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桂郁金EST资源的SSR信息分析及EST-SSR标记开发
目的:分析桂郁金EST中SSR位点分布规律,开发桂郁金EST-SSR引物,探讨EST-SSR用于桂郁金品种遗传多样性的可行性.方法:从NCBI公共数据库下载姜黄属EST序列(expressed sequence tag,EST)12 678条,利用MISA软件对其进行SSR位点查找,选出符合条件的序列,采用Primer 5.0软件设计EST-SSR引物,利用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳研究这些EST-SSR引物PCR扩增的特点,进一步验证开发结果的合理性与有效性.结果:下载得到的12 678条EST序列中,共有926条序列包含SSR位点,占整个EST数据库的7.30％,其中SSR位点所占比例大的是二核苷酸重复序列,三核苷酸和四核苷酸次之,分别为623 (50.90％)个,388 (31.70％)个和125(10.21％)个.根据筛选得到的微卫星序列共设计了165个EST-SSR引物对,选择其中92分以上的24个合成.PCR检测表明,21个引物对(87.50％)可以扩增出稳定清晰的带型;在6份不同种质桂郁金中检测到13对EST-SSR引物有多态性,占设计引物的54.17％.利用13对验证的EST-SSR引物对20个桂郁金品种进行了亲缘关系分析.结论:桂郁金EST-SSR标记开发的效率较高,是桂郁金SSR标记开发的重要措施,对于桂郁金品种鉴定和遗传多样性分析以及育种等方面具有重要的意义.
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基于高通量测序的红豆杉EST-SSRs标记研究
目的:利用高通量测序,对红豆杉Taxus cuspidata转录组进行EST-SSRs发掘和研究.方法:提取红豆杉叶片cDNA,应用454 GS FLX Titanium测序,采用Newbler Assembler Software软件对序列(high-quality sequences)进行从头拼接,获得一致性序列(unique sequences).用Simple Sequence Repeat Identification Tool (Perl Script)对一致性序列进行分析,检索SSRs模体；采用PRIMER3设计扩增引物.结果:高通量测序获得红豆杉81 148条ESTs,经拼接得到20 557条unique sequences,从中发现了753个EST-SSRs.依据其邻近序列设计引物,共有519条EST-SSRs获得了扩增引物.在红豆杉EST-SSRs中随机挑选序列构建小样本,克隆测序结果表明87.5％的序列与Sanger测序结果一致.结论:首次获得了红豆杉属EST-SSRs,为红豆杉的种质资源培育、功能基因及基因组差异研究奠定了基础.
关键词： 东北红豆杉 EST-SSRs标记 高通量测序 表达序列标签 -
应用EST和电子克隆策略研究血吸虫表达基因谱
目的开展血吸虫表达基因谱的研究,寻找新的疫苗候选分子和药物靶标.方法应用表达序列标签(EST)和电子克隆策略.结果获得了552个EST序列和487个电子延伸序列,其中104个EST序列在延伸前未表现同源性,而延伸后表现出有意义的同源性;获得了日本血吸虫基因表达谱的信息以及发现了有潜在药物和疫苗价值的新基因序列.结论本研究为日本血吸虫基因表达谱的研究提供更有效的研究思路.
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单眼视网膜摘除鸽视盖差异表达基因的筛选
目的筛选单眼剥夺鸽视盖差异表达的基因. 方法采用抑制消减杂交技术构建左侧视网膜剥夺后左视盖基因差异表达的文库,对部分重组克隆进行序列分析,反Northern进一步去除假阳性. 结果随机测序150个表达序列标签,16个表达序列标签经反Northern证实为真阳性,包括与基因库已知基因同源的及未发现明确的同源序列,138个基因片段已申请序列号. 结论视盖差异表达基因的研究为深入研究视觉发育、视中枢的分子构筑提供有益的线索.
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多头带绦虫脑多头蚴cDNA表达文库的构建及初步分析
从甘肃景泰羊源脑多头蚴原头节提取总RNA,以Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,利用Lambda ZAP II XR文库构建试剂盒构建了脑多头蚴cDNA表达文库.从构建的原始文库随机挑选单个噬菌斑进行PCR,确定文库重组率和插入外源基因片段大小,鉴定文库质量.结果表明脑多头蚴cDNA表达文库的原始库容量为1.0×106 pfu,扩增后文库滴度为1.6×109 pfu/mL.随机挑选的165个噬菌斑克隆中,0.25 kb以上的克隆155个,重组率为93.9%,对其中0.5 kb以上的115个克隆测序共获得104个表达序列标签(EST),分析后得到96个单一EST序列(Unique EST),其中20个EST与绦虫基因有同源性,38个EST与吸虫基因有同源性,4个EST与线虫基因有同源性,17个EST与其他物种有同源性,其余17个EST没有同源基因.这些EST编码的氨基酸序列有多头带绦虫六钩蚴Tm16抗原、猪带绦虫副肌球蛋白、猪带绦虫免疫原蛋白Ts76等绦虫抗原的同源蛋白以及烯醇化酶等一些酶类、热休克蛋白、肌动蛋白、核糖体蛋白等同源蛋白.
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淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4E2r6基因的克隆与生物信息学分析
目的从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫扩增并分析CYP4E2r6基因,为蚊虫抗药性的研究、检测和防治筛选靶标. 方法根据已扩增的CYP4E2r6基因片段(长470 bp,GenBank登录号为CB074945)的序列设计2条特异引物,从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫提取RNA,反转录成Cdna,以Cdna为模板,用5'-RACE和3'-RACE方法,各获得722 bp、617 bp片段.进行序列拼接并对所得新基因进行登录和生物信息学分析. 结果获得了1条3'端含polyA尾,长1 025 bp的CYP4E2r6基因大片段(GenBank登录号为AY309972),编码289个氨基酸,与果蝇细胞色素P450氨基酸的同源性为55%.编码蛋白的理论分子质量单位为32.9 ku,等电点为5.8. 结论获得了CYP4E2r6基因大片段,为进一步获取全长基因并研究该基因的功能奠定了基础.
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日本血吸虫SjBT基因的获得与生物信息学分析
目的从日本血吸虫(Schistosoma japonicum, Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新基因,为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗. 方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库,用序列标签法随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行步移法测序获取其全长cDNA,并进行生物信息学分析和登录. 结果获得了1个日本血吸虫新基因,全长1 439 bp,编码443个氨基酸,与肝片形吸虫微管蛋白基因具有79%的同源性.编码蛋白的理论分子质量为7.219 8 ku,等电点为9.12;抗原表位可能位于cDNA序列373～396处. 结论表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术有利于发现日本血吸虫新基因.
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HeLa细胞感染痢疾杆菌前后差异表达的新EST序列的电子延伸及验证
目的:研究痢疾杆菌福氏2a入侵前和入侵后3 h的人上皮细胞差异表达的新基因.方法:采用增毒的痢疾杆菌福氏2a 2457T侵袭HeLa细胞,检查HeLa细胞中细菌的数量并用RT-PCR方法从HeLa细胞中提取总RNA,制备探针.采用含有约3000个代表新基因的芯片进行芯片杂交,分析杂交结果.将所获得的新的156条EST序列为种子序列用cDNA微阵列实验,以人类EST数据库为基础库,应用SiClone软件进行EST拼接、校对并尽可能延长获得大片段或全长cDNA.选取基因组未注释的编码区序列作为新基因进行RT-PCR实验验证.结果:共鉴定到≥3倍或≤0.33的差异表达的代表新基因的EST序列45条,其中25个延伸序列鉴定为与重要的肠道功能相关的已知基因,并有3个在痢疾杆菌侵袭期间高表达的存在显著差异的新EST序列,他们分别名为:NPCCKHl2、ADBCSB02和HTBAMG05,这3个基因是新的人基因或假基因.结论:鉴定出了在HeLa细胞感染痢疾杆菌前后差异表达的新EST序列,为进一步研究痢疾杆菌与寄主相互作用奠定了基础.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP5的克隆
目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白5A(HCV NS5A)反式激活新型靶基因.方法:以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRRNA并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为1 191个核苷酸(nt),编码产物由396个氨基酸残基(aa)组成.命名为NS5ATP5,在GenBank中注册,注册号为AF529366.结论:HCV NS5A反式激活新型靶基因NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP7的克隆
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因.方法:以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行SSH分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP7,在GenBank中注册,注册号为AF529368.结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为894个核苷酸(nt),编码产物由297个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV NS5A反式激活新型靶基因NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因6的克隆和鉴定
目的:乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)是一种具有反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索HBxAg蛋白反式激活作用的新的靶基因,利用抑制性消减杂交(SSH)技术对于表达和不表达HBxAg蛋白的HepG2细胞进行研究,以期发现HBxAg蛋白反式激活作用的新靶点,为阐明HBxAg蛋白的反式激活作用分子生物学机制,以及HBV相关的肝细胞癌(HCC)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向.方法:以HBxAg表达质粒pcDNA3.1(-)-HBxAg转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,克隆、鉴定新型基因.结果:在16种HBxAg蛋白上调的靶基因中,其中包括未知功能基因,利用生物信息学技术,获得HBxAg蛋白反式激活作用的新型靶基因,开放读码框架(ORF)长度为237个核苷酸(nt),编码产物由78个氨基酸残基(aa)组成,命名为XTP6,在GenBank中注册,注册号为AF490255.结论:HBxAg蛋白是一种具有反式激活作用的蛋白,应用抑制性消减杂交技术成功筛选与克隆HBxAg蛋白反式激活新型靶基因XTP6,为进一步阐明HBxAg蛋白反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因5的克隆
目的:为了阐明乙型肝炎病毒(HBV)感染相关疾病的发病机制,筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白HBx反式激活新型靶基因.方法:以HBV X蛋白(HBx)表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行SSH分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,确定新型基因序列并命名为XTP5.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列.结果:XTP5基因的编码基因序列全长为1527个核苷酸(nt),编码产物由508个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBx是一种由病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白.应用SSH技术发现了HBx反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为阐明HBx蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向.
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肝癌相关cDNA片段的快速克隆和表达
目的:克隆原发性肝癌相关新基因.方法:利用抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH)已经发现了1条新的肝癌相关基因片断表达序列标签(EST),长447 bp,经Genebank检索,90%无同源性.在其保守序列区设计了2条用于3'Race扩增的寡聚核苷酸引物(3'GSP2:5'-CGCATAGTACCAGTATCGAC AAAGG-3',3'NGSP2:5'-TCCACATTACGGACC CGACGGATT-3'),利用cDNA末端快速扩增法(RACE)进一步克隆该基因的全长cDNA序列.人原发性肝癌细胞株HepG2,体外传代培养,培养基为RPMI1640培养基.提取HepG2总RNA,方法参照SV Total RNAIsolation System 的说明进行.RACE法扩增采用Clontech公司的Smart TM Race cDNA Amplification Kit.将3'RACE-PCR扩增的目的片段以Race自带的产物纯化试剂盒进行纯化、回收,然后将其克隆到PMD18-T Vector中,提纯质粒后进行酶切鉴定,确认质粒内有插入片段,由宝生物工程(大连)有限公司协助完成测序,将克隆所得cDNA片段用NCBI提供的BLASTN与GeneBank与dbEST、 nr数据库进行同源性比较,确认代表新基因的EST并且登录GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.GOV/submission).3便病理标本取自西南医院肝胆科,病理证实均为原发性肝细胞肝癌,分别提取肝癌及远端正常肝组织总RNA.将酶切回收的克隆插入片段分别进行同位素标记获得cDNA探针,利用Clontech公司的 ExpressHYBTM杂交液通过RNA印记法检测克隆片段在肝癌及正常肝组织中的表达,方法参照ExpressHYBTM Hybridization Solution user manual说明进行.同时,利用一联网的基因表达分析序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE(series analysis of gene expression,SAGE)对基因的表达及其表达水平进行分析,从而确定其组织分布.结果:得到5条3'EST(694 447-3,724 447-3,697 447-3,711 447-3 692 447-3;大小500-550bp),5条3'EST均为登录GenBank(登录号:CK730344,CK730345,CK730346,CK730347,CK730348).对其中2条带有poly-A尾的3'EST(694 447-3 724 447-3)进行序列分析后,发现他们是代表新基因或不同剪接体的EST,且具有共同的保守序列.RNA印记分析显示694 447-3,724 447-3在3例肝癌组织中的表害强度时显高于对应的正常组织.通过SAGE文库分析基因的表达谱,发现694 447-3和724 447-3在神经系统肿瘤、结肠癌、胃癌、乳腺癌肿瘤文库的表达高于对应的政党组织文库.结论:克隆所得的2条带有poly-A尾的3'EST可能是新的肝癌多期因家庭成员.利用RACE技术可以快速、高效的克隆疾病相关基因.
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8～10周龄胎儿心脏cDNA文库大规模表达序列标签分析
目的:研究心脏发育过程中基因表达特点.方法:随机选择8～10周龄胎儿心脏互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库的克隆进行表达序列标签(EST)测序,结果与基因库/欧洲分子生物学实验室/日本脱氧核糖核酸数据库(GenBank/EMBL/DDBJ)进行同源性比较,所获EST进行功能分类,并比较其与10～12周龄胎儿及成人心脏表达基因功能分类的不同.结果:2 338条EST中,1 614条69.03%与已知基因匹配,547条(23.4%)与其它EST或基因组DNA相似,177条(7.57%)是新EST.发现了不同心脏发育时期中基因表达的特点.结论:大规模EST分析是系统研究心血管系统不同发育时期基因表达特点的有力工具.
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成人动脉和心脏cDNA文库的构建及新全长cDNAs的克隆
目的:构建成人动脉和心脏互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库,克隆多个新的全长互补脱氧核糖核酸(cDNAs).方法:应用成人动脉和心脏组织,采用Stratagene的建库试剂盒构建cDNA文库.将随机克隆5'端表达序列标签序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较,新的全长cDNAs采用步移法完成全序列测定获得.结果:所建动脉cDNA文库包含2.4×106个独立重组克隆,插入片段平均长度为2.0 kb;心脏cDNA文库包含1.0×106个独立重组克隆,平均长度为1.8 kb.首批得到了8条新的全长cDNAs,已在GenBank登记注册.结论:构建符合要求的cDNA文库是克隆新的全长cDNAs的一条快速有效的途径.
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基因探针与表达序列标签微阵列技术在心血管疾病分子研究中的应用
DNA微阵列(DNA microarray)是近20年来发展起来的一项多学科交叉、应用杂交原理进行分子分析的生物检测技术.虽然历史较短,但在生命科学的诸多领域已显示出巨大的潜力和诱人的前景[1,2].
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基因芯片技术在某些恶性淋巴瘤研究中的应用
基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列,是将大量DNA序列有序地固定在固体介质上.DNA芯片和微阵列的概念由美国Fodor等提出.此技术突出的特点是快速、并行、多样自动地检测大量基因、基因的表达序列标签(EST)或抗原等.现就基因芯片技术在恶性淋巴瘤(ML)研究中的应用进行简要综述.
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染色体显微切割技术的研究进展及应用(综述)
人类及许多高等动植物的基因序列分析研究,随着高度多态的DNA遗传标记的丰富和应用,取得很大的进步,但基因图中遗传标记分布不均,基因组的遗传图谱和物理图谱分辨率不高,染色体特定区域遗传标记密度不高,无法建立高精度基因图,需要一种新的方法探索新的标记,获得染色体区带特异性的序列标签位点(STS)及表达序列标签(EST)构建克隆连锁群,分阶段有序地完成特异区带全序列分析,染色体显微切割技术在此方面显示出特有的优越性.自八十年代初首次应用以来,显微切割技术通过不断的与其他分子生物学技术相结合,已在人类及动植物的病理研究,文库构建,基因定位,克隆等领域广泛应用,并取得瞩目的成绩.
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表达序列标签拼接及验证研究进展
后基因组时代已经来临,基因组序列注释是其主要目标之一.本文就查找EST同源序列方法、各类拼接软件优缺点、现有转录组数据库和预测的蛋白质组数据库、全长cDNA判断方法及ORF选择等方面进行综述,并讨论基因预测方面的困难和不足及任务的长期性.
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药用植物丹参EST-SSR标记的鉴定
对重要大宗药用植物丹参尚没有高效特异分子标记开发应用研究,为有效利用丹参现有EST资源开发功能性分子标记,本文以生物信息学方法对GenBank的dbEST数据库中公开的10 288条丹参(Salvia miltiorrhiza)EST进行整理,共获得非冗余性EST 4 192条.从中搜索到159个SSR位点,出现频率为3.79%,平均相隔12.74 kb出现1个SSR位点.在1 bp～6 bp核苷酸重复基序中,二核苷酸重复基序SSR出现频率高(77个、48.43%),其次是三核苷酸(41个、25.79%),四核苷酸出现频率低(6个,3.77%).在检出的47类重复基序中,出现频率超过5%的6种重复基序依次为:GA/CT(16.35%)、AG/TC(15.09%)、TCA/AGT(10.69%)、AT/TA(6.29%)、GAAAAG/CAAAAC(6.29%)、TA/AT(5.03%).针对这些序列,设计开发了83对EST-SSR引物,对13个不同居群丹参样品及10种鼠尾草属物种进行了扩增效率、多态性及通用性检测.发现其中72对引物在供试材料中可进行特异性扩增,共产生279个位点,平均每对引物产生3.88个位点,且所有引物均显示多态性扩增.可有效扩增引物在鼠尾10个异源物种中的可转移率为60%～100%,平均85%.依据扩增结果进行遗传相似性分析,结果表明EST-SSR分析可揭示供试样品不同水平的遗传多样性,并可明确区分丹参及其他同属植物.上述工作为进行丹参及其同属物种的基因组差异性分析、遗传图谱构建及比较基因组等研究奠定了基础.
