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PC12细胞硫氧还蛋白cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达
硫氧还蛋白(Thioredoxin, TRX)是广泛存在于原核和真核细胞中的低分子量蛋白质,它含有保守的Cys-Gly-Pro-Cys活性位点,作为多效性细胞因子而具有重要的生物学功能.从PC12细胞中提取总RNA,经逆转录PCR(RT-PCR)扩增出硫氧还蛋白cDNA并克隆到PUC18质粒上.序列分析表明,克隆所得序列与GenBank中大鼠硫氧还蛋白cDNA序列完全一致.将该基因亚克隆到表达质粒pQE30上,质粒pQE30-TRX在大肠杆菌M15中获得高效表达.带6His的融合蛋白约占总菌体蛋白的30%.分析鉴定表明,纯化的融合蛋白质分子量是14kD,且具有二硫键还原酶活性.
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金葡菌野生株SEB基因的亚克隆及其原核表达
目的 亚克隆金葡菌野生株S407030肠毒素B(SEB)基因,并在大肠埃希菌(E.coli)中表达,以获得重组SEB(Rseb)蛋白.方法 将含有SEB基因的质粒Pmd-18T/SEB双酶切获得目的片段,插入表达载体Pgex-4T-2中构建重组子Pgex-4T-2/SEB,并转化E.coli JM109感受态菌,阳性克隆以双酶切和PCR法鉴定;含重组质粒的工程菌以IPTG诱导表达Rseb蛋白;表达产物进行SDS-PAGE分析,并采用B-PER GST融合蛋白试剂盒纯化重组Rseb,Western blot鉴定其免疫反应性.结果 重组质粒经双酶切和PCR扩增鉴定均获得约705 bp的基因片段,与预期结果相一致;诱导表达的含GST的融合重组Rseb蛋白分子质量单位约为53 ku,纯化后作SDS-PAGE电泳显示一条蛋白带,Western blot显示Rseb能够被兔抗SEB抗体识别.结论 金葡菌野生株SEB在大肠埃希氏菌中得到有效表达,并获得电泳级纯度的重组Rseb,重组蛋白具有一定的免疫活性,为进一步研究其生物毒性与开发诊断试剂提供了生物材料.
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肺炎衣原体Mr 53×103蛋白全基因克隆和表达
肺炎衣原体是1989年确立的衣原体属新种，相对分子质量（Mr）为53×103的蛋白是高度保守的肺炎衣原体主要的种特异性抗原〔1〕，位于病原体表面，其全基因含1*!482个碱基对，推测编码493个氨基酸。Mr 53×103蛋白与肺炎衣原体慢性感染有关，可能用作感染慢性化的标志〔2〕；抗Mr 53×103单抗能中和肺炎衣原体的感染〔3〕，表明Mr 53×103蛋白还是一个理想的预防肺炎衣原体感染的分子疫苗候选者。本实验克隆和表达了肺炎衣原体Mr 53×103蛋白的全长基因，为进一步研究该蛋白是否参与肺炎衣原体毒力因子的构成，以及其在肺炎衣原体感染检测上的意义和能否作为预防肺炎衣原体感染的分子疫苗等打下基础。
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幽门螺杆菌粘附素基因babA2的克隆及免疫应答的初步研究
目前,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)疫苗的研制仍处在抗原的筛选阶段,已经评价的基因重组抗原基本上是着眼于阻断Hp的毒力因素,而与Hp定植密切相关的粘附素评价较少.babA是迄今为止唯一明确受体的Hp粘附素,研究表明babA基因存在两个等位基因:babA1和babA2,其中只有babA2具备与Leb结合的功能[1].本实验对babA2基因进行了克隆和表达并研究了其免疫反应.
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中国人金属基质蛋白酶组织抑制因子-1基因的克隆与表达
目的:克隆和表达中国人金属基质蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1;ⅡMP-1)基因,获得具有抗原性的人TIMP-1蛋白.方法:用RT-nest-PCR扩增TIMP-1编码区基因片段,用基因重组技术构建含该片段的重组质粒并进行序列分析.在大肠杆菌E.coli中表达融合蛋白MBP-TIMP-1,用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行分析鉴定,并用亲和层析试剂盒纯化融合蛋白MBP-TIMP-1.结果:经核苷酸序列分析表明,本研究克隆的中国人TIMP-1为624bp,与报道的国外TIMP-1基因序列同源.经SDS-PAGE和Western blot表明,表达的融合蛋白MBP-TIMP-1分子质量为66Ku,具有TIMP-1的抗原性,并可进行亲和层析纯化.结论:克隆了中国人TIMP-1基因,表达和纯化了具有免疫原性的融合蛋白MBP-TIMP-1,他将对肝纤维化的诊断有一定作用.
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肝癌相关cDNA片段的快速克隆和表达
目的:克隆原发性肝癌相关新基因.方法:利用抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH)已经发现了1条新的肝癌相关基因片断表达序列标签(EST),长447 bp,经Genebank检索,90%无同源性.在其保守序列区设计了2条用于3'Race扩增的寡聚核苷酸引物(3'GSP2:5'-CGCATAGTACCAGTATCGAC AAAGG-3',3'NGSP2:5'-TCCACATTACGGACC CGACGGATT-3'),利用cDNA末端快速扩增法(RACE)进一步克隆该基因的全长cDNA序列.人原发性肝癌细胞株HepG2,体外传代培养,培养基为RPMI1640培养基.提取HepG2总RNA,方法参照SV Total RNAIsolation System 的说明进行.RACE法扩增采用Clontech公司的Smart TM Race cDNA Amplification Kit.将3'RACE-PCR扩增的目的片段以Race自带的产物纯化试剂盒进行纯化、回收,然后将其克隆到PMD18-T Vector中,提纯质粒后进行酶切鉴定,确认质粒内有插入片段,由宝生物工程(大连)有限公司协助完成测序,将克隆所得cDNA片段用NCBI提供的BLASTN与GeneBank与dbEST、 nr数据库进行同源性比较,确认代表新基因的EST并且登录GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.GOV/submission).3便病理标本取自西南医院肝胆科,病理证实均为原发性肝细胞肝癌,分别提取肝癌及远端正常肝组织总RNA.将酶切回收的克隆插入片段分别进行同位素标记获得cDNA探针,利用Clontech公司的 ExpressHYBTM杂交液通过RNA印记法检测克隆片段在肝癌及正常肝组织中的表达,方法参照ExpressHYBTM Hybridization Solution user manual说明进行.同时,利用一联网的基因表达分析序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE(series analysis of gene expression,SAGE)对基因的表达及其表达水平进行分析,从而确定其组织分布.结果:得到5条3'EST(694 447-3,724 447-3,697 447-3,711 447-3 692 447-3;大小500-550bp),5条3'EST均为登录GenBank(登录号:CK730344,CK730345,CK730346,CK730347,CK730348).对其中2条带有poly-A尾的3'EST(694 447-3 724 447-3)进行序列分析后,发现他们是代表新基因或不同剪接体的EST,且具有共同的保守序列.RNA印记分析显示694 447-3,724 447-3在3例肝癌组织中的表害强度时显高于对应的正常组织.通过SAGE文库分析基因的表达谱,发现694 447-3和724 447-3在神经系统肿瘤、结肠癌、胃癌、乳腺癌肿瘤文库的表达高于对应的政党组织文库.结论:克隆所得的2条带有poly-A尾的3'EST可能是新的肝癌多期因家庭成员.利用RACE技术可以快速、高效的克隆疾病相关基因.
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田鼠巴贝虫候选诊断抗原的表达和评价
目的 克隆、表达田鼠巴贝虫(Babesiamicroti)候选诊断抗原,评价其潜在的诊断价值. 方法 目的基因来自本室前期构建的田鼠巴贝虫cDNA文库,分别是Bm2、Bm4、Bm6、Bm9和Bm15,用生物信息学分析软件对编码其ORF的氨基酸序列进行预测和分析.从阳性克隆的pBluscript重组质粒中PCR扩增目的基因.将扩增产物连接至pET28a质粒,构建重组质粒并转化至大肠埃希菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)感受态细胞中,用终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行蛋白表达和可溶性分析.对包涵体表达的蛋白,采用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒对目的蛋白进行纯化.用田鼠巴贝虫感染小鼠血清和疟疾患者血清对纯化的重组蛋白进行ELISA分析,评价各重组抗原的敏感性和特异性. 结果 5个候选抗原Bm2、Bm4、Bm6、Bm9和Bm15基因经PCR扩增,大小分别约为480、300、750、200和700 bp,与理论值相符.构建的重组质粒经测序鉴定与cDNA文库筛选的阳性克隆的ORF序列一致.Bm4、Bm6和Bm15质粒经IPTG诱导,获得包涵体表达,相对分子质量(Mr)分别为13 000、30 000和30 000.但Bm2和Bm9未能表达成功.3个重组蛋白Bm4、Bm6和Bm15纯化后,经SDS-PAGE电泳分析,获得了单一条带的目的重组蛋白.使用田鼠巴贝虫感染小鼠血清和健康小鼠血清对Bm4、Bm6、Bm 15和BmSA1(参照)重组蛋白的ELISA分析结果显示,重组蛋白Bm4、Bm6、Bm15及BmSA1的敏感性分别为15.0％、55.0％、80.0％、100.0％,特异性分别为100.0％、100.0％、90.0％、100.0％.Bm4、Bm6及Bm15与疟疾患者血清无交叉反应,BmSA1与疟疾患者血清有一定的交叉反应(假阳性率为13.3％). 结论 表达了3个田鼠巴贝虫候选诊断抗原,初步评价发现Bm15抗原对检测田鼠巴贝虫具有良好的敏感性和特异性.
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柔红霉素C-14羟化酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达
将柔红霉素C-14羟化酶基因与酪氨酸酶基因启动子和红霉素抗性基因启动子串联连接,克隆到变铅青链霉菌TK24中进行表达.经过SDS-PAGE蛋白电泳、CO结合差光谱分析结果证明,重组克隆表达的羟化酶分子量约45kD、重组的蛋白量约占细胞总蛋白的12%,并具有细胞色素P-450的特征.
关键词： 柔红霉素C-14羟化酶基因 克隆和表达 变铅青链霉菌TK24 -
肺炎链球菌自溶素基因的克隆、表达及蛋白纯化
目的 克隆肺炎链球菌自溶素(LytA)基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化.方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a(+),构建pET32a(+)-LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,亲和层析法纯化目的 蛋白,将获得的蛋白用Western blot 鉴定.结果 扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+)-LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白.结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础.
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米曲霉乳糖酶在毕赤酵母中的高效表达
成功将米曲霉(Aspergillus oryzae)乳糖酶基因(lac gene)克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体中,实现该乳糖酶的有效分泌和高效表达.以米曲霉cDNA文库为模板,通过PCR扩增得到米曲霉乳糖酶基因.将含有该米曲霉乳糖酶基因的表达载体pGAPZαA-lac以电转化方式转入到毕赤酵母表达系统,获得高效表达米曲霉乳糖酶的重组菌株GalC131.该工程菌株在YPD培养基中发酵72 h,发酵液中目的蛋白含量高,乳糖水解酶活达到530 U/mL,并且此工程菌株分泌表达的目的蛋白易于纯化,有利于工业化应用.
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马链球菌兽疫亚种中国株的类M蛋白基因抗原表位片段的克隆与表达
目的构建马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)中国株的类M蛋白基因抗原表位片段的重组表达质粒(pET-Szp),并检测表达产物的免疫反应性.方法根据GenBank登录的马链球菌兽疫亚种纽约分离株w60类M蛋白基因序列设计和合成引物,以该菌中国分离株ATCC35246的基因组DNA为模板,扩增类M蛋白基因5'端第583～1068bp片段,并按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21株,用IPTG诱导表达,并通过SDS-PAGE和免疫印迹对表达蛋白进行初步分析.结果扩增出486bp的马链球菌兽疫亚种ATCC35246的类M蛋白基因片段,该基因在大肠杆菌表达系统中经诱导,得到分子量为50 000的表达产物,免疫印迹表明该产物具有特异的免疫反应性.结论成功构建了表达马链球菌兽疫亚种中国株类M蛋白片段的重组表达质粒,并实现在大肠杆菌中表达,为重组类M蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础.
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钩端螺旋体溶血素基因的鉴定
对钩端螺旋体诠释的溶血素基因进行确认和分类.利用生物信息学预测的方法,对钩端螺旋体诠释的溶血素基因进行分类并对其进行克隆和表达,通过体外溶血实验验证其溶血活性.并且,使用TLC和HPLC法检测了预测的鞘磷脂酶类溶血素基因的水解鞘磷脂的性质.所有钩端螺旋体诠释溶血素基因可分为:鞘磷脂酶类和非鞘磷脂类.其中8个证实它们确实具有溶血活性.并且,通过TLC和HPLC法证实了利用生物信息学预测的4个鞘磷脂酶类溶血素确实具有水解鞘磷脂的活性.钩端螺旋体基因组中至少含有9个溶血素基因.
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日本血吸虫thioredoxin基因的克隆和表达
目的结合分子生物学和生物信息学方法筛选鉴定日本血吸虫新基因.方法从日本血吸虫(Schistosoma japonicum,大陆株)成虫cDNA文库中获取表达序列标签(expressed sequence tag,EST),用电子拼接的方法延伸序列,用NCBI提供的BLASTx程序和Genbank数据库进行同源性分析以筛选基因;设计特异性引物从日本血吸虫成虫mRNA中扩增筛选基因并预测和分析;扩增产物克隆到原核表达载体并表达.结果筛选出日本血吸虫Thioredoxin全长基因并对其进行了序列分析,克隆全长cDNA至PET原核载体并表达成功.结论结合EST、电子延伸和传统的分子生物学方法是高效筛选S.japonicum功能基因的有效策略.
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纤溶酶抑制剂textilinin-1在毕氏酵母的表达及应用
目的：研究真核表达的textilinin-1蛋白纯化品对纤溶酶抑制作用。方法根据textilinin-1的天然氨基酸序列，按照毕氏酵母偏好密码子进行优化，合成 textilinin-1基因，重组到pPICZα载体上，并转化至 Pichia p.X-33菌种中，实现高效分泌表达，并进行重组 textilinin-1活力单位的定义及小鼠断尾试验。结果通过高密度发酵及两步柱层析纯化，终从10 L发酵液中得到6 g纯度达97.0％以上的重组textilinin-1。活性研究表明，重组 textilinin-1对纤溶酶的活性具有抑制作用，并对 tPA 所致的小鼠出血倾向有一定的抑制作用。结论重组 textilinin-1可抑制纤溶酶活性，并对纤溶性出血小鼠模型有止血作用，具有开发为止血药的潜力。
关键词： textilinin-1巴斯德毕赤酵母 克隆和表达 偏好密码子 止血药 -
定点突变巴曲酶在毕赤酵母中的克隆与表达
目的 为避免毕赤酵母分泌的Kex2蛋白酶对发酵液中所表达的巴曲酶的降解.利用重叠PCR方法对巴曲酶基因进行定点突变,将巴曲酶基因第45位的Arg突变为Lys.方法 将突变后的基因克隆到酵母分泌型表达载体pPICZαA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入巴斯德毕赤酵母细胞,筛选鉴定转化子,经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的定点突变巴曲酶,经SDS-PAG电泳、免疫印迹确定其分子量为32 kD.结果发酵罐的表达量达到52 KU/ml发酵液,较重组天然巴曲酶的表达量提高了73.3%.结论 定点突变巴曲酶的表达量比重组天然巴曲酶的表达量有显著提高,表达的突变巴曲酶同样具有凝血活性.
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弓形虫表面抗原SAG2重组蛋白的表达及纯化
目的 在大肠埃希氏菌(E.c oli中表达弓形虫表面抗原2(SAG2),纯化制备重组蛋白rSAG2.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术从弓形虫基因组中扩增出SAG2编码基因片段,以pMD-18T质粒作TA克隆,序列测定后亚克隆入表达载体pGEX-4T-2,并转化E.coli JM109感受态菌,IPTG诱导表达rSAG2蛋白,重组rSAG2蛋白采用B-PER谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白纯化试剂盒纯化并进行SDS-PAGE与免疫印迹(Western-blot)鉴定.结果 SAG2编码基因扩增片段大小为469 bp;测序结果显示,克隆的SAG2基因序列与GenBank中弓形虫RH株的同源序列(序列号GI:161925)完全一致;所诱导表达的含GST的融合rSAG2蛋白大小约43kDa,纯化后的rSAG2经SDS-PAGE电泳显示一条纯化条带;蛋白免疫印迹结果显示rSAG2能够被兔弓形虫感染血清所识别.结论 在大肠埃希氏菌中融合表达了弓形虫SAG2重组蛋白,纯化的rSAG2蛋白具有一定的免疫活性.
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Survivin与基因治疗
Survivin是1997年发现的凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族的一个新成员,由于其独特的生物学结构,特殊的组织分布及明显的抗凋亡作用,目前越来越受到重视.基因治疗是指以DNA重组,基因转移,基因克隆和表达等技术,将遗传物质转入机体细胞,以达到治疗的目的,其关键是目的基因(靶基因)的选择.本文所涉及的survivin是肿瘤基因治疗的新靶点,现将survivin的功能及与肿瘤的关系及其在肿瘤基因治疗中的作用作一综述.
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干扰素a-1b治疗尖锐湿疣疗效观察
基因工程干扰素a-1b注射剂，是世界上首例采用中国健康人白细胞来源的干扰素基因克隆和表达的基因工程药物。商品名赛若金，由中美合资深圳科兴生物制品有限公司生产。
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人白细胞介素23受体基因的克隆和原核表达
目的:从外周血单个核细胞(PBMC)中克隆人白细胞介素23受体(hIL-23R)编码区序列,构建原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达.方法:分离人外周血单个核细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,应用RT-PCR技术,以PBMC的cDNA为模版,扩增出hIL-23R的编码区(1890bp),将其克隆至pMD 19-T 载体,经酶切和测序鉴定后,亚克隆于pGEX-4T-1中构建原核表达载体pGEX-4T-1-hIL-23R,转化大肠杆菌感受态细胞BL-21(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白,经Western-blot对融合蛋白进行鉴定.结果:获得了hIL-23R编码区序列,构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达,表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,其相对分子质量Mr为97KDa.结论:成功构建hIL-23R原核表达载体并在大肠杆菌中表达hIL-23R融合蛋白.
关键词： 白细胞介素23受体(IL-23R) 克隆和表达 融合蛋白 -
马冠状病毒核衣壳蛋白基因片段的克隆及其表达
根据NCBI发表ECV核衣壳基因序列,用PCR方法扩增出ECV核衣壳基因片段,插入表达型载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-ECV-N.以IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE凝胶电泳分析,结果成功表达了42KD GST-ECV-N融合蛋白.将ECV-N从pGEX-ECV-N载体亚克隆到的杆状病毒转移载体pFastBac1,筛选出重组转移载体pFastBac-ECV-N,在DH1O细菌的转座子作用下,构建重组穿梭质粒Bacmid-ECV-N.提取正确重组的穿梭质粒DNA转染Sf9昆虫细胞,结果获得了重组杆状病毒rBac-ECV-N.PCR和间接免疫荧光试验结果证明,ECV-N在Sf9细胞中得到了很好的表达.该结果对我国马群中冠状病毒感染的流行病学调查及深入研究有指导意义.
