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男性生殖相关基因功能研究策略
男性不育是较为常见的病症,约4%的男性受到不育的困扰.男性原发性不育与男性生殖相关基因的缺陷有密切关系.近年来,国内外发表了大量文献展示了新发现的与男性生殖相关的基因.刘美玲等[1]在采用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选大鼠精原细胞与精母细胞差异表达基因过程中,发现了大鼠睾丸特异表达基因LM23基因.沙家豪所在的重点实验室运用人胚胎和成人睾丸cDNA探针与人睾丸dDNA微阵列杂交,通过差异杂交的克隆进行序列测定和分析,筛选
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应用抑制性消减杂交技术筛选结核分枝杆菌差异基因
目的 筛选新疆地区结核分枝杆菌临床分离株与国际标准株H37Rv之间的差异基因,初步分析这些基因的功能.方法 利用抑制性消减杂交技术,通过两轮两相杂交,驱赶相同基因富集差异基因.结果 正相抑制性消减杂交一共获得6条新疆地区临床分离株中存在的差异基因,虽然这些基因在H37Rv基因组中不存在,但与国际标准临床株CDC1551以及复合群国际标准株KMS中的对应基因高度同源,分别与编码多萜醇磷酸甘露糖基转移酶Ⅱ、单加氧酶黄素结合蛋白、酰基转移酶蛋白、染色体复制起始密码子、脂酰基载体蛋白以及5'-磷酸吡哆胺氧化酶的基因有关.结论 新疆地区结核分枝杆菌临床分离株与国际标准株H37Rv之间存在差异基因,这些差异基因的功能可能与已知同源基因的功能相似:增强细菌胞壁蛋白的吸附能力、抵抗氮氧合酶消化、提高乙酰基辅酶A的合成能力、调控复制起始密码子、合成胞壁脂酰基载脂蛋白和促进5'-磷酸吡哆胺氧化酶代谢.
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应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因
目前丙型肝炎病毒(HCV)与肝细胞之间相互作用的分子生物学机制尚不清楚,病毒编码的蛋白能够影响多种细胞信号转导途径,从而影响肝细胞某些基因的表达、调控,可能是病毒感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发展的重要原因.
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抑制性消减杂交技术与基因克隆化
近年来,随着分子生物学技术的迅猛发展及人类基因组计划的实施,当今分子生物学的研究热点已转向利用新技术研究生物学、医学乃至动植物领域中基因的功能及调控作用,如个体的生长、发育和死亡等许多问题的产生与细胞间基因表达的关系研究,尤其是分离和鉴定与危害人类健康疾病(如恶性肿瘤、心脑血管疾病及一些原因不明的慢性疾病等)的发生、发展密切相关的基因,分离、鉴定这些差异表达的基因,可为揭示生命活动的规律、探索疾病发生机制及寻找诊断及治疗的靶基因提供强有力的依据.
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抑制性消减杂交技术及其在感染病学中的应用
抑制性消减杂交技术(Suppressive subtractive hybridization,SSH)是近年来兴起的一种检测差异表达基因的方法,广泛用于寻找疾病及肿瘤相关基因、生长和发育相关基因、物的筛选和靶向治疗及其明确基因的功能等.本文从SSH技术的原理、效率、存在的问题和展望及其在感染病学中应用等方面进行了综述.
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应用抑制性消减杂交技术筛选rhALR调节基因
目的:筛选与克隆重组人肝再生增强因子激活基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:应用大肠杆菌系统,表达、纯化重组人肝再生增强因子蛋白.刺激HepG2细胞,以溶剂PH7.8的磷酸盐缓冲液为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建重组人肝再生增强因子激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到30个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得19种编码基因,包括15种已知基因和4种未知基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因,推测了重组人肝再生增强因子在体内可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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应用抑制性消减杂交技术克隆HBV全S蛋白反式激活蛋白1的反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白反式激活蛋白1(CSTP1)的反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBV CSTP1反式激活相关基因.方法:以HBV CSTP1表达质粒pcDNA3.1(-)-CSTP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HBV CSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到86个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1000 bp插入片段.挑取25个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得23个已知基因序列和2个未知基因.未知基因的功能还正在研究中.结论:应用SSH技术成功构建了HBV CSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HBV CSTP1反式调节的靶基因及致肝病发生的分子生物学机制提供理论依据.
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应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A-TP2(615)反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交技术构建人类新基因NS5ATP2(615)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆NS5ATP2反式激活相关基因,了解该基因的可能生物学功能.方法:构建NS5ATP2表达质粒pcDNA3.1(-)NS5ATP2-TP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;提取转染后细胞的mRNA,反转录为cDNA.半定量RT-PCR显示实验组NS5ATP2的转录水平明显高于对照组.cDNA经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pEGM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人类新基因NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到76个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的32个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知功能基因序列,和2个未知功能基因.结论:应用SSH技术成功构建了NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明NS5ATP2生物学功能提供理论依据.
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应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-X蛋白反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆前-X反式激活相关基因,了解该段基因的可能生物学功能.方法:构建表达质粒pcDNA3.1(-)-前-X,转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;提取转染后细胞的mRNA,反转录为cDNA.cDNA经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到45个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得13种已知功能基因序列.结论:应用SSH技术成功构建了前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明该基因生物学功能提供理论依据.
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP8的克隆
目的:应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)反式激活基因差异表达的cDNA,克隆HBxAg反式激活相关靶基因.方法:以HBxAg表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析,发现其中之一为未知基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索比对,电子拼接成功,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,初步确定新型基因序列.从转染了pcDNA3.1(-)的HepG2细胞提取总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序加以证实.结果:发现新基因,命名为XTP8,在GenBank中注册,注册号为AF49257.XTP8基因的编码序列全长为1590个核苷酸(nt),编码产物由530个氨基酸残基(aa)组成.结论:应用抑制性消减杂交技术成功筛选与克隆HBxAg反式激活新型靶基因XTP8,为进一步阐明HBxAg反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.
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应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选HCVp7蛋白的反式调节基因
目的:构建丙型肝炎病毒HCV p7蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA,克隆HCV p7蛋白反式激活相关基因.方法:以HCV p7表达质粒pcDNA3.1(-)-p7转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HCV p7蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA.扩增后得到56个200-1000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中33个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因,其中1个为未知功能的新基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括与细胞生长调节、物质代谢、和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因.
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应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因
目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因.方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1 000 b插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因.结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础.
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基因表达谱芯片技术筛选NS5A-TP4蛋白反式调节基因
目的:对新基因NS5A-TP4转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析我室通过抑制性消减杂交技术筛选得到的新基因NS5A-TP4的全长编码序列,并NS 5A-TP4构建基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A-TP4.应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A-TP4转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测.结果:确定基因NS5A-TP4由762 nt组成,编码253 aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS5A-TP4表达质粒转染的细胞有18条差异表达基因,其中12条基因表达增强,6条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、生长调节密切相关.结论:基因表达谱芯片技术可为初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS5A-TP4生物学功能及HCV-NS5A的致病机制提供了理论依据.
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应用抑制性消减杂交技术筛选TAHCCP2的反式调节基因
目的:筛选与克隆TAHCCP2的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆TAHCCP2反式激活的新型靶基因.以TAHCCP2表达质粒pcDNA3.1(-)-TAHCCP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取muRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人TAHCCP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到70个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了TAHCCP2可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与NS5ATP9蛋白结合蛋白的编码基因
目的:我们在以往的研究中,应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选得到了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9),NS5ATP9是一种未知功能新基因.为了进一步研究NS5ATP9的生物学功能,应用酵母双杂交技术,筛选并克隆人白细胞中与NS5ATP9蛋白相互作用蛋白的基因,进一步阐明NS5ATP9的生物学功能及其作用途径.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP9基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS5ATP9基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基上生长,又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上变蓝的真阳性菌落46个,其中含人类免疫球蛋白轻链13个,核小体表面蛋白10个,铁蛋白重链2个,人类重组免疫球蛋白λ轻链11个,14-3-3家族蛋白1个,脑膜炎球菌PorA蛋白1个,RNA多聚酶Ⅲ 3个,烟草有丝分裂原激活蛋白激酶1个,细胞色素P450Ⅱ2个,SLIT2蛋白1个,DNA依赖蛋白激酶催化亚基1个.结论:成功克隆出丙型肝炎病毒NS5ATP9蛋白的结合蛋白,为进一步研究NS5ATP9的生物学作用提供了新的线索.
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截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白上调c-myc基因表达的研究
目的:应用抑制性消减杂交方法构建截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBst)反式调节基因的消减文库,用免疫印迹方法验证截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白对c-myc基因的上调表达.方法:构建羧基末端截短的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白的真核表达载体pcDNA3.1(-)-Mt,分别以重组表达质粒pcDNA3.1(-)-Mt和空载体pcDNA3.1(-)瞬时转染HepG2细胞,提取细胞mRNA并逆转录为cDNA,用抑制性消减杂交技术,将实验组与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),构建eDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.生物信息学分析结果显示部分与肿瘤发生密切相关的基因,如癌基因c-myc.结果:显示截短型乙肝病毒表面抗原中蛋白可以反式激活c-myc基因,并上调其表达.结论:成功构建截短型乙肝病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的消减文库,细胞原癌基因c-myc是MHBst反式激活作用的靶基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制提供理论基础.
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应用抑制性消减杂交技术筛选HBV DNA聚合酶中RNase H的反式调节基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建HBV DNA聚合酶(DNAP)末端蛋白反式激活基因.方法:以RNase H表达质粒pcDNA3.1(-)-RNase H转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到38个白色克隆,经菌落PCR分析,得到36个200-1 000bp插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,显示33种已知基因编码蛋白和3种未知功能基因序列,可能是RNase H反式激活靶基因.结论:成功构建HBV RNase H反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP5的克隆
目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白5A(HCV NS5A)反式激活新型靶基因.方法:以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRRNA并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为1 191个核苷酸(nt),编码产物由396个氨基酸残基(aa)组成.命名为NS5ATP5,在GenBank中注册,注册号为AF529366.结论:HCV NS5A反式激活新型靶基因NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.
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应用抑制性消减杂交技术筛选双环醇调节靶基因
目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybrid-ization,SSH)技术构建双环醇处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆双环醇调节相关基因,阐明双环醇对肝细胞调节作用的分子生物学机制.方法:以双环醇处理HepG2细胞,同时以二甲基硫氧化物(DMSO)处理的相同细胞系作为对照;24 h后制备细胞裂解液,提取muRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到46个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到2 0-1 000bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得14种已知基因序列.结论:应用SSH技术成功构建了双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明双环醇在体内的调节机制提供依据.
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应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活基因1的反式调节基因
目的:筛选与克隆丙型肝炎病毒(HCV)NS3反式激活基因1的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin-formatics)技术筛选并克隆NS3TP1反式激活的新型靶基因.以NS3TP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人NS3TP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到68个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.随机挑选其中36个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得23种编码基因,其中3个为未知功能的新基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了NS3TP1可能存在的调控机制的线索.