首页 > 文献资料
-
双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体编码蛋白可反式激活GAL4反应元件
为研究双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒(HBV)基因组剪接变异体特异性新蛋白-yTPds的功能,以酵母双杂交系统的诱饵质粒pGBKT7克隆yTPds基因并转化酵母细胞AH109获得相应重组子,滤纸法及液相分析法测酵母转化子内β-半乳糖苷酶(β-gal)的活性,证实yTPds蛋白可反式激活酵母GAL4反应元件(GAL4 responsive element).在此基础上,为进一步探讨该蛋白反式激活作用的功能区域,以pGBKT7分段克隆yTPds基因,分别编码yTPds蛋白N端47个氨基酸(yTPds-N47)、N端75个氨基酸(yTPds-N75)、中部28个氨基酸(yTPds-M28)、C端92个氨基酸(yTPds-C92)、C端64个氨基酸(yTPds-C64)以及去除中部28个氨基酸的融合蛋白(yTPds-Fusion).各重组载体转化酵母细胞AH109获得相应转化子.滤纸法定性检测酵母转化子内β-gal活性,结果显示yTPds-N75、yTPds-M28、yTPds-C92蛋白可反式激活GAL4反应元件,液相分析法显示酵母转化子内β-gal活性强弱为yTPds-M28＞yTPds-N75＞yTPds-C92＞yTPds,提示yTPds蛋白反式激活作用的功能区域是其中部28个氨基酸,该区域对应于HBV preS1蛋白反式激活功能域.此研究证实双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒(HBV)基因组剪接变异体特异性新蛋白具有反式激活作用,提示其可能具有重要的致病意义.
-
牛泡沫病毒长末端重复序列在大肠杆菌中的启动子功能
泡沫病毒具有复杂的基因组结构,包含典型反转录病毒共有的长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)启动子,负责起始结构基因gag、pol、env的表达,并在env基因内部存在独有的内部启动子(internal promoter,IP)[13],用以起始下游反式作用因子Tas(在BFV中称Borf-1)的表达.有报道劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus,RSV)和人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)LTR可在E.coli中起始基因表达[4,7].泡沫病毒至今未见报道.
关键词： 牛泡沫病毒(BFV) 长末端重复序列(LTR) 启动子 反式激活 应答元件 -
HBV整合的致癌性研究
HBV的4个亚基因产物中,HBx具有反式激活、介导细胞凋亡作用,HBs具有反式激活因子的作用.肝细胞癌(HCC)的发生与HBV的整合及整合后染色体重排有关.为探讨HBV整合及HBx、HBs亚基因在HCC发生中的可能作用,我们制备了HBV亚基因探针,并以此对肝细胞癌中HBV整合及亚基因转录进行了研究,以期为阐明HBV感染后HCC发生机制提供一定的实验资料和依据.
-
应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因
目前丙型肝炎病毒(HCV)与肝细胞之间相互作用的分子生物学机制尚不清楚,病毒编码的蛋白能够影响多种细胞信号转导途径,从而影响肝细胞某些基因的表达、调控,可能是病毒感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发展的重要原因.
-
B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白结构对反式激活能力影响
目的研究B、C基因型乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白氨基酸差异对反式激活能力的影响.方法以DNAMAN软件对GenBank中B、C基因型HBV的X蛋白进行氨基酸同源比较,确定B、C基因型HBV X蛋白各自的保守氨基酸序列并分析基因型特异性氨基酸.以相应核苷酸序列为参照,通过基因定点突变的方式获得保守的B、C型HBVX基因(分别为XB及XC)并构建真核表达载体pcDNA3.1-XB及pcDNA3.1-XC.将表达载体与报告质粒pCMVβ(含CMV即刻早期启动子)共同转染HepG2细胞并检测细胞内β-半乳糖苷酶的活性,实验数据以配对t检验进行分析.结果B、C型HBV X蛋白之间共有17个氨基酸差异,主要位于蛋白的反式抑制区及反式激活功能区.β-半乳糖苷酶在各组转染细胞内的活性依次为pcDNA3.1-XB+pCMVβ组＞pcDNA3.1-XC+pCMVβ组＞pcDNA3.1/Hygro(-)+pCMVβ组(对照组).结论B、C基因型HBV X蛋白对CMV即刻早期启动子均有反式激活能力,且B基因型HBV X蛋白要强于C基因型,这种差别与B、C基因型间X蛋白的17个氨基酸差异有关.X蛋白反式激活能力的不同与B、C基因型HBV产生不同的临床及病理表现的关系有待进一步研究.
-
双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体编码蛋白的反式激活作用
目的 研究双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体编码的新蛋白的功能.方法 PCR扩增双剪接型2.2kbHBV剪接特异性新基因并克隆于哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1/HisC.以FuGENE6将此重组载体(pcDNA3.1/HisC-TPds)转染Huh7细胞,采用融合表达的多肽表位(X-press表位)抗体,通过Western blot检测目的蛋白在不同时间段的表达.pcDNA3.1/HisC-TPds分别与β-半乳糖苷酶报告载体pSV-β-glactosidase(含SV40启动子/增强子)或pCMVβ(含CMV即刻早期启动子)共转染Huh7细胞,转染后48h裂解细胞并检测胞内β-半乳糖苷酶活性,实验数据以SPSS11.5软件分析.结果 克隆420bp双剪接型2.2kb HBV剪接变异体新基因,Western blot显示其在Huh7细胞中表达相应蛋白,以转染后48h为高.在含有CMV即刻早期启动子或SV40启动子/增强子的报告载体与pcDNA3.1/HisC-TPds质量比为1:10～1:50范围内,共转染有报告载体及pcDNA3.1/HisC-TPds的Huh7细胞内β-半乳糖苷酶活性均大于相应的pcDNA3.1/HisC空白载体对照组,且在1:10～1:40范围内存在剂量-效应关系.结论 双剪接型2.2kb HBV剪接变异体编码的新蛋白可反式激活CMV即刻早期启动子及SV40启动子/增强子,提示其可能与HBV致病有关.
-
乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响
目的 研究双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响.方法 PCR扩增6种HBV启动子/增强子序列,以Kpn Ⅰ及Xho Ⅰ位点克隆于pGL3-basic,分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP(含HBV基本核心启动子)、pGL3-CP1601(含增强子Ⅱ的核心启动子)、pGL3-XP(X基因小启动子)、pGL3-XP1071(含增强子Ⅰ的X基因启动子)、pGL3-SP1(表面抗原大蛋白基因启动子)、pGL3-SP2(表面抗原中蛋白基因启动子).以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1/HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1/HisC分别与6种HBV启动子/增强子报告载体共转染Huh7细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性,实验重复5次,数据以SPSS11.5软件分析.结果 在一定的质量比值范围内,与pcDNA3.1/HisC空白载体对照相比,pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后,Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高,而pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后,胞内荧光素酶活性无变化.结论 TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子Ⅰ、Ⅱ,对基本核心启动子和X基因小启动子无影响.
-
HBx及其截短体与HBV复制
HBx是HBV小的开放读码框(open reading frame,ORF)编码的一个154个氨基酸(amino acid,aa),分子量约17 kDa的多功能蛋白,它通过多种作用影响HBV的复制,如细胞周期、胞质信号转导以及与胞核转录作用元件的直接作用[1-2].HBx结构包含C-端2/3(aa51～154)反式激活区域与N-端1/3(aa1～50)负性调节区域[3].丙氨酸诱变突变扫描方法已经证实aa52～65及aa88～154对增强HBx在HBV中的复制十分重要[4],并且HBx的反式激活作用对增强HBV的复制能力可能是至关重要的,因此C-端反式激活区域对于增强HBV的复制能力是需要的,而N-端截短体对此并未产生明显的影响.
-
乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP13的克隆
目的克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白反式激活新型靶基因.方法以HBV X蛋白表达质粒pcDNA3J(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取总RNA进行逆转录,对产物行基因表达谱芯片分析,确定新基因编码序列后,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增新基因序列.结果获得新基因的全长序列,并测序证实,命名为X蛋白反式激活蛋白13(XTP13).结论成功克隆XTP13,为进一步阐明HBxAg在HBV感染中的分子生物学机制奠定基础.
-
应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选HBV XTP12蛋白反式激活基因的上调基因
目的 克隆并筛选乙型肝炎病毒(HBV)反式激活基因XTP12的上调基因,了解其可能存在的调节功能.方法 应用抑制性消减杂交技术克隆并筛选XTP12反式激活的新型靶基因.以XTP12表达质粒pcDNA3.1(-)-XTP12转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果 成功构建人XTP12反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到68个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000 bp插入片段.随机挑选其中28个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果 共获得28种编码基因,其中26种为已知基因编码蛋白,2种为未知功能的新基因.结论 筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞牛长调节、物质代谢、免疫及肿瘤等密切相关的蛋白编码基因,推测了XTP12可能存在的调控机制的线索.
-
丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活研究进展
丙型肝炎病毒非结构区3(HCV NS3)基因位于HCV基因组非结构区3420-5312核苷酸区段.HCV NS3具有多种潜在生物学功能,如蛋白酶、解旋酶活性,介导细胞免疫反应、反式激活端粒酶、调节p53活性及参与蛋白激酶A和STAT信号转导等[1,2],从而影响宿主细胞功能,导致细胞增生、凋亡,甚至癌变.对于NS3蛋白反式激活作用研究,可为进一步研究HCV致病(癌)的分子生物学机制和探索新的丙型肝炎治疗技术提供帮助.
-
乙型肝炎与肝癌关系
乙型肝炎病毒(HBV)感染不仅能引起急性和慢性肝炎、肝硬变[1-4],而且由于持续HBV感染和宿主免疫反应,终可导致肝细胞癌(HCC)[5-27].过去对其机制不清,近年由于分子生物学、细胞生物学先进技术的应用,这方面研究取得重大进展[28-43],特别是HBV X基因的表达产物(HBx)与HCC的关系成为当前研究的热点,关于其机制现有多种观点提出,特别是HBx与抑癌基因p53作用的机制、HBx的基因突变对其功能的影响,以及HBx通过调节细胞信号传导途径激活转录的机制等,均在分子水平上进行了深入研究[44-83].据近期文献报道,除上述外HBx还有其他重要功能,如对于细胞增殖和细胞凋亡的作用及在不同条件下的不同效应.所以HBx被认为是一多功能的调节因子[78-87].台湾儿童广泛推行乙肝免疫,使HCC发病率明显下降的报道引起广泛重视,这提示免疫是预防肝癌的有效措施,也证明HBV感染与HCC发病的密切联系[88-97].
-
应用抑制性消减杂交技术克隆HBV全S蛋白反式激活蛋白1的反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白反式激活蛋白1(CSTP1)的反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBV CSTP1反式激活相关基因.方法:以HBV CSTP1表达质粒pcDNA3.1(-)-CSTP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HBV CSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到86个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1000 bp插入片段.挑取25个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得23个已知基因序列和2个未知基因.未知基因的功能还正在研究中.结论:应用SSH技术成功构建了HBV CSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HBV CSTP1反式调节的靶基因及致肝病发生的分子生物学机制提供理论依据.
-
应用基因表达谱芯片技术筛选NS4ATP2蛋白反式调节基因
目的:对丙型肝炎病毒非结构蛋白4A(HCV NS4A)反式激活新基因NS4ATP2转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4ATP2和pcDNA3.1(-)空载体分别转染的HepG2细胞的mRNA的差异性表达进行检测.结果:基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS4ATP2表达质粒转染的细胞有29条差异表达基因,其中12条基因表达增强,17条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、肿瘤的发生密切相关.结论:基因表达谱芯片技术对于初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS4ATP2生物学功能及HCV-NS4A的致病机制提供了理论依据.
-
应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A-TP2(615)反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交技术构建人类新基因NS5ATP2(615)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆NS5ATP2反式激活相关基因,了解该基因的可能生物学功能.方法:构建NS5ATP2表达质粒pcDNA3.1(-)NS5ATP2-TP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;提取转染后细胞的mRNA,反转录为cDNA.半定量RT-PCR显示实验组NS5ATP2的转录水平明显高于对照组.cDNA经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pEGM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人类新基因NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到76个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的32个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知功能基因序列,和2个未知功能基因.结论:应用SSH技术成功构建了NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明NS5ATP2生物学功能提供理论依据.
-
应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-X蛋白反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆前-X反式激活相关基因,了解该段基因的可能生物学功能.方法:构建表达质粒pcDNA3.1(-)-前-X,转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;提取转染后细胞的mRNA,反转录为cDNA.cDNA经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到45个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得13种已知功能基因序列.结论:应用SSH技术成功构建了前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明该基因生物学功能提供理论依据.
-
HBV X基因和X蛋白的功能
HBV X基因编码的X蛋白(PX)是一种多功能蛋白,在HBV感染和肝细胞癌(HCC)发展的不同阶段,执行不同的生物学功能.PX参与调节病毒复制,显著影响肝细胞信号传导、新陈代谢、凋亡、细胞因子产生、细胞周期调控和癌基因、抑癌基因等方面基因表达,干扰线粒体氧化磷酸化等能量代谢过程,造成细胞氧化损伤,促进细胞凋亡.
-
乙型和丙型肝炎病毒蛋白反式激活作用机制及其意义的研究进展
编者按乙型肝炎病毒(HBV)和丙肝炎病毒(HCV)感染不仅引起急性、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化(LF)、肝细胞癌(HCC)的发生、发展密切相关.
-
乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP7的克隆
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)反式激活基因差异表达的cDNA,克隆HBxAg反式激活相关靶基因.方法:以HBxAg表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次杂交消减及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析,发现其中之一为未知基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索比对,电子拼接成功,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,初步确定新型基因序列.从转染了pcDNA3.1(-)的HepG2细胞提取总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序加以证实.结果:发现新基因,命名为XTP7,在GenBank中注册,注册号为AF490256.XTP7基因的编码序列全长为588个核苷酸(nt),编码产物由196个氨基酸残基(aa)组成.结论:应用SSH成功筛选与克隆HBxAg反式激活新型靶基因XTP7,为进一步阐明HBxAg反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.
-
丙型肝炎病毒核心蛋白上调细胞周期调节蛋白Wee1基因表达研究
目的:了解丙型肝炎病毒核心蛋白和细胞周期调节蛋白Wee1基因表达的关系,研究HCV核心蛋白在HCV致病的分子生物学机制中的作用.方法:应用聚合酶链反应(PCR)扩增Wee1基因启动子,命名为Weep.以T-A克隆法,将Weep基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pT-Weep,与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnI和XhoI双酶切后构建Weel启动子报告载体pCAT3-Weep,分别以重组报告载体pCAT3-Weep和pcDNA3.1(-)-core瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3basic的HepG2细胞为阴性对照,48 h后收获细胞.应用酶联免疫黏附方法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以了解HCV核心蛋白对Wee1基因启动子的反式激活作用.结果:构建的表达载体pcDNA3.1(-)-core和报告载体pCAT3-Weep经过序列分析和酶切鉴定正确.pCAT3-Weep和pcDNA3.1(-)-core瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是CAT3空载体的3.4倍,pCAT3-Weep的2.3倍.结论:丙型肝炎病毒核心蛋白可反式激活Wee1基因启动子,进而上调细胞周期调节基因Wee1的表达.
