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采用高通量基因芯片筛选乳腺癌分子诊断基因群的研究
早期诊断是提高乳腺癌治愈率和生存率的关键.肿瘤细胞的发生发展过程中涉及复杂的生物学过程.基因芯片技术可以在基因组范围内对组织细胞的基因表达谱进行研究,为肿瘤发生发展中多基因改变的分子机制研究提供了有力的工具[1].我们采用高通量基因表达谱芯片通过比较乳腺原发癌与其配对的癌旁正常乳腺组织基因表达差异筛选乳腺癌相关基因,并探讨其作为乳腺癌分子诊断基因标志群的临床意义.
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乙型肝炎病毒E抗原肝细胞作用蛋白AK026018表达谱芯片的研究
目的应用基因芯片技术,筛选能被乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)肝细胞作用蛋白AK026018反式调节的靶基因,初步研究该蛋白的生物学功能.方法应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从HepG2细胞中扩增编码AK026018蛋白的全基因,构建真核表达载体,转染肝母细胞瘤系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确.在8464个基因表达谱的筛选中,发现有122个基因有差异表达,其中78种基因表达水平显著下调,45种基因表达水平显著上调.结论成功地应用DNA芯片技术筛选出HBeAg结合蛋白新基因AK026018的反式调节蛋白,证明该基因对于肝细胞基因表达谱有显著影响.
关键词: 肝炎病毒 乙型 肝炎E抗原 AK026018基因 表达谱芯片 -
寡核苷酸表达谱芯片揭示的抗结核分枝杆菌感染免疫特征
目的研究临床分离的结核分枝杆菌菌株感染人巨噬细胞所引起的表达变化,寻找与其它细菌在诱导细胞表达方面的共性和特性. 方法用19*!200个基因的寡核苷酸芯片比较临床分离细菌感染U937前后细胞基因的表达变化,以生物信息学统计分析其它细菌引起宿主细胞的基因表达变化. 结果结核分枝杆菌感染导致1*!395个基因(7.26%)差异表达,特别显著的是细胞因子、锌指蛋白、转录因子和凋亡有关因子.与沙门菌、铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌、单孢李斯特菌、百日咳菌等细菌感染引起的免疫反应具有相似之处. 结论结核分枝杆菌感染与其它细菌感染引起的免疫反应在转录水平具有共性,也富有特性.锌指蛋白和fibronectin受体等因子在抗结核分枝杆菌感染免疫中的作用值得深入研究.
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mir-155-5 p调控胃癌细胞肿瘤生物学特征的靶点研究
目的::将mir-155-5p在胃癌细胞过表达后,选用表达谱芯片筛选其靶基因,结合生物信息学预测选择部分两者的交集靶基因,研究其功能和作用机制。方法:采用Affymetrix真核生物基因表达谱筛选mir-155-5p调控的基因实验,然后通过Western blot技术检测筛选靶基因的蛋白表达。本研究采用了人类全基因组基因表达谱芯片筛选了mir-155-5p mimics,mir-155-5p mimics-nc和mir-155-5p mock转染胃癌MKN-45和BGC-823细胞的后差异表达基因。结果:mimics在转染胃癌细胞BGC-823中后,与mimics-nc组和mock组细胞相比, mimics组细胞的SMAD1、STAT1、CAB39、CXCR4和CA9的mRNA的表达量显著下调;mimics在转染胃癌细胞BGC-823和MKN-45后,与mim-ics-nc(MNC)组和mock(MOCK)组相比,mimics(MIMICS)组细胞的 SMAD1、STAT1和 CAB39的蛋白的表达下调。结论:SMAD1、STAT1、CAB39作为mir-155-5p的预测靶蛋白,mir-155-5p过表达可使其在胃癌细胞MKN-45和BGC-823中的表达水平下调。
关键词: mir-155-5p 表达谱芯片 靶基因 胃癌细胞 蛋白表达 -
转移负相关新基因C14orf106的生物信息学分析
目的研究肿瘤原发灶和转移灶的基因表达差异,并采用生物信息学方法对1条卵巢癌肝转移灶低表达基因C14orf106进行初步分析.方法分别制备卵巢癌原发灶和肝转移灶组织标本mRNA,线性扩增后与人类寡核苷酸芯片杂交,通过信号扫描、处理后获得两者的表达差异基因.并用生物信息学方法对1条无功能研究的新基因C14orf106进行初步分析,预测了它的基因结构、染色体定位、编码蛋白质的理化性质、亚细胞定位、蛋白质功能域等信息.并对多物种中的相似性蛋白进行了系统进化分析.结果人类寡核苷酸芯片发现了共272条差异表达基因.对转移负相关新基因C14orf106的上述性质进行了有效的预测,基本明确了该基因编码蛋白为一核蛋白,可能参与了肿瘤转移抑制基因的转录活化及促进表达.结论生物芯片技术是一种研究肿瘤转移基因表达差异的有效的高通量研究方法.通过生物信息学分析,表明新基因C14orf106是一个有肿瘤转移研究价值的新靶点.
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乙型肝炎病毒DNA聚合酶N末端蛋白基因芯片研究
目的:检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶N末端蛋白(TP)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TP在乙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.方法:根据AF384372 HBVDNA病毒株序列设计、合成HBV DNA P-TP基因序列特异性的引物,以含有AF384372HBVDNA P全基因组cDNA的质粒G318A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HBV DNA-TP编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TP.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有TP蛋白的表达,提取高质量的mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有111个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV DNA P-TP转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TP蛋白致病的分子生物学机制提供依据.
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应用基因表达谱芯片技术筛选NS4ATP2蛋白反式调节基因
目的:对丙型肝炎病毒非结构蛋白4A(HCV NS4A)反式激活新基因NS4ATP2转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4ATP2和pcDNA3.1(-)空载体分别转染的HepG2细胞的mRNA的差异性表达进行检测.结果:基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS4ATP2表达质粒转染的细胞有29条差异表达基因,其中12条基因表达增强,17条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、肿瘤的发生密切相关.结论:基因表达谱芯片技术对于初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS4ATP2生物学功能及HCV-NS4A的致病机制提供了理论依据.
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应用表达谱芯片技术研究NS5ATP13的反式调节基因
目的:应用基因表达谱芯片研究HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP13的反式调节基因.方法:构建NS5ATP13基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP13,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5ATP13转染的人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP13后,有86条差异基因表达,其中46条基因表达增强,40条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导、代谢、凋亡密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP13的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP13的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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基因表达谱芯片筛选双环醇作用HepG2细胞后的差异表达基因
目的:应用基因表达谱芯片技术了解双环醇在肝细胞中可能上调或下调的基因,了解其可能的调节功能线索.方法:以双环醇处理HepG2细胞,同时以二甲基硫氧化物(DMSO)处理的相同细胞系作为对照;24h后制备细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果:经基因表达谱芯片分析,12种基因的表达水平上调,9种基因的表达水平下调.结论:筛选到的一些与细胞周期、蛋白质的翻译合成、能量代谢、体内免疫调节、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的起重要作用及肿瘤发生相关的基因,推测了双环醇可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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基因表达谱芯片技术筛选TAHCCP1转染细胞差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TAHCCP1在肝细胞中上调或下调的基因,探索其可能的调节功能.方法:设计并合成TAHCCP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TAHCCP1基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的TAHCCP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TAHCCP1,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA,逆转录为cDNA,应用基因表达谱芯片技术对两组间差异表达mRNA进行检测和分析.结果:在筛选的1 152点cDNA芯片中,有110种基因的表达水平上调(占9.55%),98种基因的表达水平下调(8.51%),包括一些与体内免疫调节、脂类代谢、蛋白质的翻译合成、氧化反应、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的基因.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了TAHCCP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TAHCCP1蛋白可能的生物学功能提供依据.
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基因表达谱芯片技术筛选HCTP4反式调节基因
目的:应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒核心(HCVcore)蛋白的反式调节基因HCTP4作用的靶基因.方法:构建HCTP4基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HCTP4,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-HCTP4转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞差异表达的mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染HCTP4后,有104条差异基因表达,其中54条基因表达增强,50条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:HCTP4是一种病毒反式激活蛋白,对于肝细胞基因表达谱有显著影响,与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关,在HCV的致病过程中有重要作用.
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基因表达谱芯片筛选NS5ATP3转染细胞差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP3的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明NS5ATP3蛋白可能的分子生物学功能.方法:设计并合成NS5ATP3基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP3蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP3编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP3.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有6个基因表达水平显著上调,18个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP3转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP3蛋白可能的生物学功能提供依据.
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筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白4B转染细胞差异表达基因
目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达基因,进一步阐明NS4B蛋白在丙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成HCV NS4B基因序列特异性的引物,以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS4B蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HCV NS4B编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS4B.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有NS4B蛋白的表达,提取高质量的mRNA并逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有22个基因表达水平显著上调,34个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HCV NS4B转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS4B蛋白致病的分子生物学机制提供依据.
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基因表达谱芯片技术筛选NS5A-TP4蛋白反式调节基因
目的:对新基因NS5A-TP4转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析我室通过抑制性消减杂交技术筛选得到的新基因NS5A-TP4的全长编码序列,并NS 5A-TP4构建基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A-TP4.应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A-TP4转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测.结果:确定基因NS5A-TP4由762 nt组成,编码253 aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS5A-TP4表达质粒转染的细胞有18条差异表达基因,其中12条基因表达增强,6条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、生长调节密切相关.结论:基因表达谱芯片技术可为初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS5A-TP4生物学功能及HCV-NS5A的致病机制提供了理论依据.
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应用基因表达谱芯片技术克隆甘草甜素诱导Jurkat细胞后的差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,阐明甘草甜素作用于T淋巴细胞之后,甘草甜素对于T淋巴细胞基因表达谱的影响.方法:应用基因表达谱芯片技术,对甘草甜素诱导的Jurkat细胞和以生理盐水处理的相同细胞的mRNA进行差异显示分析,研究甘草甜素诱导人T淋巴细胞系Jurkat细胞后的差异表达基因.结果:Jurkat细胞经甘草甜素诱导后,所检测的1152条目的基因中有30条产生差异表达,其中12条基因表达增强,18条基因表达降低.表达增强的基因主要有:胸腺素及促胸腺生成素蛋白编码基因;白介素-18(IL-18);细胞代谢相关酶类.表达降低的基因主要有:细胞信号转导相关基因(如血清/糖皮质激素调节激酶、丝裂素活化的蛋白激酶激酶激酶2、磷脂酶2调节亚基β、鸟嘌呤核苷结合蛋白、神经营养的酪氨酸激酶3型受体等);La自身抗原.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了甘草甜素诱导T淋巴细胞后差异表达基因,为进一步阐明甘草甜素的免疫调节机制及深入了解甘草甜素用于防治病毒性肝炎的药理作用机制提供依据.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析
目的:筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白基因,并对新基因转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制.方法:应用酵母双杂交技术,以HCV的核心蛋白作为"诱饵(bait)",筛选鉴定与其结合的肝细胞中蛋白的编码基因.应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析其中筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)基因的全长编码序列,并构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6.应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测.结果:通过酵母双杂交技术的筛选和鉴定,结合生物信息学分析,确定人的HCBP6基因由456 nt组成,编码152aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1 152条目的基因均为GenBank中登录的基因,HCBP6表达质粒转染的细胞有20条差异表达基因,其中13条基因表达增强,7条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、增生、分化及生长调节密切相关.结论:酵母双杂交技术结合生物信息学技术,是克隆蛋白结合蛋白的有效方法,基因表达谱芯片技术对于初步全面探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明HCV核心蛋白与Hcbp6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据.
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应用表达谱芯片技术筛选NS5ATP9反式调节基因的研究
目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9)的反式调节基因.方法:构建NS5ATP9基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP9,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5ATP9转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体pcDNA3.1(-)的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP9后,有16条差异基因表达水平发生显著改变,其中3条基因表达增强,13条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化、凋亡及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了丙型肝炎病毒NS5ATP9作用HepG2细胞后差异表达基因,为阐明NS5ATP9的作用提供了新的依据.
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应用表达谱芯片技术对截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的研究
目的:应用基因表达谱芯片研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原截短型中蛋白(MHBst)的反式调节基因.方法:构建MHBst基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-MHBst,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-MHBst转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染MHBst后,有37条差异基因表达,其中14条基因表达增强,23条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式调节基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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乙型肝炎病毒E抗原肝细胞结合蛋白E-18调节基因的表达谱芯片研究
目的:应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-E-18分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析,筛选能被E-18反式调节的靶基因,研究未知功能的HBeAg结合蛋白E-18的生物学功能.方法:应用酵母双杂交技术和体外免疫共沉淀技术筛选并验证HBeAg的肝细胞结合蛋白基因,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增E-18蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-E-18.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:筛选出肝文库中HBeAg结合蛋白E-18的编码基因,构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确.提取转染细胞的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 159个基因表达谱的筛选中,发现有52个基因有差异表达,其中36种基因表达水平显著下调,16种基因表达水平显著上调.结论:成功地应用DNA芯片技术筛选出HBeAg结合蛋白新基因E-18的反式调节蛋白,证明E-18基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.
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应用表达谱芯片技术对乙型肝炎病毒前-S2抗原结合蛋白S2-29反式调节基因的研究
目的:应用基因表达谱芯片技术,研究未知功能的乙型肝炎病毒(HBV)前-S2(preS2)抗原肝细胞结合蛋白基因S2-29过表达,对HepG2细胞的基因表达的影响.方法:应用酵母双杂交技术筛选并验证HBV前-S2的肝细胞结合蛋白基因.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增S2-29蛋白编码基因片段,经测序鉴定后构建表达载体pcDNA3.1(-)-S2-29,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-S2-29转染的人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:筛选出肝文库中HBV前-S2结合蛋白S2-29的编码基因,构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确.提取转染细胞的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有9个基因表达水平显著下调,包括真核翻译延伸因子2、MAP激酶激活的死亡域、谷胱甘肽过氧化物酶、肌动蛋白、NDRG、Prosaposin、SUMO-1激活酶亚基1、胰岛素受体和1个未知功能蛋白.1个未知蛋白编码基因的表达上调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV前-S2结合蛋白S2-29蛋白的反式调节基因,为进一步阐明S2-29蛋白对细胞表达调控的影响提供了新的依据.