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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因6的克隆和鉴定
目的:乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)是一种具有反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索HBxAg蛋白反式激活作用的新的靶基因,利用抑制性消减杂交(SSH)技术对于表达和不表达HBxAg蛋白的HepG2细胞进行研究,以期发现HBxAg蛋白反式激活作用的新靶点,为阐明HBxAg蛋白的反式激活作用分子生物学机制,以及HBV相关的肝细胞癌(HCC)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向.方法:以HBxAg表达质粒pcDNA3.1(-)-HBxAg转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,克隆、鉴定新型基因.结果:在16种HBxAg蛋白上调的靶基因中,其中包括未知功能基因,利用生物信息学技术,获得HBxAg蛋白反式激活作用的新型靶基因,开放读码框架(ORF)长度为237个核苷酸(nt),编码产物由78个氨基酸残基(aa)组成,命名为XTP6,在GenBank中注册,注册号为AF490255.结论:HBxAg蛋白是一种具有反式激活作用的蛋白,应用抑制性消减杂交技术成功筛选与克隆HBxAg蛋白反式激活新型靶基因XTP6,为进一步阐明HBxAg蛋白反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.
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应用抑制性消减杂交技术克隆HCV NS3蛋白反式激活基因2的上调基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV NS3蛋白反式激活相关基因.方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HCV NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到61个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1 000bp插入片段.挑取30个插入片段测序分析,得到30个已知功能基因序列.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码因,推测了NS3TP2可能存在的调控机制的线索.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因1的克隆
目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV NS5A蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,分析并克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,从转染pcDNA3.1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP1.NS5ATP1基因的编码序列全长为1011个核苷酸(nt),编码产物由336个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV NS5ATP1是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白,而SSH是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.通过这种技术,发现了HCVNS5ATP1反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为进一步研究HCV NS5ATP1蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.
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应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒核心抗原反式调节基因
目的:筛选与克隆HBcAg反式调节基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:以分子生物学技术构建HBcAg的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBcAg,以表达质粒pcDNA3.1(-)-HBcAg转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HBcAg激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到33个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-800 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得17种编码基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢及肿瘤发生密切相关的蛋白编码基因,推测了HBcAg在体内可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活基因1的克隆化研究
目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)羧基末端截短型表面抗原中蛋白(MHBst)的反式激活作用,利用差异显示技术,筛选克隆MHBst蛋白的反式激活作用的靶基因,发现新型基因,为阐明MHBst对于肝细胞表达基因谱的影响,探索新的研究方向.方法:利用多聚酶链反应技术(PCR)扩增MHBst的编码基因片段,构建真核表达载体pcDNA3.1-MHBst,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,与仅转染空白载体pcDNA3.1的HepG2细胞进行差异显示,利用抑制性消减杂交技术(SSH)克隆鉴定MHBst的反式激活作用的靶基因,通过生物信息学技术,确定新基因的序列,设计序列特异性引物,利用HepG2细胞来源的mRNA进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,克隆新基因,并对于新基因的序列以及编码基因产物序列进行分析.利用生物信息学技术确定TTP1基因是新基因.结果:构建表达载体pcDNA3.1-MHBst,经过序列分析和酶切鉴定正确.转染HepG2细胞系,利用SSH技术获得差异表达的基因片段.经对于美国生物工程信息学中心(NCBI)建立的核苷酸序列的数据库(GenBank)检索,证实这是一个新型基因片段.通过对于同源基因序列的比对,根据Kozak规则和终止密码子下游的多聚腺苷酸信号序列,确定新基因的序列,将这种MHBst反式激活的新基因命名为TTP1,并在GenBank中注册登录.结论:克隆并鉴定了乙型肝炎病毒羧基末端截短型表面抗原中蛋白反式激活作用的新型靶基因TTP1,为今后研究MHBst的反式激活作用,开辟了新的研究方向和可能.
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干扰素-α转染HepG2细胞内下调表达基因的筛选
目的 筛选干扰素-α真核表达质粒转染HepG2细胞后细胞内表达下调的基因,以进一步探讨干扰素-α作用的分子生物学机制.方法 将pcDNA3.1(-)-IFN-α以及pcDNA3.1(-)空载体分别转染肝母细胞瘤HepG2细胞系,用抑制性消减杂交技术筛选pcDNA3.1(-)-IFN-α转染HepG2细胞内表达下调的基因.以pcDNA3.1(-)转染组细胞作为tester,pcDNA3.1(-)-IFN-α转染组作为driver,建立消减文库,随机挑选阳性克隆,测序并进行序列比对,得到下调表达的基因.应用RT-PCR技术,进一步证明IFN-α对Hsp90的下调表达作用关系.结果 成功构建了IFN-α真核表达质粒转染HepG2细胞后表达下调的cDNA消减文库.从文库中随机挑选克隆,测序并进行生物信息学分析后,得到下调表达的基因有:铁蛋白,热休克蛋白90,S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶1,真核翻译延伸因子1β,信号序列受体β(SSR2),组织因子路径抑制子,RAD23同源物B.RT-PCR进一步表明,IFN-α真核表达质粒转染的HepG2细胞内Hsp90 mRNA表达水平下调.结论 应用SSH技术成功构建了pcDNA3.1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞内表达下调的cDNA消减文库,并筛选出下调表达基因,半定量RT-PCR表明IFN-α对Hsp90 mRNA具有下调表达作用.为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据.
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肝癌分子边界/切缘建立及相关治疗研究
肝癌是常见的恶性肿瘤之一,手术是治疗肝癌的主要手段,但对于判断肝癌组织是否被全部彻底切除尚无有效的鉴别方法.我们应用抑制性消减杂交技术、基因芯片、RT-PCR和组织芯片等技术从基因和蛋白水平对肝癌的分子边界进行初步的研究,从多个基因和蛋白质分子水平观察癌内和癌周组织的表达差异,为进一步精确定位肝癌分子边界及寻找新的肝癌诊断、预后标志物和治疗靶点奠定基础.
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益气活血中药复方对CVB3大鼠心肌细胞感染模型核糖体蛋白L27a表达的影响
目的:研究益气活血中药复方对CVB3大鼠心肌细胞感染模型核糖体蛋白L27a( ribosomal protein L27a)表达的作用机制,进一步证实益气活血中药复方是治疗CVB3病毒性心肌炎的有效方剂.方法:本实验用新生2～3天大鼠心肌细胞建立柯萨奇病毒B3( CVB3)感染模型,通过改良的抑制性消减杂交技术(SSH),克隆了受CVB3攻击的宿主细胞中被中药(益气活血中药复方)调控的基因.结果:核糖体蛋白L27a在中药组中呈高表达,病毒组中表达减弱或被抑制.结论:益气活血中药复方能够影响受CVB3攻击的宿主细胞核糖体蛋白L27a的表达,有效保护心肌、阻断病程进度,实现治疗病毒性心肌炎的目的.
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益气活血中药复方对CVB3大鼠心肌细胞感染模型ATP6基因表达的影响
目的:研究益气活血中药复方对CVB3大鼠心肌细胞感染模型ATP6(ATP synthase F0 subunit6)基因表达的作用机制.方法:本实验用新生2-3dWistar大鼠心肌细胞,建立CVB3病毒感染模型,通过改良的抑制性消减杂交技术(SSH),克隆了受CVB3攻击的心肌细胞中被中药(益气活血中药复方)调控的基因.结果:ATP6基因,在中药组中高表达,而病毒组中表达减弱或抑制.结论:益气活血中药复方能影响受CVB3病毒攻击的宿主细胞ATP6基因的表达,有效保护心肌、阻断病程进度,从而实现治疗病毒性心肌炎的目的.
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抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白2的反式激活基因
HBV为带包膜的嗜肝DNA病毒属,其基因组由松弛环状、部分双链DNA(rcDNA)组成.负链较长,约为3 200个核苷酸(nt),其5'端共价结合病毒多聚酶;正链较短,长度可变,为1 700～2800nt,在其5'端有寡聚核糖核苷酸帽.HBV基因组具有4个开放读码框(ORF),通过不同的起始密码子(ATG)编码至少7个蛋白,包括3个表面抗原:包膜蛋白前-S1、前-S2、S,HBcAg,HBeAg,病毒多聚酶(P)及X蛋白(HBxAg).包膜蛋白的作用主要是允许病毒核壳体进、出宿主肝细胞而不引起细胞裂解.前-S1蛋白由前-S1基因编码,前-S1基因区的长度在不同亚型问有所差别,在324～357 nt.前-S1蛋白在HBV生物学中具有双重作用,它既是病毒包膜装配过程中与核心颗粒结合的配体,也是在病毒感染过程中与一个尚未鉴定出的宿主细胞受体相互作用的底物.许多研究表明,HBV前-S1蛋白具有反式激活作用[1-4].
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高、低淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞株抑制性消减杂交文库的构建
应用抑制性消减杂交(suppression subtracted hybridization,SSH)技术,分别构建2个不同淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞株的SSH文库,高转移文库以高转移能力细胞株Hca-F为检测子(tester),同源的低转移能力细胞株Hca-P为驱赶子(driver);低转移文库则相反.随机筛选2个文库阳性克隆进行测序,并在GenBank数据库中进行同源性比较.成功构建高、低淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞株SSH文库,高、低转移文库中分别包含995个及967个阳性克隆;其中,95%的阳性克隆含有300bp～1 000bp不等的插入片段;随机测序显示,文库中含有已知的基因、ESTs及与任何序列无同源性的新基因片段.
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抑制性消减杂交技术与肿瘤学研究
抑制性消减杂交技术是一种克隆基因的新方法,与传统方法相比,具有高度敏感性、特异性以及方法简便等优点,近年来已克隆出许多新的肿瘤相关基因,为肿瘤学研究带来了新的思路.
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应用抑制性消减杂交技术筛选HBeAg蛋白结合蛋白E36的上调基因
目的 应用酵母双杂交及生物信息学(bioinformatics)技术获得HBeAg蛋白结合蛋白HBEBP36(E36),为了解该基因的反式调节机制,利用抑制性消减杂交技术筛选并克隆E36蛋白反式激活的靶基因.方法 E36基因表达质粒pcDNA3.1/myc-his(A)(-)-E36转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1/myc-his(A)(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将产物与pGEM-T Easy载体连接,构建cDNA消减文库,转化大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选30个克隆进行测序及同源性分析.结果 成功构建人E36基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.随机挑选的30个克隆测序后得到27个序列,它们代表17种编码基因,包括ATP合酶、ADP/ATP转运体、NADH脱氢酶、乳酸脱氢酶、核糖体蛋白L23、核糖体蛋白S21、核糖体蛋白L2、胰岛素样生长因子结合蛋白6、甲基转移酶类似物7A、CD46抗原、间质抗原2、转录激活因子4、真核转录延伸因子1α、人微管蛋白α、肌动蛋白α,和2个未知片段.结论 E36上调HepG2细胞中的17种基因,它们参与能量代谢、蛋白合成、免疫功能调节等生理过程.
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肝再生中α2-巨球蛋白的表达动态分析
目的确定更多的与肝再生相关的基因.方法借助4～8正向抑制性消减文库(0-4-8-12短间隔连续部分肝切除)产生的α2-巨球蛋白基因片段,运用cDNA芯片分析了其mRNA在再生肝中的表达动态.结果肝再生中α2-巨球蛋白呈上调表达,而且变化幅度很大,至高点超过21倍.大部分肝切除中α2-巨球蛋白的表达高峰出现在8 h和16 h.短间隔连续部分肝切除中α2-巨球蛋白的表达呈现不同的变化趋势,4 h短间隔的连续肝切除诱导α2-巨球蛋白表达不断升高,而第二次的36 h短间隔的连续肝切除才能诱导α2-巨球蛋白表达显著升高.结论肝再生中α2-巨球蛋白可能在早期的正相急性反应中起重要作用,减少切除伤害带来的炎症,促进肝再生的顺利进行.
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益气活血中药复方与CVB3对乳鼠心肌细胞基因表达的影响
目的:克隆和筛选CVB3乳鼠心肌细胞感染相关基因,以期从基因水平揭示CVB3心肌炎的发病机制,同时探索益气活血中药复方治疗病毒性心肌炎的作用机制.方法:通过改良的抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),分离大鼠心肌细胞CVB3感染组和益气活血中药复方给药组差异表达的基因,并通过荧光RT-PCR对上述结果进行验证.结果:益气活血中药复方治疗组ARMET(arginine-rich,mutated in early stage tumors)基因的表达比CVB3病毒感染组低,而PI3K样家族蛋白(Phosphoinositide 3-kinase-like family protein)催化区基因在益气活血中药复方治疗组表达则增加,并得到荧光RT-PCR的验证.结论:筛选到两个可能与CVB3心肌炎形成有关的基因,提示了病毒性心肌炎发生的新机制;益气活血法可能通过调节某些基因的表达而实现治疗病毒性心肌炎的目的.
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甲状腺癌特异性低表达基因的筛选与克隆
目的筛选并克隆在甲状腺癌组织中特异性低表达的基因.方法 (1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差异表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库.(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性低表达的基因.(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析.(4)应用cDNA末端快速扩增法(RACE)获取目的基因TCRS30的cDNA全长.(5)Northern blot验证TCRS30号基因的差异表达.结果构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,通过筛选阳性克隆,获得一个在甲状腺癌组织中低表达的基因片段,经检索Genbank表明,在已知的人类EST数据库中找不到高度同源的序列,提示它可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因.以RACE法获知TCRS30的cDNA全长约为4.5 kb,通过Northern blot初步验证了TCRS30号基因在甲状腺癌和正常甲状腺组织中存在差异表达.结论通过SSH和RACE技术,获得了一个在甲状腺癌和正常甲状腺组织中差异表达的未知基因片段TCRS30,它可能代表着一条对甲状腺癌有抑制作用的新基因.
关键词： 甲状腺癌 抑制性消减杂交技术 cDNA末端快速扩增 基因 -
抑制性消减杂交法构建甲状腺癌差异表达基因文库
目的筛选并克隆在甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的基因.方法(1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差示表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性高/低表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析.结果成功构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,对其中数个克隆的插入cDNA片段进行测序,经检索Genbank表明,正向SSH产物中有3个片段与来源于结肠上皮腺癌和Lung Epidermoid carcinoma的EST有100%同源性,提示它们来自恶性肿瘤相关基因.反向SSH产物中有5个片段为未知新序列,提示它们可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因.结论通过抑制性消减杂交技术,构建了人甲状腺癌cDNA消减文库,为下一步筛选鉴定甲状腺癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等工作打下了基础.
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拮抗凋亡转录因子基因在高转移人成骨肉瘤细胞系中的高表达
背景与目的:成骨肉瘤是青少年中常见的恶性骨肿瘤,具有易发生肺转移的特点.尽管目前已能够成功地控制原发瘤,但是仍有30%以上的患者在5年内死于肺转移.更好地理解调节转移过程的分子机制,为设计有效的治疗方案提供生物学基础,我们用原位移植的方法建立了人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607裸鼠转移模型,用这一模型筛选出了高转移细胞系SOSP-M.本研究旨在通过比较两个细胞系的基因表达水平来克隆与骨肉瘤转移相关的基因,探讨成骨肉瘤转移的分子机制.方法:采用抑制性消减杂交技术建立人成骨肉瘤高转移细胞株SOSP-M的消减文库;用差异筛选技术筛选出阳性克隆;对部分克隆进行测序和同源性分析,用Northern杂交及反转录多聚酶链式反应技术对SOSP-M中表达上调的有意义的克隆在低转移细胞系SOSP-9607、OS-9901、高转移细胞系SOSP-M和裸鼠肺转移结节中的表达情况进行了分析.结果:在高转移细胞株SOSP-M中有2个阳性克隆均与人凋亡对抗转录因子(apoptosis antagonizing transciption factor)同源(99%同源).Northern杂交及反转录PCR证实这个基因在高转移细胞和裸鼠肺转移结节中高表达,而在低转移人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和OS-9901中表达微弱.结论:对抗凋亡转录因子在促进肿瘤细胞转移中可能起重要作用.
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用抑制性消减杂交方法筛选人肾癌相关基因
目的 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌差异表达基因文库并进行差异表达基因筛选.方法 以肾癌细胞株RLC-310和肾近曲小管细胞株HK-2互为实验组和对照组,提取mRNA,应用抑制性消减杂交技术进行正反两向消减杂交,获得人肾癌细胞差异表达基因文库,结合反向Northern斑点印迹杂交,筛选差异基因克隆,并进行测序分析.结果 正向和反向文库共包含1200多个阳性克隆,经斑点杂交筛选后,对213个差异克隆进行测序并经BLAST分析,得到144个差异表达基因,与肾癌相关的高表达基因67个,低表达基因77个,其中新EST 14个,未知功能基因21个;对测序基因进行聚类分析发现与细胞生长、黏附、凋亡等肿瘤细胞生物学行为相关.结论 该文库质量可靠,所筛选出的差异基因和新的基因为进一步筛选肾癌特异性相关基因,绘制肾癌差异基因表达谱,终阐明肾癌发生、发展、转移机制提供了实验材料和研究靶点.
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基于舌鳞癌Tca8113细胞醛脱氢酶活性不同构建差异表达基因cDNA文库
目的 构建舌鳞癌Tca8113细胞系中高、低醛脱氢酶活性(high/low aldehyde dehydrogenase activity,ALDHhigh/ALDHlow)细胞差异表达基因cDNA文库.方法 用流式细胞仪检测ALDEFLUOR(R)染色的Tca8113细胞中干细胞标志物ALDH的表达,并收集ALDHhigh和ALDHlow细胞；用Trizol分别提取两亚群细胞的总RNA;用抑制性消减杂交(SSH)对2组RNA进行差异基因筛选和扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α.文库扩增后,每库随机挑取24克隆进行酶切、测序及同源性分析.结果 分选得到ALDHhigh和ALDHlow两亚群细胞,其中ALDHhigh细胞的比例为2.5％；分光光度计测得ALDHhigh和ALDHlow的RNA D( 260 )/D( 280)的比值分别为1.93和1.92;构建了ALDHhigh和ALDHlow细胞差异基因cDNA双向文库,每个库约500个克隆菌落,每库随机挑选24个菌落进行PCR分析,克隆片段均 匀分布在200～700 bp,无假阳性克隆.测序结果经同源性比对分析和PubMed检索,其中与肿瘤有关的基因有SLC25A13、KLHL2、NPC1、WAPL、BARD1、Notch2、EEF2K.结论 成功构建ALDHhigh和ALDHlow细胞差异基因cDNA文库.
关键词： 人舌鳞癌Tca8113 抑制性消减杂交技术 cDNA文库 肿瘤干细胞 醛脱氢酶
