S2蛋白反式调节基因
目的:乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白是由HBV S基因编码的具有多种功能的蛋白质.前-S2蛋白的表达对于HBV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响.为了研究前-S2蛋白反式调节的靶基因,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-preS2分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析.方法:以含有HBV全基因组的质粒G376-7(GenBank号:AF384371)作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增前-S2蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-preS2.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有42个基因表达水平显著上调,36个基因表达水平显著下调.结论:HBV的前-S2蛋白是一种反式激活因子,前-S2基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.
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广西崇左市葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变型研究
目的 研究广西崇左市葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症的发生率及基因突变类型.方法 对广西崇左市510例病例采用四氮唑蓝定量法筛查G6PD活性.对诊断为G6PD缺乏的病例采用PCR/限制性内切酶消化试验检测出G1376T、G1388A、A95G、G871A和C1024T 5种常见G6PD基因突变类型,用DNA直接测序法检测未确定突变类型的标本.结果 在广西崇左市510名居民中筛查出52例G6PD缺乏症,其缺乏率为10.20%.在52例G6PD缺乏症标本中,检出G1376T突变14例、G1388A突变12例、A95G突变13例、G871A突变6例、C1024T突变1例,C1360T突变1例、C519T突变l例,未定型4例.结论 G6PD缺乏症在广西崇左市的发病率为10.20%.G1388A、G1376T、A95G也是广西崇左市G6PD缺乏症常见的基因突变.发现G6PDUnion 1例,很可能属于零星分布.
关键词: 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症 基因突变 限制性内切酶分析 广西崇左市 -
苏州地区正常人群GPⅠ bα基因HPA-2和VNTR多态性研究
GPⅠ b由两个亚单位组成,即GPⅠ bα(相对分子质量145×103)和GPⅠbβ(相对分子质量24×103)以二硫键连接而成。GPⅠ b与GPⅨ以非共价键结合形成GPⅠb-Ⅸ复合物。GPⅠb-Ⅸ复合物具有血管性血友病因子(vWF)受体和凝血酶受体功能,在高剪切力状态的初期止血过程中起重要作用,此复合物缺陷在临床上可引起巨大血小板综合征(BSS)。GPⅠbα基因具有多种遗传多态性,迄今,国外已相继在美国白人、日本、德国和意大利等人群中发现了GPⅠ bα的多态性,国内这方面的报道很少。我们应用PCR技术结合限制性内切酶分析,研究了苏州地区正常人GPⅠ bα基因HPA-2和可变数目串联重复序列(VNTR)的多态性,现报道如下。
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流行性乙型脑炎病毒NS4A蛋白基因的克隆及其在大肠埃希菌的表达
目的:克隆及表达流行性乙型脑炎病毒(JEV)NS4A蛋白基因.方法:JEV JaGAr-01株感染C6/36细胞,RT-PCR法获取JEV NS4A蛋白基因并采用ABI PRSMTM310 Genetic Analyzer进行DNA测序分析,PCR克隆方法将RT-PCR产物构建于原核表达载体PET-3a的BamHI与EcoRI酶切位点并命名为pNS4A,电泳进行限制性内切酶分析.结果:JEV NS4A蛋白基因大小为446 bp,DNA测序与发表的JEV JaGAr-01株相对应的DNA序列相符合,酶切后从重组质粒释出的插入子与JEV NS4A蛋白基因大小相一致.pNS4A在原核细胞内表达的特异蛋白分子量约16 kDa,与JEV NS4A蛋白理论计算相一致.结论:获取的JEV NS4A蛋白基因来自于JaGAr-01野生株,pNS4A在大肠埃希菌中表达的蛋白产物为JEV NS4A蛋白.
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流行性乙型脑炎病毒结构蛋白编码基因的重组构建
目的:建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)C、prME,E等结构蛋白编码基因克隆.方法:病毒感染C6/36细胞,RT-PCR法依次获取该病毒结构蛋白基因并进行DNA测序分析,PCR克隆法将PCR产物分别构建于真核表达载体pcDNA 3.1的BamHI与EcoRI酶切位点并依次命名为pJC、pJME与pJE,通过DNA测序、电泳以及限制性内切酶分析加以鉴定.结果:JEV C、prME与E基因片段分别为380、2001以及1 500bp,各基因测序结果与发表的JEV JaGAr-01株相对应序列相一致,从重组质粒释出的插入子分别与各基因大小相符合.结论:pJC、pJME与pJE重组质粒分别含有C、prME与E蛋白编码基因.
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吉林省非综合征型耳聋分子病因学分析——线粒体DNA 12SrRNA1555位点突变基因筛查
目的 探讨吉林省耳聋人群的病因学特征,考察本地区非综合征型耳聋线粒体基因(mtDNA)12SrRNA A1555G突变频率.方法 收集长春市聋哑学校129例NSHI学生外周静脉血,提取mtDNA,PCR扩增目的基因片段,限制性内切酶(Alw26I)酶切分析,检测mtDNA A555G突变.结果 被检测的129例NSHI学生(XmAn耳毒性致聋者37例),mtDNA A1555G突变阳性者3例,其中2例为初步确定为AmAn耳毒性致聋者,推测本地区NSm耳聋mtDNA A1555G的突变频率为2.33%,由AmAn耳毒性致NSHl人群中mtDNA A1555G的突变频率为5.41%.结论 AmAn耳毒性致聋是吉林省非综合征型耳聋的重要致病原因.通过对特定人群进行mtDNA A1555G突变基因的筛查,并对阳性个体进行早期干预,可降低药物性耳聋的发病率.